朱子貴 孟 文 賀承建 陳嘉城 姚平波 趙 紅 謝婧嫻 劉雨露

（南華大學附屬南華醫(yī)院重癥醫(yī)學科，衡陽 421002）

膿毒癥是指機體對感染的反應失調(diào)而引起的全身性炎癥反應綜合征，可導致患者多器官損傷、衰竭甚至死亡。據(jù)統(tǒng)計，全球每年新增膿毒癥病例1 900 萬，死亡病例 600 萬，致死率達 30% 左右［1］。其中，急性肺損傷是膿毒癥引起器官損傷的常見并發(fā)癥［2-4］。研究表明，多種天然藥物中提取的中藥成分在膿毒癥急性肺損傷中具有潛在的研究價值，如大黃素、槲皮素、姜黃素等［5-7］。異葒草素是一種存在于決明子、集花龍膽、黃荊等藥用植物的天然黃酮類有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗癌等生物活性，但未見異葒草素對膿毒癥的有關報道［8-10］。因此，本研究旨在探討異葒草素對CLP 誘導的膿毒癥小鼠急性肺功能損傷的影響，以期為異葒草素的臨床應用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50 只雄性SPF 級BALB/c 小鼠，體質(zhì)量25~30 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011。動物實驗遵循我國《實驗動物福利倫理審查指南（GB/T358922018）》提出的原則與要求。

1.1.2 藥物與試劑 異葒草素（純度98.6%）購自成都植標化純生物技術有限公司；誘導型一氧化氮（iNOS）合酶試劑盒、IL-10 試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液購自美國博士德生物工程有限公司；Masson膠原染色試劑、蘇木精-伊紅染色試劑購自北京雷根生物技術有限公司；生理鹽水、多聚甲醛購自南京高和化工有限公司；TBST 緩沖液及caspase 9、cas?pase 3、NF-κB P65 等相關抗體購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；蛋白質(zhì)凝膠電泳購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.1.3 主要儀器 ME104T/02 電子天平購自梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；HBS-1096C 酶標分析儀購自南京德鐵實驗設備有限公司；JIDI-16R 臺式多用途高速冷凍離心機購自廣州吉迪儀器有限公司；全身體積描記器-無創(chuàng)肺功能儀購自上海玉研科學儀器有限公司；Axioscope 5 顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1 動物與處理 將健康小鼠隨機分為5組：假手術對照組、模型組及異葒草素低（7.5 mg/kg）、中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）劑量組，每組10 只。參考文獻［11］，麻醉小鼠，呈仰臥位，在腹白線中點下方0.3 cm 處剪開皮膚，將盲腸末端取出，采用4-0 號縫合線距末端1/3 處結扎，三棱針穿刺2 孔后，將盲腸輕放于腹腔并縫合，建立小鼠膿血癥模型；對照組進行假手術操作，打開腹腔但未結扎及穿刺盲腸。2 h后，給藥組分別腹腔注射10μl 7.5 mg/kg、15 mg/kg和30 mg/kg 異葒草素，假手術對照組及模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)7 d，1次/d。

1.2.2 體描箱檢測肺功能指標 小鼠出現(xiàn)呼吸頻率加快、寒顫、毛發(fā)聳立和活動減少等多種癥狀預示造模成功。造模成功12 h 后，將各組小鼠麻醉，進行氣管插管，在體描箱內(nèi)記錄靜息狀態(tài)下呼吸通氣量，并檢測氣道阻力改變、肺容積變換指標。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液、血清、肺組織收集 將各組小鼠麻醉后，眼球取血，離心收集上清液。及時解剖，取小鼠右肺下葉，用電子天平秤濕重，于80 ℃干燥至恒重，秤干重，計算肺臟濕/干重比=［W/D，（濕重?干重）/干重×100%］。剩余肺組織一部分進行蠟塊包埋，用于病理形態(tài)學觀察，另一部分凍存，用冷生理鹽水處理，制備10%的肺勻漿（剪取適量左肺組織稱重后，按1 g組織加入9 ml PBS的比例配制，再按照每20 mg 肺組織加入150~200μl RIPA 裂解液的比例配制，在冰上用勻漿器制備成10%肺組織勻漿，4 ℃、4 000 r/min 離心20 min）用于后續(xù)組織蛋白的提取。

1.2.4 HE 染色觀察肺組織 取蠟塊包埋的肺組織，組織切片機切片。經(jīng)水浴展平、置載玻片烘干、二甲苯脫蠟后，進行HE 染色，封片后在顯微鏡下觀察。

1.2.5 ELISA 檢測血清及肺組織炎癥指標水平取1.2.3 制備的血清及肺勻漿，分別按照iNOS 試劑盒、IL-10試劑盒說明書操作，用酶標儀進行檢測。

1.2.6 Western blot 檢測肺組織細胞凋亡相關蛋白表達量 取1.2.3 制備的肺組織勻漿液，加入RIPA裂解液，冰浴30 min 后，離心取上清，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸使蛋白變性，獲得上樣樣本。采用SDS-PAGE 分離蛋白并轉膜，進行脫脂奶粉封閉后，分別加入caspase 9、caspase 3和NF-κB P65等相關一抗4 ℃孵育過夜，TBST沖洗，加入二抗孵育 1 h，TBST 沖洗 3 次，ECL 顯影后分析灰度值，實驗重復3次。

1.2.7 Masson 染色觀察肺纖維化 取出包埋處理的組織，進行組織切片，二甲苯脫蠟，高濃度到低濃度乙醇脫水，Masson 膠原染色試劑染色，二甲苯浸泡5 min，封片后在顯微鏡下觀察結果。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組數(shù)據(jù)用單因素方差分析（One-Way ANOVA），結果以表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 異葒草素對小鼠急性肺功能損傷的影響 與假手術對照組相比，模型組小鼠肺組織干濕重比升高，靜息通氣量、氣道阻力、肺容積降低（P<0.05，圖1）；與模型組相比，除異葒草素低劑量組（7.5 mg/kg）差異無統(tǒng)計學意義外，異葒草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）劑量組小鼠肺組織干濕重比降低，靜息通氣量、氣道阻力、肺容積升高（P<0.05，圖1）。提示異葒草素能夠緩解CLP 誘導的膿毒癥小鼠急性肺功能損傷，隨濃度升高，緩解作用增強，有一定劑量依賴性。

圖1 異葒草素對小鼠急性肺功能損傷的影響Fig.1 Effects of isoorientin on acute lung injury in mice

2.2 異葒草素對小鼠肺組織HE 染色的影響 假手術對照組小鼠肺組織結構清晰分明未見病理形態(tài)變化；模型組小鼠肺組織結構破壞明顯，肺泡壁充血、間隔增厚，肺泡腔縮小，見炎癥浸潤；異葒草素低劑量組（7.5 mg/kg）的病理程度與模型組接近；異葒草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）劑量組的病理程度較輕，炎癥細胞浸潤區(qū)域較少，肺組織結構相對完整（圖2）。提示異葒草素能夠改善CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺組織病變程度，緩解肺部損傷。

圖2 異葒草素對小鼠肺組織HE染色的影響（×100）Fig.2 Effects of isoorientin on HE staining of mice lung tissues（×100）

2.3 異葒草素對小鼠炎癥指標水平的影響 在血清中，與假手術對照組相比，模型組炎癥遞質(zhì)iNOS含量、免疫細胞因子IL-10含量升高；與模型組相比，除異葒草素低劑量組（7.5 mg/kg）炎癥水平差異無統(tǒng)計學意義外，異葒草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）劑量組iNOS 含量明顯降低、IL-10 明顯升高（P<0.05，圖3A），肺組織及血清中的指標水平相一致（P<0.05，圖3B）。提示，異葒草素能夠改善CLP 誘導的膿毒癥小鼠的炎癥程度，緩解肺組織功能損傷。

圖3 異葒草素對小鼠炎癥指標水平的影響Fig.3 Effects of isoorientin on levels of inflammation indicators in mice

2.4 異葒草素對小鼠肺組織凋亡相關蛋白指標表達的影響 與假手術對照組相比，模型組凋亡相關蛋白 cleaved caspase 9/caspase 9、cleaved caspase 3/caspase 3表達均明顯升高；與模型組相比，除異葒草素低劑量組（7.5 mg/kg）cleaved caspase 9/caspase 9表達差異無統(tǒng)計學意義外，異葒草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）劑量組凋亡相關蛋白指標cleaved cas?pase 9/caspase 9均明顯降低；與模型組相比，各劑量組的cleaved caspase 3/caspase 3表達均明顯降低，且有一定劑量依賴性（P<0.05，圖4）。異葒草素能夠緩解CLP誘導的膿毒癥小鼠肺損傷程度。

圖4 異葒草素對小鼠肺組織凋亡相關蛋白表達的影響Fig.4 Effects of isoorientin on expressions of apoptosisrelated proteins in mice lung tissue

2.5 異葒草素對小鼠肺組織纖維化的影響 假手術對照組小鼠肺組織肺泡結構完整，無肺泡內(nèi)出血，僅有少量膠原；模型組肺泡大量出現(xiàn)導致正常結構消失，肺間質(zhì)膠原纖維增生；異葒草素低劑量組（7.5 mg/kg）的纖維化程度與模型組接近；異葒草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）劑量組纖維化程度較輕（圖5）。提示異葒草素能夠緩解CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺組織纖維化的程度。

2.6 異葒草素對小鼠肺組織中NF-κB 通路相關蛋白表達的影響 與假手術對照組相比，模型組小鼠肺組織中NF-κB p-P65/P65表達明顯升高；與模型組相比，除異葒草素低劑量組（7.5 mg/kg）差異無統(tǒng)計學意義外，異葒草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）劑量組NF-κB p-P65/P65表達明顯降低（P<0.05，圖6）。提示異葒草素能夠緩解CLP 誘導的膿毒癥小鼠肺損傷程度，其機制可能與下調(diào)NF-κB 通路相關蛋白表達有關。

圖6 異葒草素對小鼠肺組織中NF-κB通路相關蛋白表達的影響Fig.6 Effects of isoorientin on NF-κB pathway related protein expressions in mice lung tissue

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，膿毒癥病情來勢迅猛并持續(xù)惡化，超過40%的患者會出現(xiàn)急性肺損傷并發(fā)癥，具有炎癥及血管通透性增加的特點，引起嚴重的免疫紊亂、肺水腫、感染性休克等癥狀，嚴重威脅患者生命［12］。因此，針對膿毒癥引起的急性肺損傷的特異性藥物研究具有重要意義。

異葒草素是一種天然黃酮類有效成分，具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗纖維化、抗癌等。其中，YUAN 等［13］研究表明，異葒草素提高小膠質(zhì)細胞活力，阻斷iNOS 和COX-2 蛋白表達，并降低NO 及促炎細胞因子（包括TNF-α 和IL-1β）的產(chǎn)生來減輕神經(jīng)炎癥；FAN 等［14］報道指出，異葒草素通過激活SIRT1/SIRT6/Nrf2 通路，抑制氧化應激和細胞凋亡，從而減輕順鉑誘導的腎毒性；LIN 等［15］研究顯示異葒草素通過調(diào)節(jié)NF-κB 和TGF-β1/Smad信號通路緩解CCl?誘導的大鼠肝纖維化。但未見異葒草素對膿毒癥引起的急性肺損傷的影響。因此，本研究探討異葒草素對CLP 誘導的膿毒癥小鼠急性肺功能損傷及免疫紊亂的影響。

肺功能檢查是呼吸系統(tǒng)疾病不可或缺的檢查，廣泛用于疾病診斷、預后評估等，具有重要臨床意義［16］。肺組織干/濕重比（W/D）是血管外肺水測定的常用方法，通常反映肺水腫程度。LIU 等［17］研究表明，遠志皂苷通過降低肺組織W/D，降低血清TNF-α 和 IL-1β 水平，緩解肺組織的病理程度，減輕CLP 誘導的肺損傷。本研究顯示，異葒草素各組靜息通氣量、氣道阻力、肺容積升高，肺組織W/D、炎癥指標降低，炎癥浸潤區(qū)域較少，肺組織的病變程度減輕，提示異葒草素能緩解CLP 誘導的膿毒癥小鼠急性肺功能損傷，與上述研究一致。

肺纖維化是膿毒癥急性肺損傷的重要原因之一，肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質(zhì)聚集并伴炎癥損傷、組織結構破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變，即正常肺泡組織被損壞后經(jīng)過異常修復導致結構異常［18］。因此，降低肺纖維化程度能有效緩解膿毒癥誘導的急性肺損傷。異葒草素在小鼠肺纖維化中的研究未見報道，因此，本研究通過建立膿毒癥急性肺損傷模型并檢測肺纖維化程度，結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)異葒草素處理后的小鼠肺纖維化程度得到顯著改善。

IL-10 是一種由細胞克隆產(chǎn)生的免疫性細胞因子，結合其受體發(fā)揮生物學功能，能夠抑制單核巨噬細胞釋放TNF-α、IL-6 等炎癥遞質(zhì)，還能促進抗炎因子IL-1 受體拮抗劑等的釋放［19］。此外，膿毒癥能夠誘導細胞凋亡致使組織器官功能障礙及免疫抑制，而細胞凋亡主要依賴半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族完成，因此，caspase 在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［20］。其中caspase 9 作用于凋亡的內(nèi)源性途徑。凋亡內(nèi)在途徑又稱線粒體凋亡途徑，可通過細胞應激促進線粒體釋放細胞色素C并與相關凋亡蛋白酶、ATP、caspase 9組成凋亡小體，導致caspase 3活化，作用于死亡底物，進一步促使細胞凋亡［21］。ZHANG等［22］研究顯示，青蒿琥酯通過降低caspase 3、TNF-α和IL-6表達，緩解肺組織的病理程度，從而改善膿毒癥誘導的急性肺損傷。LAN 等［23］報道指出，紅景天苷能降低CLP 膿毒癥小鼠血清TNF-α、IL-6、NO 產(chǎn)生，下調(diào) iNOS 和磷酸化的 NF-κB P65 蛋白表達，緩解病情發(fā)展。本研究顯示，異葒草素各組IL-10含量升高，凋亡相關蛋白表達（cleaved caspase 9/caspase 9、cleaved caspase 3/caspase 3）及NF-κB通路相關蛋白表達量（p-P65/P65）均降低，與上述研究一致。

綜上，異葒草素能夠緩解CLP 誘導的膿毒癥小鼠急性肺功能損傷，其機制可能與抑制炎癥遞質(zhì)、NF-κB通路蛋白磷酸化及下調(diào)凋亡相關蛋白表達有關。后續(xù)實驗將計劃進一步探究異葒草素改善膿毒癥急性肺損傷小鼠的作用機制。