朱田雨，宗春燕，許詩(shī)瓊，葛盛芳，范先群，賈仁兵

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院眼科，上海 200011；2.上海市眼眶病眼腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200011

結(jié)膜黑色素瘤（conjunctival melanoma，CoM）是罕見(jiàn)的眼部惡性腫瘤，具有較高的死亡率。研究［1］表明，CoM 患者在初始治療后10 年的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和死亡率可分別高達(dá)60%、50%和50%。因此，識(shí)別CoM預(yù)后危險(xiǎn)因素具有重要的臨床意義［2］。

CoM 的預(yù)后目前廣泛采用美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）的第8版分期系統(tǒng)來(lái)評(píng)估［3］。以往的研究主要集中在臨床特征對(duì)CoM 預(yù)后的影響。近年來(lái)的研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，Breslow 厚度較厚、組織學(xué)潰瘍等組織病理學(xué)特征也與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。此外，Ki-67 作為腫瘤增殖活性的經(jīng)典評(píng)價(jià)指標(biāo)，也在腫瘤預(yù)后的判斷中具有重要價(jià)值。迄今為止，未見(jiàn)CoM中Ki-67指數(shù)和預(yù)后關(guān)系的研究報(bào)道［6］。鑒于此，本研究納入36 例CoM 患者，探討其組織病理學(xué)特征、Ki-67 表達(dá)在CoM 預(yù)后評(píng)估（包括局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和疾病特異性死亡）中的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2008年8月—2020年9月就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院眼科的36 例CoM 患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)切除病變組織，組織病理學(xué)確診為CoM的患者。②臨床和組織病理學(xué)資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)診斷為非CoM（例如原發(fā)性眼眶黑色素瘤、淚囊黑色素瘤等）的患者。②隨訪時(shí)間過(guò)短（<6個(gè)月）。③資料收集不完整。

36例患者中，有18例（50.0%）接受局部腫瘤切除術(shù)輔以冰凍治療，其中2 例接受了局部化學(xué)治療；另外18例患者（50.0%）接受了眶內(nèi)容物剜除術(shù)，其中6 例輔以放射治療。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中有11例（30.6%）接受了頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)。

1.2 資料收集

收集患者的臨床資料和組織病理學(xué)信息。臨床資料包括性別、年齡、眼別、診斷日期、發(fā)病部位（累及淚阜、穹窿、瞼結(jié)膜、眼眶），以及初次來(lái)我院就診時(shí)是否復(fù)發(fā)（復(fù)發(fā)時(shí)間）、轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移時(shí)間、轉(zhuǎn)移部位、局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）等。對(duì)手術(shù)切除的組織標(biāo)本切片行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E 染色），讀取組織病理學(xué)特征，包括Breslow 厚度、組織學(xué)潰瘍、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrated lymphocytes，TILs）、組織學(xué)消退、有絲分裂率、外周神經(jīng)侵犯、血管浸潤(rùn)、垂直生長(zhǎng)期、微衛(wèi)星灶和組織學(xué)類型；并將Ki-67 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行記錄。所有患者的病理H-E染色切片均經(jīng)我院病理科會(huì)診、復(fù)核，且由2 位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立閱片和評(píng)估。

1.3 病理學(xué)特征判定

判定標(biāo)準(zhǔn)［5，7-8］如下。組織學(xué)潰瘍的定義是在無(wú)外傷或近期手術(shù)的情況下，周圍上皮變薄、消失或出現(xiàn)反應(yīng)性增生，上皮缺損，纖維蛋白沉積和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。組織學(xué)消退現(xiàn)象的特征是腫瘤細(xì)胞被淋巴細(xì)胞取代，以及上皮細(xì)胞的衰減和纖維化與炎癥細(xì)胞、噬黑色素細(xì)胞浸潤(rùn)和毛細(xì)血管擴(kuò)張。有絲分裂率的讀取方法是：首先是在基質(zhì)或結(jié)膜下層組織中找到有絲分裂像最多的區(qū)域，在計(jì)算初始區(qū)域的有絲分裂數(shù)后，擴(kuò)展到相鄰的非重疊區(qū)域，直到評(píng)估對(duì)應(yīng)于1 mm2的組織區(qū)域。TILs是包圍和破壞侵襲性腫瘤細(xì)胞的淋巴細(xì)胞，可分為“活躍”“不活躍”和“不存在”3 種狀態(tài)。TILs 為“活躍”狀態(tài)表示整個(gè)瘤床內(nèi)彌漫著淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；“不活躍”指僅局灶區(qū)域有TILs；“不存在”為瘤床內(nèi)無(wú)TILs。顯微鏡下的微衛(wèi)星灶是指在觀察到的毗鄰但不連續(xù)或深至原發(fā)腫瘤部位的灶轉(zhuǎn)移。Ki-67 指數(shù)是指核染色陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞總數(shù)占所有腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比，染色陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核上出現(xiàn)棕紅色顆粒。每張切片選取5 個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，分別記錄每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)及腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)，各自取平均值作為陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)和腫瘤細(xì)胞總數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不符合正態(tài)分布的定量資料包括Breslow 厚度和有絲分裂率，用M（Min～Max）表示。定性資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。使用二元Logistic 模型確定預(yù)后危險(xiǎn)因素，用95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）的比值比（odds ratio，OR）和風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）描述危險(xiǎn)因素的影響。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。利用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，并通過(guò)對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（log rank test）進(jìn)行比較，Z 檢驗(yàn)法用于比較Ki-67 指數(shù)≤20%和>20%患者的3年無(wú)復(fù)發(fā)生存率。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床及組織病理學(xué)特征

36例CoM患者中男性26例（72.2%），女性10例（27.8%）。所有患者皆為單眼發(fā)病。平均年齡57.81（31～82）歲，平均隨訪時(shí)間40.15（8～146）個(gè)月。發(fā)病位于淚阜11 例（30.6%）、穹窿8 例（22.2%）、瞼結(jié)膜15 例（41.7%）。CoM 瘤體Breslow 厚度為4.05（0.2～15.9）mm，有絲分裂率為7（0～35）/mm2?；颊咂渌呐R床與組織病理學(xué)特征情況如表1所示。35例（97.2%）處于垂直生長(zhǎng)期，而僅有1例（2.8%）觀察到顯微鏡下微衛(wèi)星灶。

表1 CoM患者臨床及組織病理學(xué)特征Tab 1 Characteristics and histopathological features of CoM patients

2.2 組織病理學(xué)因素與預(yù)后的關(guān)系

二元Logistic回歸分析結(jié)果顯示（表2），Breslow厚度較厚提示CoM 局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高（P=0.017）。具體而言，Breslow 厚度>4 mm 提示局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（P=0.049）和疾病特異性死亡風(fēng)險(xiǎn)（P=0.049）更高。組織學(xué)潰瘍也提示局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高（P=0.030）。此外，組織學(xué)消退現(xiàn)象與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)（P=0.046）。

表2 二元Logistic分析組織病理學(xué)因素與預(yù)后的關(guān)系Tab 2 Binary Logistic regression analysis of the relationship between histopathological factors and prognosis

2.3 Ki-67指數(shù)與組織病理學(xué)因素和預(yù)后的關(guān)系

Ki-67 指數(shù)與Breslow 厚度、組織學(xué)潰瘍、TILs、消退現(xiàn)象、外周神經(jīng)侵犯和血管浸潤(rùn)均無(wú)關(guān)，與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和疾病特異性死亡等預(yù)后因素?zé)o關(guān)，與局部復(fù)發(fā)相關(guān)（P=0.016，表3）。對(duì)Ki-67指數(shù)（>20%或≤20%）、Breslow 厚度（>4 mm 或≤4 mm）、潰瘍有無(wú)、TILs有無(wú)、組織學(xué)消退有無(wú)、外周神經(jīng)侵犯有無(wú)、血管浸潤(rùn)有無(wú)、局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、疾病特異性死亡和臨床T分期之間進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。相關(guān)系數(shù)r值顯示于各圖塊中，絕對(duì)值大小表示相關(guān)性程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ki-67 指數(shù)與局部復(fù)發(fā)呈顯著正相關(guān)（r=0.433，圖1）。

圖1 各組織病理學(xué)因素與預(yù)后的相關(guān)性熱圖Fig 1 Heat map of the correlation between histopathological factors and prognosis

表3 Ki-67指數(shù)與組織病理學(xué)因素及預(yù)后的關(guān)系Tab 3 Correlation of Ki-67 index with histopathological factors and prognosis

Continued Tab

2.4 Ki-67指數(shù)與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)

Kaplan-Meier 生存曲線（圖2）顯示，Ki-67 指數(shù)>20%的患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著升高［HR=3.61；95%CI（1.26～10.28）；Log rankP=0.011］。Ki-67 指數(shù)≤20%的患者3 年無(wú)復(fù)發(fā)生存率為63.8%，而Ki-67 指數(shù)>20%的患者3年無(wú)復(fù)發(fā)生存率顯著降低，僅為21.4%，2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028）。

圖2 Ki-67≤20%和>20%的無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線分析Fig 2 Analysis of recurrence-free survival curve of Ki-67≤20%and>20%

3 討論

CoM 產(chǎn)生于結(jié)膜上皮基底層的非典型黑色素細(xì)胞，可由原發(fā)性獲得性黑變?。╬rimary acquired melanosis，PAM）或色素痣惡變而來(lái)，或表現(xiàn)為原發(fā)病變［9］，約占眼部腫瘤的5%［10］。原位CoM 的一線治療是局部手術(shù)切除輔以局部治療［11-12］，但目前沒(méi)有轉(zhuǎn)移性CoM 的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。鑒于CoM 和皮膚黑色素瘤在分子和病理背景上的相似性，用于治療轉(zhuǎn)移性皮膚黑色素瘤的靶向藥物可能對(duì)轉(zhuǎn)移性CoM 有益［13］。然而，患者即使進(jìn)行積極治療，在初始治療后10 年復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和死亡率仍居高不下［1］。因此，探究CoM 預(yù)后危險(xiǎn)因素，對(duì)改進(jìn)治療方案具有重要意義。

本研究中，患者發(fā)病部位包括淚阜、穹窿、瞼結(jié)膜，其中以瞼結(jié)膜受累最常見(jiàn)（15 例，41.7%）。根據(jù)AJCC 第8 版臨床T 分期系統(tǒng)，12 例患者（33.3%）為T2 期，23 例患者（63.9%）為T3 期，說(shuō)明大部分患者就診時(shí)已處于較晚期階段。

組織病理學(xué)特征方面，Breslow 厚度中位數(shù)為4.05 mm，其中18 例患者（50.0%） Breslow 厚度>4 mm，提示該隊(duì)列的整體Breslow 厚度較厚，可能與患者處于較晚期階段有關(guān)。組織學(xué)潰瘍出現(xiàn)在13 例患者（36.1%）中。Breslow 厚度和潰瘍是AJCC 第8版病理T分期系統(tǒng)的重要評(píng)判指標(biāo)。作為黑色素瘤中最重要的組織病理學(xué)因素，Breslow 厚度和潰瘍?cè)谄つw黑色素瘤中被認(rèn)為與不良預(yù)后相關(guān)。ESMAELI等［4］發(fā)現(xiàn)，Breslow 厚度和潰瘍與CoM 的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和疾病相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，強(qiáng)調(diào)應(yīng)把潰瘍納入界定T1 和T2 期的CoM 分期標(biāo)準(zhǔn)。JIA 等［8］也指出，CoM 中Breslow 厚度較厚或有組織學(xué)潰瘍的患者有更高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，Breslow 厚度與CoM 局部復(fù)發(fā)和疾病相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，組織學(xué)潰瘍是局部復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，即Breslow 厚度較厚和組織學(xué)潰瘍與CoM不良預(yù)后相關(guān)。

有絲分裂率是腫瘤增殖的重要指標(biāo)，以每平方毫米區(qū)域內(nèi)有絲分裂數(shù)來(lái)衡量。在皮膚黑色素瘤AJCC 第7 版分期系統(tǒng)中，也曾使用有絲分裂率來(lái)確定T1 期皮膚黑色素瘤的轉(zhuǎn)移高危程度［14］。在多項(xiàng)研究［15-16］中，有絲分裂率被認(rèn)為是皮膚黑色素瘤中一個(gè)顯著的不利因素。本組病例的有絲分裂率中位數(shù)為7/mm2。盡管分析發(fā)現(xiàn)，有絲分裂率與局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和疾病相關(guān)死亡均無(wú)顯著相關(guān)性，但有絲分裂率在CoM 中的預(yù)后價(jià)值仍有待進(jìn)一步探究。

TILs 是包圍和破壞侵襲性腫瘤細(xì)胞的淋巴細(xì)胞，被分為“活躍”“不活躍”和“不存在”3 種狀態(tài)［7］。本研究中共有4 例患者（11.1%）TILs 處于“活躍”狀態(tài)，26 例（72.2%）處于“不活躍”狀態(tài)，僅有6例CoM患者不存在TILs，與ESMAELI等［4］的研究結(jié)果類似；在該研究中，TILs 有4 例（5%）判定為“活躍”，61例（69%）為“不活躍”，其余為“未知”狀態(tài)，即大多數(shù)（74%）CoM 病例也存在TILs，提示CoM與抗腫瘤免疫的激活可能有一定相關(guān)性。

針對(duì)皮膚黑色素瘤的研究［17］表明，組織學(xué)消退與較高的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)；但也有研究［18-19］認(rèn)為，消退是有利的預(yù)后因素或與結(jié)局無(wú)關(guān)。本研究中，7例CoM 患者出現(xiàn)組織學(xué)消退，并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。消退的組織學(xué)特征是黑色素瘤細(xì)胞減少，反映了宿主的免疫反應(yīng)，包括炎癥浸潤(rùn)、黑色素吞噬和毛細(xì)血管擴(kuò)張等［7］。BASTIAN 等［20］認(rèn)為，盡管消退期間的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)能夠清除黑色素瘤細(xì)胞，但它也可能導(dǎo)致抗原變異，并觸發(fā)免疫逃逸機(jī)制。這也解釋了為什么在我們的研究中，消退現(xiàn)象是一個(gè)不利的預(yù)后因素。

Ki-67 是一種增殖細(xì)胞的相關(guān)核抗原，在細(xì)胞周期S、G1、G2和M 期均有表達(dá)（G0期缺如），是反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的可靠指標(biāo)［21］。我們發(fā)現(xiàn)Ki-67指數(shù)>20% 與CoM 更高的局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，與JAKOBIEC 等［22］研究結(jié)果相似。Ki-67 指數(shù)被證明有助于區(qū)分結(jié)膜黑色素痣和CoM，結(jié)膜黑色素痣中Ki-67 指數(shù)的平均值為1.89%，顯著低于CoM 的17.3%［22］。本研究中Ki-67 指數(shù)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和疾病相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，提示Ki-67 可作為一個(gè)早期的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)，指導(dǎo)臨床工作中對(duì)Ki-67 指數(shù)較高的患者進(jìn)行密切隨訪，及時(shí)監(jiān)測(cè)患者病情，減少局部復(fù)發(fā)的發(fā)生。

本研究的不足之處在于病例數(shù)量限制，尚缺乏有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù)，因此仍需擴(kuò)大隊(duì)列深入探究。綜上所述，本研究對(duì)36 例CoM 的臨床和病理資料進(jìn)行總結(jié)，分析了預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素。Breslow厚度較厚、潰瘍、消退現(xiàn)象和Ki-67>20%提示CoM 預(yù)后不良。CoM 復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和死亡率較高，因此準(zhǔn)確分期并結(jié)合病理學(xué)特征對(duì)患者預(yù)后做出判斷，有助于治療方案的選擇和優(yōu)化。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究遵守《赫爾辛基宣言》的宗旨，并經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（SH9H-2019-T185-2）。研究對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

This study was conducted in accordance withDeclaration of Helsinki， and was reviewed and approved by The Ethics Committee of the Ninth People's Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （SH9H-2019-T185-2）. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

朱田雨、宗春燕參與了臨床及病理學(xué)資料的收集和統(tǒng)計(jì)工作；朱田雨、許詩(shī)瓊、賈仁兵參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The characteristics and histopathological data and statistics work was done by ZHU Tianyu and ZONG Chunyan. The manuscript was drafted and revised by ZHU Tianyu， XU Shiqiong and JIA Renbing.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-19

·Accepted：2022-05-25

·Published online：2022-05-28