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        湖南省長(zhǎng)沙市野豬源蛔蟲(chóng)分子鑒定

        2022-08-30 13:30:34龔騰芳賀峻琳陳叔玉
        中國(guó)獸醫(yī)雜志 2022年6期
        關(guān)鍵詞:核糖體蛔蟲(chóng)堿基

        薛 爽,龔騰芳,賀峻琳,陳叔玉,劉 偉

        (1. 長(zhǎng)沙市動(dòng)植物疫病預(yù)防控制中心,湖南 長(zhǎng)沙 410000 ; 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

        蛔蟲(chóng)隸屬于線蟲(chóng)綱,蛔目,蛔科,是一種常見(jiàn)的腸道寄生線蟲(chóng)[1]。豬感染蛔蟲(chóng)后可引起消瘦、貧血、腹瀉、精神沉郁、生長(zhǎng)不良等癥狀,嚴(yán)重時(shí)可阻塞腸道引起仔豬死亡,給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

        僅通過(guò)形態(tài)難以區(qū)分豬蛔蟲(chóng)和人蛔蟲(chóng)。研究表明,人蛔蟲(chóng)可感染豬,豬蛔蟲(chóng)也可感染人,并且有報(bào)道表明人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)之間可以雜交,長(zhǎng)期以來(lái)這2個(gè)物種是否為同一物種一直存在爭(zhēng)議[4-6]。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展,分子診斷技術(shù)可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定的不足和缺點(diǎn),更適合相似物種的精確鑒定。近年來(lái),越來(lái)越多的學(xué)者使用全基因組或單個(gè)保守基因序列研究蛔蟲(chóng)的種系遺傳結(jié)構(gòu)。Betson等利用線粒體cox1基因和一組微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)來(lái)自歐洲、非洲、亞洲和拉丁美洲的410條蛔蟲(chóng)樣品進(jìn)行了基因分型,發(fā)現(xiàn)不同國(guó)家、村莊和宿主的寄生蟲(chóng)種群之間存在顯著的遺傳分化[7]。Zhou等選用核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記首次表明了人型蛔蟲(chóng)和豬型蛔蟲(chóng)雜交體可以感染豬和人類[8]。

        野豬作為我國(guó)的保護(hù)動(dòng)物,是生態(tài)鏈中重要的一環(huán)?;紫x(chóng)寄生會(huì)影響野豬生長(zhǎng)發(fā)育甚至造成野豬死亡,同時(shí)隨著野豬的活動(dòng)可將蛔蟲(chóng)卵排入環(huán)境中,導(dǎo)致其他動(dòng)物甚至人的感染,造成嚴(yán)重危害[9-10]。為了探究野豬體內(nèi)蛔蟲(chóng)與其他蛔蟲(chóng)的種群遺傳關(guān)系,本試驗(yàn)對(duì)湖南省長(zhǎng)沙市瀏陽(yáng)野豬腸道內(nèi)蛔蟲(chóng)的線粒體部分cox1基因(pcox1)、部分nad5基因(pnad5)和ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,對(duì)序列進(jìn)行分析以確定野豬源蛔蟲(chóng)與其他蛔蟲(chóng)的物種關(guān)系,為野豬源蛔蟲(chóng)防控研究提供了科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 蟲(chóng)體樣本 本試驗(yàn)的樣品分別采自湖南省長(zhǎng)沙市瀏陽(yáng)市某養(yǎng)殖場(chǎng)病死的2頭野豬,其中4條雄蛔蟲(chóng)和5條雌蛔蟲(chóng),分別編號(hào)為CS1~CS4(雄蛔蟲(chóng))和CS5~CS9(雌蛔蟲(chóng)),參照資料對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定后,置于-20 ℃冰箱保存。

        1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技有限公司;TaqDNA聚合酶和PCR試劑,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;蛋白酶K,購(gòu)自Merck公司;3對(duì)引物由北京擎科生物有限公司合成。

        1.3 PCR擴(kuò)增 參照參考文獻(xiàn)[11-13]設(shè)計(jì)合成3對(duì)引物,見(jiàn)表1。3個(gè)基因的擴(kuò)增體系均為25 μL:TaqPCR Master Mix 12.5 μL、上、下游引物各0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 10.5 μL。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s(pcox1、pnad5)或40 s(ITS);50 ℃(pcox1、ITS)或55 ℃(pnad5)退火30 s;72 ℃延伸30 s(pcox1)、1 min(pnad5)、5 min(ITS),共38個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min(pcox1、pnad5)或10 min(ITS)。

        表1 3段基因擴(kuò)增的引物

        1.4 基因測(cè)序及分析 PCR陽(yáng)性產(chǎn)物由北京擎科有限公司雙向測(cè)序。用DNAMAN 7.0對(duì)獲得的pcox1、pnad5和ITS基因序列進(jìn)行對(duì)比,剔除和對(duì)齊,并與GenBank收錄的人蛔蟲(chóng)(Ascarislumbricoides)和豬蛔蟲(chóng)(Ascarissuum)的pcox1、pnad5和ITS基因進(jìn)行對(duì)比。用DNASTAR 5.0軟件進(jìn)行基因同源性分析;利用DnaSP 5.0軟件計(jì)算基因多樣性;以獅弓蛔蟲(chóng)(Toxascarisleonina)為外群,選用Kimura-2-parameter模型,用MEGA 7.0構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap test=1 000)。

        2 結(jié)果

        2.1 PCR擴(kuò)增 野豬源蛔蟲(chóng)分離株擴(kuò)增的pcox1、pnad5和ITS基因片段如圖1~3所示,大小分別約為400 、480 bp和900 bp,未見(jiàn)非特異性條帶,空白對(duì)照為陰性。

        圖1 野豬源蛔蟲(chóng)線粒體pcox1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

        2.2 基因的多樣性分析 經(jīng)過(guò)對(duì)比校正后,9株野豬源蛔蟲(chóng)分離株pcox1、pnad5和ITS基因片段大小分別為391、491 bp和867 bp;pcox1基因的A+T堿基含量為66.70%~67.00%,C+G堿基含量為33.00%~33.20%;pnad5基因的A+T堿基含量為70.50%~71.10%,C+G堿基含量為28.90%~29.30%;ITS基因的A+T堿基含量為58.90%~60.00%,C+G堿基含量為40.00%~40.10%。

        圖2 野豬源蛔蟲(chóng)線粒體pnad 5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

        圖3 野豬源蛔蟲(chóng)核糖體ITS PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

        9株野豬樣品分離株的pcox1堿基差異率為0.00%~0.30%、pnad5為0.00%~0.60%、ITS為0.00%~0.04%。9株野豬樣品分離株線粒體pcox1基因僅有1個(gè)堿基變異位點(diǎn)(位于343 bp處,共391 bp),為嘧啶之間的堿基替換,只有2種單倍型;9株野豬樣品分離株線粒體pnad5基因有5個(gè)堿基變異位點(diǎn),主要為嘌呤之間的堿基替換,共有6種單倍型;9株野豬樣品分離株核糖體ITS基因僅有1個(gè)堿基變異位點(diǎn)(位于117 bp處,共867 bp),為嘧啶之間的堿基替換,只有2種單倍型,見(jiàn)表2。9株野豬樣品分離株擴(kuò)增序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的人蛔蟲(chóng)線粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因序列堿基差異率分別為0.00%~0.30%、1.00%~1.60%和0.00%~0.07%,與豬蛔蟲(chóng)分離株相應(yīng)序列堿基差異率分別為0.30%~1.80%(pcox1)、1.00%~7.20%(pnad5)和0.70%~1.30% (ITS)。

        表2 pcox1、pnad 5和ITS基因序列核苷酸多態(tài)性

        2.3 種系發(fā)育分析 基于pcox1、pnad5和ITS基因分別構(gòu)建野豬源蛔蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),如圖4~6所示,野豬源蛔蟲(chóng)和人蛔蟲(chóng)分離株均聚合在同一分支上,與豬蛔蟲(chóng)分離株相隔較近,與獅弓蛔蟲(chóng)相隔較遠(yuǎn)。

        圖4 野豬源蛔蟲(chóng)pcox1基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

        圖5 野豬源蛔蟲(chóng)pnad 5基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

        圖6 野豬源蛔蟲(chóng)ITS基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

        3 討論

        野豬源蛔蟲(chóng)的有效鑒定是對(duì)野豬蛔蟲(chóng)病進(jìn)行預(yù)防的前提,但傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法難以對(duì)形態(tài)相似的蟲(chóng)株進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。線粒體基因由于相對(duì)保守、母系遺傳等優(yōu)點(diǎn)現(xiàn)已成為寄生蟲(chóng)分類與鑒定的有力工具[14-15]。本試驗(yàn)擴(kuò)增的9株野豬源蛔蟲(chóng)線粒體pcox1和ITS基因片段堿基差異率分別為0.00%~0.30%和0.00%~0.04%,其差異主要為堿基互換,表明野豬源蛔蟲(chóng)pcox1和ITS基因種內(nèi)高度保守, pnad5基因片段堿基差異率為0.00%~0.60%,種內(nèi)相對(duì)保守;與人蛔蟲(chóng)分離株pcox1、pnad5和ITS基因序列堿基差異率分別為0.00%~0.30%、1.00%~1.60%和0.00%~0.07%,和豬蛔蟲(chóng)對(duì)應(yīng)的基因序列堿基變異率分別為0.30%~1.80% (pcox1)、1.00%~7.20%(pnad5)和 0.70%~1.30%(ITS)??梢?jiàn)野豬源蛔蟲(chóng)pcox1、pnad5和ITS基因種內(nèi)變異較小,與人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)堿基差異率均較小,但與人蛔蟲(chóng)堿基差異率更小。此外,本試驗(yàn)中9株野豬源蛔蟲(chóng)分離株pcox1、pnad5和ITS基因序列核苷酸多樣性均低于0.01,結(jié)果表明野豬源蛔蟲(chóng)pcox1、pnad5和ITS基因遺傳變異程度低。

        基于野豬源蛔蟲(chóng)pcox1、pnad5和ITS基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示,本試驗(yàn)分離的9株野豬源蛔蟲(chóng)樣品均與人蛔蟲(chóng)聚合為同一分支,然后與豬蛔蟲(chóng)聚合為一大支,與獅弓蛔蟲(chóng)相隔較遠(yuǎn)。目前國(guó)內(nèi)僅存在通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定的野豬感染蛔蟲(chóng)的案例報(bào)道,且均鑒定為豬蛔蟲(chóng)[2-3]。本試驗(yàn)首次通過(guò)線粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因?qū)σ柏i源蛔蟲(chóng)進(jìn)行鑒定和遺傳變異分析?;诰€粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因分析結(jié)果表明野豬源蛔蟲(chóng)和人蛔蟲(chóng)、豬蛔蟲(chóng)同源性均很高。

        人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)的分類地位一直存在爭(zhēng)議,研究者試圖從多方面來(lái)進(jìn)行比較,但結(jié)果不盡相同[16-17]。鄒勇[13]分別對(duì)豬蛔蟲(chóng)和人蛔蟲(chóng)的線粒體pcox1和ITS基因序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)pcox1和ITS基因差異較小。吳昌義等[12]發(fā)現(xiàn),豬蛔蟲(chóng)和人蛔蟲(chóng)線粒體pnad5基因差異較小。Easton等[4]報(bào)道,豬蛔蟲(chóng)和人蛔蟲(chóng)存在雜交復(fù)合體感染人類,使豬蛔蟲(chóng)和人蛔蟲(chóng)分類變得更加復(fù)雜。此外,線粒體基因存在漸滲雜交和基因滲透,也阻礙人蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)的準(zhǔn)確鑒定和分類[15]。值得注意的是,Leles等[18]通過(guò)古生物學(xué)和遺傳學(xué)證據(jù)并結(jié)合最新的研究數(shù)據(jù)認(rèn)為,人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)應(yīng)為同一物種,僅有輕微的表型和基因型適應(yīng)性變化。本試驗(yàn)采集樣品來(lái)源和數(shù)目有限,且僅鑒定了3段基因。因此,需要采集更多的野豬源蛔蟲(chóng)樣品,以及利用不同的鑒定方法(線粒體全基因組、核基因和微衛(wèi)星標(biāo)記等)分析野豬源蛔蟲(chóng)與人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)的分類關(guān)系。

        綜上所述,本試驗(yàn)利用線粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因序列對(duì)湖南省長(zhǎng)沙市瀏陽(yáng)市野豬源蛔蟲(chóng)分離株進(jìn)行種群鑒定和種群遺傳結(jié)構(gòu)研究,結(jié)果顯示野豬源蛔蟲(chóng)遺傳變異程度低,判斷野豬源蛔蟲(chóng)為人蛔蟲(chóng),需要更多的野豬源蛔蟲(chóng)樣品和多種鑒定方法進(jìn)一步鑒別。

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