薛 爽，龔騰芳，賀峻琳，陳叔玉，劉 偉

(1. 長(zhǎng)沙市動(dòng)植物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長(zhǎng)沙 410000 ； 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

蛔蟲隸屬于線蟲綱，蛔目，蛔科，是一種常見的腸道寄生線蟲[1]。豬感染蛔蟲后可引起消瘦、貧血、腹瀉、精神沉郁、生長(zhǎng)不良等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可阻塞腸道引起仔豬死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

僅通過形態(tài)難以區(qū)分豬蛔蟲和人蛔蟲。研究表明，人蛔蟲可感染豬，豬蛔蟲也可感染人，并且有報(bào)道表明人蛔蟲和豬蛔蟲之間可以雜交，長(zhǎng)期以來這2個(gè)物種是否為同一物種一直存在爭(zhēng)議[4-6]。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，分子診斷技術(shù)可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定的不足和缺點(diǎn)，更適合相似物種的精確鑒定。近年來，越來越多的學(xué)者使用全基因組或單個(gè)保守基因序列研究蛔蟲的種系遺傳結(jié)構(gòu)。Betson等利用線粒體cox1基因和一組微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)來自歐洲、非洲、亞洲和拉丁美洲的410條蛔蟲樣品進(jìn)行了基因分型，發(fā)現(xiàn)不同國家、村莊和宿主的寄生蟲種群之間存在顯著的遺傳分化[7]。Zhou等選用核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記首次表明了人型蛔蟲和豬型蛔蟲雜交體可以感染豬和人類[8]。

野豬作為我國的保護(hù)動(dòng)物，是生態(tài)鏈中重要的一環(huán)?；紫x寄生會(huì)影響野豬生長(zhǎng)發(fā)育甚至造成野豬死亡，同時(shí)隨著野豬的活動(dòng)可將蛔蟲卵排入環(huán)境中，導(dǎo)致其他動(dòng)物甚至人的感染，造成嚴(yán)重危害[9-10]。為了探究野豬體內(nèi)蛔蟲與其他蛔蟲的種群遺傳關(guān)系，本試驗(yàn)對(duì)湖南省長(zhǎng)沙市瀏陽野豬腸道內(nèi)蛔蟲的線粒體部分cox1基因(pcox1)、部分nad5基因(pnad5)和ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，對(duì)序列進(jìn)行分析以確定野豬源蛔蟲與其他蛔蟲的物種關(guān)系，為野豬源蛔蟲防控研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣本 本試驗(yàn)的樣品分別采自湖南省長(zhǎng)沙市瀏陽市某養(yǎng)殖場(chǎng)病死的2頭野豬，其中4條雄蛔蟲和5條雌蛔蟲，分別編號(hào)為CS1～CS4(雄蛔蟲)和CS5～CS9(雌蛔蟲)，參照資料對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定后，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶和PCR試劑，均購自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白酶K，購自Merck公司；3對(duì)引物由北京擎科生物有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增 參照參考文獻(xiàn)[11-13]設(shè)計(jì)合成3對(duì)引物，見表1。3個(gè)基因的擴(kuò)增體系均為25 μL:TaqPCR Master Mix 12.5 μL、上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s(pcox1、pnad5)或40 s(ITS)；50 ℃(pcox1、ITS)或55 ℃(pnad5)退火30 s；72 ℃延伸30 s(pcox1)、1 min(pnad5)、5 min(ITS)，共38個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min(pcox1、pnad5)或10 min(ITS)。

表1 3段基因擴(kuò)增的引物

1.4 基因測(cè)序及分析 PCR陽性產(chǎn)物由北京擎科有限公司雙向測(cè)序。用DNAMAN 7.0對(duì)獲得的pcox1、pnad5和ITS基因序列進(jìn)行對(duì)比，剔除和對(duì)齊，并與GenBank收錄的人蛔蟲(Ascarislumbricoides)和豬蛔蟲(Ascarissuum)的pcox1、pnad5和ITS基因進(jìn)行對(duì)比。用DNASTAR 5.0軟件進(jìn)行基因同源性分析；利用DnaSP 5.0軟件計(jì)算基因多樣性；以獅弓蛔蟲(Toxascarisleonina)為外群，選用Kimura-2-parameter模型，用MEGA 7.0構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹(Bootstrap test=1 000)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增 野豬源蛔蟲分離株擴(kuò)增的pcox1、pnad5和ITS基因片段如圖1～3所示，大小分別約為400 、480 bp和900 bp，未見非特異性條帶，空白對(duì)照為陰性。

圖1 野豬源蛔蟲線粒體pcox1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

2.2 基因的多樣性分析 經(jīng)過對(duì)比校正后，9株野豬源蛔蟲分離株pcox1、pnad5和ITS基因片段大小分別為391、491 bp和867 bp;pcox1基因的A+T堿基含量為66.70%～67.00%，C+G堿基含量為33.00%～33.20%；pnad5基因的A+T堿基含量為70.50%～71.10%，C+G堿基含量為28.90%～29.30%；ITS基因的A+T堿基含量為58.90%～60.00%，C+G堿基含量為40.00%～40.10%。

圖2 野豬源蛔蟲線粒體pnad 5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

圖3 野豬源蛔蟲核糖體ITS PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

9株野豬樣品分離株的pcox1堿基差異率為0.00%～0.30%、pnad5為0.00%～0.60%、ITS為0.00%～0.04%。9株野豬樣品分離株線粒體pcox1基因僅有1個(gè)堿基變異位點(diǎn)(位于343 bp處，共391 bp)，為嘧啶之間的堿基替換，只有2種單倍型；9株野豬樣品分離株線粒體pnad5基因有5個(gè)堿基變異位點(diǎn)，主要為嘌呤之間的堿基替換，共有6種單倍型；9株野豬樣品分離株核糖體ITS基因僅有1個(gè)堿基變異位點(diǎn)(位于117 bp處，共867 bp)，為嘧啶之間的堿基替換，只有2種單倍型，見表2。9株野豬樣品分離株擴(kuò)增序列與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的人蛔蟲線粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因序列堿基差異率分別為0.00%～0.30%、1.00%～1.60%和0.00%～0.07%，與豬蛔蟲分離株相應(yīng)序列堿基差異率分別為0.30%～1.80%(pcox1)、1.00%～7.20%(pnad5)和0.70%～1.30% (ITS)。

表2 pcox1、pnad 5和ITS基因序列核苷酸多態(tài)性

2.3 種系發(fā)育分析 基于pcox1、pnad5和ITS基因分別構(gòu)建野豬源蛔蟲系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖4～6所示，野豬源蛔蟲和人蛔蟲分離株均聚合在同一分支上，與豬蛔蟲分離株相隔較近，與獅弓蛔蟲相隔較遠(yuǎn)。

圖4 野豬源蛔蟲pcox1基因系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 野豬源蛔蟲pnad 5基因系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 野豬源蛔蟲ITS基因系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

野豬源蛔蟲的有效鑒定是對(duì)野豬蛔蟲病進(jìn)行預(yù)防的前提，但傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法難以對(duì)形態(tài)相似的蟲株進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。線粒體基因由于相對(duì)保守、母系遺傳等優(yōu)點(diǎn)現(xiàn)已成為寄生蟲分類與鑒定的有力工具[14-15]。本試驗(yàn)擴(kuò)增的9株野豬源蛔蟲線粒體pcox1和ITS基因片段堿基差異率分別為0.00%～0.30%和0.00%～0.04%，其差異主要為堿基互換，表明野豬源蛔蟲pcox1和ITS基因種內(nèi)高度保守， pnad5基因片段堿基差異率為0.00%～0.60%，種內(nèi)相對(duì)保守；與人蛔蟲分離株pcox1、pnad5和ITS基因序列堿基差異率分別為0.00%～0.30%、1.00%～1.60%和0.00%～0.07%，和豬蛔蟲對(duì)應(yīng)的基因序列堿基變異率分別為0.30%～1.80% (pcox1)、1.00%～7.20%(pnad5)和 0.70%～1.30%(ITS)。可見野豬源蛔蟲pcox1、pnad5和ITS基因種內(nèi)變異較小，與人蛔蟲和豬蛔蟲堿基差異率均較小，但與人蛔蟲堿基差異率更小。此外，本試驗(yàn)中9株野豬源蛔蟲分離株pcox1、pnad5和ITS基因序列核苷酸多樣性均低于0.01，結(jié)果表明野豬源蛔蟲pcox1、pnad5和ITS基因遺傳變異程度低。

基于野豬源蛔蟲pcox1、pnad5和ITS基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，本試驗(yàn)分離的9株野豬源蛔蟲樣品均與人蛔蟲聚合為同一分支，然后與豬蛔蟲聚合為一大支，與獅弓蛔蟲相隔較遠(yuǎn)。目前國內(nèi)僅存在通過形態(tài)學(xué)鑒定的野豬感染蛔蟲的案例報(bào)道，且均鑒定為豬蛔蟲[2-3]。本試驗(yàn)首次通過線粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因?qū)σ柏i源蛔蟲進(jìn)行鑒定和遺傳變異分析?；诰€粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因分析結(jié)果表明野豬源蛔蟲和人蛔蟲、豬蛔蟲同源性均很高。

人蛔蟲和豬蛔蟲的分類地位一直存在爭(zhēng)議，研究者試圖從多方面來進(jìn)行比較，但結(jié)果不盡相同[16-17]。鄒勇[13]分別對(duì)豬蛔蟲和人蛔蟲的線粒體pcox1和ITS基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)人蛔蟲和豬蛔蟲pcox1和ITS基因差異較小。吳昌義等[12]發(fā)現(xiàn)，豬蛔蟲和人蛔蟲線粒體pnad5基因差異較小。Easton等[4]報(bào)道，豬蛔蟲和人蛔蟲存在雜交復(fù)合體感染人類，使豬蛔蟲和人蛔蟲分類變得更加復(fù)雜。此外，線粒體基因存在漸滲雜交和基因滲透，也阻礙人蛔蟲與豬蛔蟲的準(zhǔn)確鑒定和分類[15]。值得注意的是，Leles等[18]通過古生物學(xué)和遺傳學(xué)證據(jù)并結(jié)合最新的研究數(shù)據(jù)認(rèn)為，人蛔蟲和豬蛔蟲應(yīng)為同一物種，僅有輕微的表型和基因型適應(yīng)性變化。本試驗(yàn)采集樣品來源和數(shù)目有限，且僅鑒定了3段基因。因此，需要采集更多的野豬源蛔蟲樣品，以及利用不同的鑒定方法(線粒體全基因組、核基因和微衛(wèi)星標(biāo)記等)分析野豬源蛔蟲與人蛔蟲和豬蛔蟲的分類關(guān)系。

綜上所述，本試驗(yàn)利用線粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因序列對(duì)湖南省長(zhǎng)沙市瀏陽市野豬源蛔蟲分離株進(jìn)行種群鑒定和種群遺傳結(jié)構(gòu)研究，結(jié)果顯示野豬源蛔蟲遺傳變異程度低，判斷野豬源蛔蟲為人蛔蟲，需要更多的野豬源蛔蟲樣品和多種鑒定方法進(jìn)一步鑒別。