蔣昌華 （重慶市涪陵中心醫(yī)院，重慶 408000）

百草枯是目前世界上使用最為廣泛的除草劑，人誤食后主要作用于肺［1］。晚期肺纖維化導(dǎo)致的呼吸衰竭是百草枯主要致死原因［2］。我國作為農(nóng)業(yè)大國，百草枯應(yīng)用廣泛，目前，雖然百草枯已屬禁止藥物，但因其在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用效果顯著，個別地區(qū)仍有使用，中毒病例數(shù)一直居高不下，由于救治技術(shù)進(jìn)展緩慢，病死率位居第一［3-5］。為探索新的救治方法，提高百草枯中毒治療成功率以及改善患者預(yù)后，本研究建立百草枯急性中毒家兔模型，探究環(huán)磷酰胺聯(lián)合甲強(qiáng)龍的治療效果，觀察其對家兔肺組織氧化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50 只8~10 月齡家兔，平均年齡（9.1±0.7）個月，體質(zhì)量3 000~3 990 g，平均體質(zhì)量（3 465.2±362.8）g，由維通利華動物技術(shù)公司提供。于30%~35%相對濕度、（23.8±1.5）℃環(huán)境中喂養(yǎng)1周，光照12 h/d。本研究經(jīng)重慶市涪陵中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 20%百草枯溶液購于南京杜邦生物化工公司；SOD、MDA 測試盒及HE 染色試劑盒購于南京建成生物工程研究所；家兔血清TGF-β1及PⅢP測試盒購于上海史瑞可生物科技有限公司；兔抗大鼠TNF-α、TIMP-1 ELISA 試劑盒購于美國R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 建模 參考靳妍等［6］百草枯中毒小鼠建模標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行建模，50 只家兔隨機(jī)分為陰性對照組、百草枯組、甲強(qiáng)龍組、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合治療組，每組10 只。對各組家兔進(jìn)行麻醉處理，去除背部體毛，固定，消毒，建模在無菌環(huán)境中進(jìn)行。家兔實驗前禁食不禁水12 h，百草枯組、甲強(qiáng)龍組、環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組腹腔注射20%百草枯溶液，12 h后，甲強(qiáng)龍組腹腔注射甲強(qiáng)龍（60 mg/kg），環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺（50 mg/kg），聯(lián)合治療組腹腔注射甲強(qiáng)龍（60 mg/kg）及環(huán)磷酰胺（50 mg/kg），以10%生理鹽水溶解，陰性對照組注射等量生理鹽水。觀察各組家兔行為及肺外觀變化。

1.2.2 血清采集 于1 d、2 d、3 d、4 d 對家兔耳緣進(jìn)行靜脈采血。將家兔固定于固定箱內(nèi)，剪除耳緣靜脈局部被毛，乙醇消毒，手指輕彈兔耳使其靜脈充盈擴(kuò)張，左手拇指按壓家兔近心端，右手將針頭刺入耳緣靜脈使血液流出。血樣放置于促凝真空管，2 h 內(nèi) 3 000 r/min 離心，靜置 5 min，取出血清樣本，冷凍保存。

1.2.3 標(biāo)本采集 取血完成后對家兔進(jìn)行空氣栓塞處死，立即開胸，分離肺組織送檢。送檢前將肺組織固定于4%甲醛溶液完全浸泡，24 h后行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片，組織學(xué)光鏡檢測，切片前進(jìn)行HE染色。

1.2.4 HE 染色 烤干切片，脫蠟處理，順序置于梯度濃度乙醇中復(fù)水3 min。蘇木精染色15 min，清洗3次，鹽酸-乙醇分化處理30 s，充分清洗，1%伊紅染色，乙醇脫水，脫蠟，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.5 RT-PCR 檢測 TNF-α mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)計引物序列，所得RNA 以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR 儀擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 90 s；5 ℃變性 10 s，60 ℃退火 30 s，共40 個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，65 ℃緩慢加熱至95 ℃，建立 PCR 產(chǎn)物熔解曲線，2-ΔΔCt法計算，采用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計 PCR 引物，由 Invitrogen公司合成引物。

1.2.6 ELISA 檢測TGF-β1、HYP、PⅢP、NE 水平處死大鼠，收集外周血，30 min 內(nèi)以1 500 r/min 離心20 min，取上清，-80 ℃保存待測。按試劑盒說明書檢測TNF-α、TIMP-1蛋白及TGF-β1、PⅢP、NE水平，采用50 mm 碳酸鹽包緩沖液稀釋抗原，加入聚苯乙烯反應(yīng)孔，加蓋，4 ℃放置24 h，次日洗滌3次，干燥，0.1 ml/孔加入稀釋的待測標(biāo)本，并加入陽性和陰性對照，42 ℃放置60 min，移除液體，洗滌3 次，干燥，0.1 ml/孔加入TNF-α、TIMP-1蛋白及TGF-β1、PⅢP、NE抗體，放置60 min，移除液體，洗滌3次，拋干，加入底物液混勻，加入0.1 ml鄰苯二胺遮光反應(yīng)20 min，0.05 ml/孔加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。

1.2.7 黃嘌呤氧化酶法檢測SOD 水平 取聚苯乙烯試管，分為測量管、對照管。提取樣品，于上清中加入10倍體積的蒸餾水，配制為1%溶液。測量管、對照管內(nèi)均加入1.0 ml 試劑盒試劑，測量管加入樣品50 μl，對照管內(nèi)加50 μl蒸餾水，放入旋渦混勻器充分混勻，37 ℃恒溫水浴40 min。顯色：對照管、測量管中各加2 ml 顯色劑，室溫放置10 min。采用蒸餾水調(diào)零分光光度法計算（波長550 nm，1 cm光徑）。

1.2.8 MDA 檢測 取聚苯乙烯試管，分為標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管及測量管、測量空白管，標(biāo)準(zhǔn)管中加入10 nmol/L 四乙氧基丙烷0.1 ml 與試劑盒試劑，標(biāo)準(zhǔn)空白管加0.1 ml無水乙醇與試劑，測量管加入0.1 ml肌肉組織勻漿上清與試劑盒試劑，測量空白管加0.1 ml 肌肉組織勻漿上清與試劑盒試劑，搖動試管架混勻，標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測量管置于3 ml 硫代巴比妥酸與1 ml 雙蒸水，測量空白管置于硫代巴比妥酸3 ml 與50%冰乙酸1 ml。所有試管置于旋渦混勻器混勻，試管口采用保鮮薄膜扎緊，針頭刺出1 個小孔，95 ℃水浴40 min，流水冷卻，4 ℃、3 500~4 000 r/min 離心10 min，移液器吸取上清，加入比色皿內(nèi)待檢，蒸餾水調(diào)零分光光度法計算MDA值。

1.2.9 肺濕/干重比檢測 取家兔右肺上葉，切除多余結(jié)締組織，擦拭表面血液，天平稱量，80 ℃烘烤48 h，稱量，計算肺濕/干重比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色結(jié)果 陰性對照組家兔肺組織肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰，且肺泡壁薄，僅有少數(shù)紅細(xì)胞。百草枯組家兔肺泡萎縮塌陷較為明顯，且已出現(xiàn)大量纖維化改變。環(huán)磷酰胺組與甲強(qiáng)龍組家兔肺組織內(nèi)纖維化緩解，聯(lián)合治療組纖維化明顯緩解（圖1）。

圖1 各組家兔肺組織病理學(xué)變化Fig.1 Pathological changes of lung tissue of rabbits in each group

2.2 TNF-α、TIMP-1 mRNA 表達(dá) 如表 1 所示，與陰性對照組、甲強(qiáng)龍組、環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合組相比，百草枯組 TNF-α、TIMP-1 mRNA 表達(dá)升高，與陰性對照組相比，甲強(qiáng)龍組、環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組TNF-α、TIMP-1 mRNA 表達(dá)升高，與甲強(qiáng)龍組相比，環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組TNF-α、TIMP-1 mRNA 表達(dá)降低，且聯(lián)合治療組 TNF-α、TIMP-1 mRNA 表達(dá)低于環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）。

表1 各組家兔肺組織 TNF-α、TIMP-1 mRNA 表達(dá)（，n=10）Tab.1 TNF-α and TIMP-1 mRNA expressions in lung tissue of rabbits in each group（，n=10）

表1 各組家兔肺組織 TNF-α、TIMP-1 mRNA 表達(dá)（，n=10）Tab.1 TNF-α and TIMP-1 mRNA expressions in lung tissue of rabbits in each group（，n=10）

Note：Compared with negative control group，1）P＜0.05；compared with paraquat group，2）P＜0.05；compared with methylprednisolone group，3）P＜0.05；compared with cyclophosphamide group，4）P＜0.05.

TIMP-1 mRNA 1.04±0.15 2.23±0.231）1.88±0.171）2）1.57±0.171）2）3）1.41±0.151）2）3）4）Groups Negative control Paraquat Methylprednisolone Cyclophosphamide Combined treatment TNF-α mRNA 1.12±0.19 2.45±0.261）1.83±0.181）2）1.65±0.161）2）3）1.31±0.131）2）3）4）

2.3 SOD 及 MDA 含量比較 建模 2 d、4 d 后，與陰性對照組、甲強(qiáng)龍組、環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組相比，百草枯組SOD含量降低、MDA 含量升高，與陰性對照組相比，甲強(qiáng)龍組、環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組SOD 含量降低、MDA 含量升高，與甲強(qiáng)龍組相比，環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組SOD含量升高、MDA 含量降低，且聯(lián)合治療組SOD 含量高于、MDA 含量低于環(huán)磷酰胺組（P＜0.05，表2）。

表2 各組血清SOD及MDA含量比較（，n=10）Tab.2 Comparison of serum SOD and MDA contents in each group（，n=10）

表2 各組血清SOD及MDA含量比較（，n=10）Tab.2 Comparison of serum SOD and MDA contents in each group（，n=10）

Note：Compared with negative control group，1）P＜0.05；compared with paraquat group，2）P＜0.05；compared with methylprednisolone group，3）P＜0.05；compared with cyclophosphamide group，4）P＜0.05.

Groups 4 d 4.21±0.31 10.68±0.751）8.83±0.581）2）7.12±0.421）2）3）6.15±0.371）2）3）4）SOD/（U·ml-1）2 d 269.53±16.24 203.36±10.211）221.57±11.561）2）231.57±12.361）2）3）252.63±14.471）2）3）4）4 d 272.36±18.34 146.25±11.271）164.25±10.791）2）195.31±11.791）2）3）212.15±12.641）2）3）4）Negative control Paraquat Methylprednisolone Cyclophosphamide Combined treatment MDA/（nmol·ml-1）2 d 5.16±0.29 9.95±0.421）8.69±0.351）2）6.75±0.421）2）3）5.41±0.421）2）3）4）

2.4 血清 TGF-β1、PⅢP 及 HYP 水平比較 建模2 d、4 d 后，與陰性對照組、甲強(qiáng)龍組、環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組相比，百草枯組TGF-β1、PⅢP及HYP 水平升高，與陰性對照組相比，甲強(qiáng)龍組、環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組TGF-β1、PⅢP及HYP 水平升高，與甲強(qiáng)龍組相比，環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組TGF-β1、PⅢP及 HYP 水平降低，且聯(lián)合治療組 TGF-β1、PⅢP 及HYP水平低于環(huán)磷酰胺組（P＜0.05，表3）。

表3 各組血清TGF-β1、PⅢP、HYP水平比較（，n=10）Tab.3 Comparison of serum levels of TGF-β1，PⅢP and HYP in each group（，n=10）

表3 各組血清TGF-β1、PⅢP、HYP水平比較（，n=10）Tab.3 Comparison of serum levels of TGF-β1，PⅢP and HYP in each group（，n=10）

Note：Compared with negative control group，1）P＜0.05；compared with paraquat group，2）P＜0.05；compared with methylprednisolone group，3）P＜0.05；compared with cyclophosphamide group，4）P＜0.05.

Groups 4 d 78.25±8.16 167.43±14.631）149.28±11.341）2）131.63±9.871）2）3）115.29±11.351）2）3）4）TGF-β1/（pg·ml-1）2 d 27.65±0.18 164.25±13.471）139.57±10.251）2）107.62±5.711）2）3）83.24±5.711）2）3）4）4 d 34.57±0.27 215.32±17.561）175.63±13.241）2）136.73±7.361）2）3）117.83±7.361）2）3）4）PⅢP/（ng·ml-1）2 d 7.13±0.58 29.16±2.171）23.56±2.251）2）20.28±2.141）2）3）15.29±1.271）2）3）4）4 d 7.94±0.09 42.67±4.591）37.41±3.271）2）19.87±1.181）2）3）16.59±1.581）2）3）4）Negative control Paraquat Methylprednisolone Cyclophosphamide Combined treatment HYP/（μg·lung-1）2 d 82.56±9.63 175.28±13.461）154.57±12.571）2）132.39±11.571）2）3）113.25±10.261）2）3）4）

2.5 NE 水平及肺上葉濕/干重比 與陰性對照組、甲強(qiáng)龍組、環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組相比，百草枯組NE 水平及肺上葉濕/干重比升高，與陰性對照組相比，甲強(qiáng)龍組、環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組NE 水平及肺上葉濕/干重比升高，與甲強(qiáng)龍組相比，環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合治療組NE 水平及肺上葉濕/干重比降低，且聯(lián)合治療組NE 水平及肺上葉濕/干重比低于環(huán)磷酰胺組（P＜0.05，表4）。

表4 各組NE水平及肺上葉濕/干重比比較（，n=10）Tab.4 Comparison of wet/dry weight ratio of upper lobe and NE level in each group（，n=10）

表4 各組NE水平及肺上葉濕/干重比比較（，n=10）Tab.4 Comparison of wet/dry weight ratio of upper lobe and NE level in each group（，n=10）

Note：Compared with negative control group，1）P＜0.05；compared with paraquat group，2）P＜0.05；compared with methylprednisolone group，3）P＜0.05；compared with cyclophosphamide group，4）P＜0.05.

Wet/dry weight ratio/%3.59±0.12 9.86±0.791）8.71±0.371）2）6.16±0.211）2）3）4.32±0.411）2）3）4）Groups Negative control Paraquat Methylprednisolone Cyclophosphamide Combined treatment NE/（10-3 U·L-1）2.57±0.08 15.42±3.241）10.79±0.811）2）6.35±0.461）2）3）5.36±0.431）2）3）4）

3 討論

百草枯對植物、人類、動物均有較強(qiáng)毒性，主要作用于肺，誤食早期多出現(xiàn)急性肺損傷，晚期則發(fā)生肺纖維化，病死率高達(dá)60%~80%［7］。研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注入百草枯構(gòu)建大鼠模型，第1 天就會對肺組織造成嚴(yán)重?fù)p傷［8］。百草枯主要使體內(nèi)生成氧自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致組織細(xì)胞，尤其是肺組織出現(xiàn)氧化性損傷［9］。百草枯中毒后，肺部由于出現(xiàn)大量超氧陰離子自由基，引起較強(qiáng)烈的外源性氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織細(xì)胞DNA 大量凋亡。甲強(qiáng)龍作為臨床常用激素類藥物，屬于糖皮質(zhì)激素，可緩解機(jī)體中毒，但副作用較多［10］。環(huán)磷酰胺屬于烷化劑類免疫抑制劑，作為細(xì)胞毒性藥物，能夠殺死有絲分裂及進(jìn)入循環(huán)周期的細(xì)胞，破壞內(nèi)部DNA結(jié)構(gòu)，阻斷細(xì)胞復(fù)制，因此具有較強(qiáng)的免疫抑制作用［11］。研究表明，環(huán)磷酰胺可抑制動物體液免疫和細(xì)胞免疫，導(dǎo)致免疫抑制［12］。

早期急性肺炎與后期肺纖維化是百草枯中毒過程顯著的病理改變，其中炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥因子釋放具有重要作用。研究顯示，百草枯導(dǎo)致肺纖維化過程的主要機(jī)制為炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞因子水平在中毒過程中均升高［13］。其中 TNF-α 作為主要細(xì)胞因子參與肺損傷形成，在肺組織炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，通過觀察TNF-α 水平能夠反映肺損傷過程中炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度。研究顯示，急性百草枯中毒發(fā)展過程中，TIMP-1 水平升高，發(fā)展為肺間質(zhì)纖維化中，與TIMP-1表達(dá)密切相關(guān)［14］。隨著TNF-α、TIMP-1 細(xì)胞因子在肺纖維化發(fā)病及病理過程中的作用備受關(guān)注，本研究同時檢測TNF-α、TIMP-1 mRNA 及 TNF-α、TIMP-1 蛋白水平，結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療，TNF-α、TIMP-1 mRNA 及TNF-α、TIMP-1蛋白水平顯著下降，說明二者聯(lián)合治療能夠降低百草枯中毒過程中的炎癥反應(yīng)。

百草枯作用于機(jī)體后，會被肺泡細(xì)胞攝取，導(dǎo)致氧化還原反應(yīng)中大量OFR 出現(xiàn)，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而釋放炎癥因子，細(xì)胞及線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡，引發(fā)過氧化反應(yīng)造成肺損傷［15］。SOD 作為機(jī)體內(nèi)重要的自由基清除劑，MDA 作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物之一，臨床上常用于評價機(jī)體氧化損傷程度［16］。本研究顯示，環(huán)磷酰胺聯(lián)合甲強(qiáng)龍對急性百草枯中毒模型家兔進(jìn)行治療，SOD 下降程度與MDA上升程度較低，說明二者聯(lián)合治療可抑制氧化應(yīng)激，緩解肺損傷。

研究認(rèn)為TGF-β 是啟動纖維化形成的樞紐，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)膠原合成、分泌，使成纖維細(xì)胞增殖數(shù)增加，從而導(dǎo)致纖維化［17］。其中 TGF-β1 作為重要的致纖維化因子，臨床認(rèn)為其是抗纖維化治療理想靶點［18］。PⅢP是Ⅲ型前膠原轉(zhuǎn)化成Ⅲ型膠原時釋放的多肽，其水平出現(xiàn)增高說明組織纖維化開始，是早期肺纖維化診斷的有力評價指標(biāo)［19］。本研究顯示，環(huán)磷酰胺聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療急性百草枯中毒模型家兔，TGF-β1、PⅢP及HYP水平降低，說明二者聯(lián)合治療可抑制肺纖維化形成。

NE是中性絲氨酸蛋白酶的一種，可分解鈣黏連素，導(dǎo)致肺纖維網(wǎng)狀支架塌陷及增加肺毛細(xì)血管膜通透性，血漿蛋白及活性物質(zhì)較多地滲進(jìn)肺間質(zhì)、肺泡，導(dǎo)致機(jī)體非心源性肺水腫［20］。研究顯示，NE是導(dǎo)致肺組織損傷、加重肺不張過程中重要的酶，因此，NE變化監(jiān)測可預(yù)測肺組織損傷情況［21］。研究表明，肺組織中濕/干重比能夠間接說明肺內(nèi)漏出液體多少，漏出液體越多，肺濕/干重比越高，同時灌洗液回收率也隨著增高［22］。本研究顯示，環(huán)磷酰胺聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療急性百草枯中毒模型家兔，NE水平及肺上葉濕/干重比降低，說明二者聯(lián)合治療可減輕肺組織損傷、肺不張及肺內(nèi)漏液情況。

綜上所述，環(huán)磷酰胺聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療急性百草枯中毒模型家兔，可緩解急性百草枯中毒家兔炎癥反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激及肺部纖維化形成，減輕肺組織損傷，同時緩解肺不張以及肺內(nèi)漏液情況。