董 蘭，丁瑞雪，唐文靜，李葉麗，李意奇，楊丹莉

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

細(xì)胞凋亡為細(xì)胞程序性死亡，能維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。成年心肌細(xì)胞是“永久性細(xì)胞”，過(guò)多的心肌細(xì)胞凋亡會(huì)影響心臟的結(jié)構(gòu)與功能[1]。在缺血缺氧、感染等刺激下，心肌細(xì)胞發(fā)生壞死、凋亡、心肌受損，誘發(fā)心室重構(gòu)，甚至心力衰竭，故抑制心肌細(xì)胞凋亡可減輕心肌組織損傷[2]。目前常把心肌肌鈣蛋白I(Cardiac troponin I，cTn I)作為心肌特異性標(biāo)志蛋白。正常狀態(tài)下，僅少部分cTn I游離在心肌細(xì)胞漿中，當(dāng)心肌損傷發(fā)生時(shí)，cTn I從心肌細(xì)胞釋放至細(xì)胞間隙及血液中，故cTn I常作為反映心肌損傷的指標(biāo)[4]。B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，研究表明，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[3]?！凹?xì)胞凋亡執(zhí)行者”Caspsase3屬于半胱氨酸蛋白水解酶家族，其被激活后經(jīng)剪切分離成活化型的Caspsase3(Cleaved-caspase3)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。

秋水仙堿(Colchicine，Col)是臨床治療痛風(fēng)和家族性地中海熱的經(jīng)典藥物，也是治療心包炎的重要藥物[6]。研究發(fā)現(xiàn)小劑量服用秋水仙堿有助于冠心病的治療，并降低心肌梗死的發(fā)生率[7-8]。異丙腎上腺素(Isoproterenol，ISO)是一個(gè)經(jīng)典的非選擇性β受體激動(dòng)藥物，研究表明，ISO能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡等心肌損傷[9-10]。Col對(duì)ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷是否具有保護(hù)作用尚不清楚。故本項(xiàng)目旨在研究Col對(duì)ISO所致小鼠心肌損傷的干預(yù)效應(yīng)，并初步探討其機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 從長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司購(gòu)入18只7周齡雄性C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014。

1.2 藥品與試劑 秋水仙堿片(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H53021369，西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司)；ISO(貨號(hào)：HYB0468，MCE公司)；一步法Tunnel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：C1088，碧云天生物技術(shù)有限公司)；GAPDH兔多克隆抗體(貨號(hào)：10494-1-AP，Proteintech公司)；Bcl-2兔多克隆抗體(貨號(hào)：D154033-0100，BBI Life Sciences公司)；cTnI兔單克隆抗體(貨號(hào)：ab209809，abcam公司)；Caspase3兔多克隆抗體(貨號(hào)：19677-1-AP，Proteintech公司)；Cleaved-caspase3多克隆抗體(貨號(hào)：9661，Cell Signaling Technology公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào)：S0001，Affinity公司)。

1.3 儀器 RM2245組織切片機(jī)(德國(guó)LeicaBiosystems公司)；Mini-PROTEAN3電泳儀；MultisKan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Mini Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)；Chemi Doc 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 18只7周齡雄性C57BL/6小鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房(室內(nèi)溫度為21～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control)、模型組(ISO，5 mg/kg)、秋水仙堿組(Col，1 mg/kg)，每組6只。ISO、Col組小鼠經(jīng)頸背部皮下注射ISO，每天1次，連續(xù)14 d，建立心肌損傷模型[11]，Control組給予等體積的生理鹽水。Col組按劑量灌胃Col，對(duì)照組與ISO組給予等體積雙蒸水，每天1次，連續(xù)14 d。14 d后，稱取小鼠體重并記錄，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(4 mg/kg)麻醉小鼠，取出心臟，稱取全心質(zhì)量，計(jì)算HMI。HMI=心臟重量(mg)/小鼠體重(g)。

2.2 H&E染色檢測(cè)小鼠左心室組織病理變化 小鼠的左心室組織經(jīng)10%中性甲醛固定48 h、脫水、石蠟包埋等步驟后，利用組織切片機(jī)制備成3 μm切片，H&E染色后，中性樹(shù)脂封片，在正置顯微鏡下觀察小鼠左心室組織的病理變化情況。

2.3 Tunnel染色檢測(cè)小鼠左心室組織心肌細(xì)胞凋亡情況 小鼠左心室組織石蠟切片常規(guī)脫蠟后，滴加蛋白酶K溶液，于37℃孵箱中反應(yīng)20 min；用TBST溶液清洗切片，滴加Tunnel反應(yīng)液，于37 ℃孵箱中反應(yīng)60 min；清洗切片后，滴加DAPI溶液，常溫條件反應(yīng)8 min。待切片干燥后用抗熒光猝滅劑封片，在正置熒光顯微鏡下觀察小鼠左心室組織心肌細(xì)胞凋亡情況。利用Image J軟件對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，心肌細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，藍(lán)、綠色熒光重合的細(xì)胞為心肌凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。心肌細(xì)胞凋亡率=心肌凋亡陽(yáng)性細(xì)胞/心肌細(xì)胞×100 %。

2.4 Western blot檢測(cè)小鼠左心室組織中cTnI、Bcl-2、Cleaved-caspase3蛋白水平的變化情況 稱取50 mg小鼠左心室組織剪碎，加入500 μL的裂解液(PMSF∶RIPA：磷酸酶抑制劑=1∶100∶1)，置于冰上裂解30 min后，4℃條件下，臺(tái)式離心機(jī)(轉(zhuǎn)速：12 000 rpm)，離心15 min，吸取上清液，利用BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，配制10 μL蛋白樣本(蛋白濃度：30 μg/10 μL)的體系。蛋白樣本經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用Trans-Blot Turbo Cassette進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，8%的脫脂奶粉溶液封閉2.5 h，TBST洗膜后，將膜置于配制好的一抗溶液中：GAPDH(1∶5 000)、Bcl-2(1∶5 000)、cTnI(1∶2 500)、Caspase 3(1∶800)、Cleaved-caspase3(1∶800)，4 ℃孵育16～22 h，用TBST洗膜后，4 ℃條件下孵育二抗溶液(1∶5 000)1 h，經(jīng)TBST洗膜后，配制高敏ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，利用Chemi Doc化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，并用Image Lab軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 小鼠的一般狀況 與Control組相比，ISO組毛發(fā)晦暗，狀態(tài)萎靡。與ISO組相比，Col組小鼠毛發(fā)光澤，狀態(tài)較活潑。

3.2 小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)(HMI)的變化 與Control相比，ISO組HMI升高(P<0.05)。與ISO組相比，Col組HMI降低(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

3.3 小鼠左心室組織病理變化 H&E染色結(jié)果顯示，Control組心肌細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯的炎性浸潤(rùn)；與Control組相比，ISO組心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大，炎性浸潤(rùn)嚴(yán)重；與ISO組相比，Col組心肌細(xì)胞排列趨于整齊，心肌細(xì)胞肥大、炎性浸潤(rùn)得到明顯改善(見(jiàn)圖2)。

3.4 小鼠左心室心肌細(xì)胞的凋亡情況 Tunnel染色結(jié)果顯示，與Control組相比，ISO組心肌細(xì)胞凋亡率升高了近5倍(P<0.05)；與ISO組相比，Col組心肌細(xì)胞凋亡率降低了約82.70 %(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

3.5 小鼠左心室組織中cTnI的蛋白表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，ISO組左心室組織中cTnI蛋白的表達(dá)增加了23.04%(P<0.05)；給予Col后，Col組左心室組織中cTnI蛋白的表達(dá)減少了19.86%(P<0.05，見(jiàn)圖4)。提示Col可改善ISO引起的心肌細(xì)胞損傷。

3.6 左心室組織中Bcl-2的表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，ISO組左心室組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)減少了27.12%(P<0.05)；給予Col后，Col組左心室組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)增加了24.04%(P<0.05，見(jiàn)圖5)。

3.7 左心室組織中Cleaved-caspase3的表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，ISO組左心室組織中Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)增加了18.20%(P<0.05)；給予Col后，Col組左心室組織中Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)減少27.80%(P<0.05,見(jiàn)圖6)。

4 討論

心肌損傷能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，過(guò)多的心肌細(xì)胞凋亡是引起心臟功能紊亂以及結(jié)構(gòu)改變的重要因素[12]。ISO可導(dǎo)致動(dòng)物心肌缺血、缺氧，引起心肌細(xì)胞凋亡等[13]。cTn I是評(píng)價(jià)心肌損傷的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，ISO模型小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)明顯增加；左心室心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大，并伴有炎性浸潤(rùn)；cTn I蛋白水平明顯上調(diào)，表明ISO成功誘導(dǎo)小鼠心肌損傷的發(fā)生。給予Col后，小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)降低，左心室心肌細(xì)胞排列趨于整齊；心肌細(xì)胞形態(tài)、炎性浸潤(rùn)得到明顯改善，且左心室組織的cTn I蛋白水平明顯降低，提示Col可減輕ISO誘導(dǎo)的心肌損傷。Tunnel染色是評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法。在凋亡的細(xì)胞中，DNA內(nèi)切酶被激活，將核小體間的基因組DNA切斷為180～200 bp的DNA片段，DNA片段暴露出的3′-OH可在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)的催化下與綠色熒光探針熒光素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶(dUTP)結(jié)合，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞呈綠色熒光。正常細(xì)胞較少發(fā)生DNA斷裂。在正置熒光顯微鏡下根據(jù)綠色熒光細(xì)胞數(shù)量的多少，可觀察各組心肌細(xì)胞凋亡的情況。本研究通過(guò)Tunnel染色發(fā)現(xiàn)：ISO組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，給予Col后，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯下降，提示Col能明顯改善ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，其結(jié)構(gòu)包括C端結(jié)構(gòu)域以及Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域(Bcl-2 homology，BH)1-4。Bcl-2可通過(guò)C端結(jié)構(gòu)域定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等外膜，BH1、BH2、BH3能夠形成疏水凹槽，促進(jìn)Bcl-2二聚化，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[3]。研究表明，Bcl-2蛋白水平降低，抗凋亡作用減弱，引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[14]。心肌細(xì)胞凋亡途徑的精密調(diào)控離不開(kāi)Caspase家族，它們?cè)谛募〖?xì)胞的凋亡過(guò)程中分工明確，包括起始型Caspase、效應(yīng)型Caspase等。Caspase3屬于效應(yīng)型Caspase，Caspase3被激活后經(jīng)切割分離為Cleaved-caspase3，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡小體的形成，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[15]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2可調(diào)節(jié)線粒體膜通透性，引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，ISO組Bcl-2蛋白水平下調(diào)，Cleaved-caspase3蛋白水平上調(diào)，給予Col后，Bcl-2蛋白水平上調(diào)，Cleaved-caspase3蛋白水平下調(diào)。以上結(jié)果提示：Col可通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白水平，下調(diào)Cleaved-caspase3蛋白水平，減輕ISO導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Col能改善ISO所致心肌損傷，其機(jī)制至少與其上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Cleaved-caspase3的激活，減少心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)。