朱嘯巍，詹飛霞，張 超，劉時華，鐘 平，曹 立，欒興華

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院神經(jīng)內科，上海 200030；2.安徽醫(yī)科大學附屬宿州醫(yī)院神經(jīng)內科，宿州 234000

周圍髓鞘蛋白22（peripheral myelin protein-22，PMP22）基因位于染色體17p11.2，長度為40 kb，由人類保守的6 個外顯子組成。該基因的熱點突變集中在CMT1A-REP 序列，由染色體17p11.2 近端和遠端的2 個大小為24 kb 的序列組成，位于1.5 Mb 區(qū)域的兩側，該區(qū)多以重復突變或缺失突變?yōu)橹鳎?］。

PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病是一組以PMP22基因突變導致的遺傳性周圍神經(jīng)病。PMP22基因突變主要有3種致病突變類型，包括PMP22重復突變、缺失突變及點突變。不同突變類型可導致不同疾病表型。PMP22重復突變可導致腓骨肌萎縮癥1A 型（Charcot-Marie-Tooth type-1A， CMT1A； OMIM #118220）；PMP22缺失突變可導致遺傳性壓迫易感性神經(jīng)病（hereditary neuropathy with liability to pressure palsies，HNPP；OMIM#162500）；PMP22基因點突變可導致CMT1A 或CMT1E（OMIM #118300）以及Dejerine-Sottas 綜 合 征 （Dejerine-Sottas syndrome， DSS；OMIM #145900） 和Roussy-Levy 綜 合 征（Roussy-Levy syndrome，RLS；OMIM #180800）等其他周圍神經(jīng)?。?-3］。在所有PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病中，CMT1A 最常見（約占79%），其次為HNPP（約占16%），DSS約占3%，CMT1E約占2%［2］。

腓骨肌萎縮癥（Charcot-Marie-Tooth，CMT）是一組臨床表型類似的遺傳異質性疾病，50%以上的CMT病例是CMT1A［4-5］。CMT1A 是一種常染色體顯性疾病，通常是由染色體17p11.2 上1.5 Mb 區(qū)域不均等交叉的非等位基因同源重組所致。其主要臨床特點是對稱性、緩慢進行性肢體遠端肌肉無力，肌肉萎縮，感覺減退，腱反射減弱或消失［5］。HNPP 呈常染色體顯性遺傳，其典型的臨床表現(xiàn)是反復發(fā)作的急性無痛性、短暫性、壓力性神經(jīng)麻痹，與壓迫或輕微牽拉有關［6］。也有PMP22基因突變相關的罕見表型，如DSS 與RLS，他們是CMT1A 的2 種變異表型［7-12］。經(jīng)典的表型很容易識別，但非典型表型的診斷仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。

本研究通過分析59 例PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病患者的臨床和遺傳學特點，旨在擴展PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病臨床表型及基因型，以期為疾病診斷及遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

從2006 年—2022 年上海交通大學醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院神經(jīng)內科收治的162 例周圍神經(jīng)病患者中，經(jīng)基因檢測篩選出26 例PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病先證者及其33 例家系成員患者作為研究對象。收集先證者及家系成員的臨床資料，包括人口學數(shù)據(jù)、臨床表現(xiàn)、電生理特點、病理學特點等。所有研究對象均簽署知情同意書。本研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批編號2021-219）。

1.2 基因檢測

采集先證者及相關家系成員外周靜脈血樣本（3 mL），標準的苯酚-氯仿方案提取基因組DNA，應用多重連接依賴的探針擴增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA） 檢測PMP22基因大片段缺失、重復突變。對MLPA結果陰性的患者行全外顯子測序（whole exon sequencing，WES），對發(fā)現(xiàn)PMP22基因突變的先證者行Sanger 測序及家系共分離驗證。采用Phyre2 網(wǎng)站預測PMP22 的結構。采用University of California Santa Cruz（UCSC）數(shù)據(jù)庫（https：//genome.ucsc.edu）對測得的點突變位點予以不同物種保守性分析。根據(jù)突變類型不同，將PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病患者分為3 組，即PMP22重復突變、PMP22缺失突變和PMP22點突變。

1.3 神經(jīng)電生理檢查

12 例PMP22重復突變和4 例PMP22缺失突變共16 例PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病患者用肌電圖誘發(fā)電位儀（KeyPoint Focus，丹麥丹迪）檢測；檢測內容包括雙側正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)或腓腸神經(jīng)的運動神經(jīng)傳導速度（motor nerve conduction velocities，MCV）、復合肌肉動作電位波幅（compound muscle action potentials，CMAP）、感覺神經(jīng)傳導速度（sensory nerve conduction velocities，SCV）；檢測結果由至少2 位神經(jīng)電生理專業(yè)醫(yī)師評估。正中神經(jīng)刺激點選擇腕-拇短展?。╝bductor pollicis brevis，APB）與肘-腕，尺神經(jīng)刺激點選擇腕-小指展?。╝bductor digiti minimi，ADM）與肘下-腕，脛神經(jīng)刺激點選擇踝-拇展?。╝bductor hallucis，AH），腓總神經(jīng)或腓腸神經(jīng)刺激點選擇踝-趾短伸?。╡xtensor digitorum brevis，EDB）。比較PMP22重復和缺失突變患者正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)或腓腸神經(jīng)雙側的MCV、CMAP、SCV 差異是否具有統(tǒng)計學意義，并分析PMP22重復和缺失突變2組間上述指標的差異。

1.4 病理學檢查

12 例PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病患者行腓腸神經(jīng)活檢，其中2 例行腓腸神經(jīng)和肌肉聯(lián)合活檢。周圍神經(jīng)組織石蠟包埋，肌肉組織液氮及異戊烷冷凍，7 μm 切片。切片經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H-E）染色、改良Gomori 三色法（modified gomori trichrome，MGT）染色、剛果紅染色，以及CD3 抗體（za-0503，北京中杉金橋生物技術有限公司；1∶200）、CD20 抗體（ab-64088，美國Abcam 公司；1∶1 000）和CD68抗體（zm-0464，北京中杉金橋生物技術有限公司；1∶200）免疫組織化學（免疫組化）染色。神經(jīng)透射電鏡標本在2.5%戊二醛和1%鋨酸中固定，然后嵌入環(huán)氧樹脂。用檸檬酸鉛電子染色后，電子顯微鏡觀察超薄切片。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。定量資料先通過K-S檢驗判斷正態(tài)性，正態(tài)資料用±s表示并采用獨立樣本t檢驗，偏態(tài)資料用M（P25，P75）表示并采用Mann-Whitney 檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 遺傳學特點

通過MLPA、全外顯子測序和Sanger 測序發(fā)現(xiàn)PMP22基因突變的周圍神經(jīng)病患者共59 例，包括13個家系患者共46 例，和13 例散發(fā)病例。其中PMP22重復突變51 例（86.4%），診斷為CMT1A；其主要來自12個家系（圖1A），余7例為散發(fā)病例。PMP22缺失突變6 例（10.2%），診斷為HNPP；其中2 例來自1個家系（圖1B），余4 例為散發(fā)病例。PMP22雜合點突變2例（3.4%），突變位點分別為c.C215T（p.S72L）和c.C215T（p.G100V）（圖1C～E），診斷為DSS。根據(jù)2015 年美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會基因變異解讀標準和指南（American College of Medical Genetics and Genomics， ACMG）［13］， p. S72L 和p.G100V 均為“可能致病”（likely pathogenic），2 例PMP22點突變位點在不同物種高度保守（圖1F）。

圖1 家系圖及基因突變分析Fig 1 Family pedigrees and analysis of gene mutation

2.2 臨床特點

2.2.1 人口學數(shù)據(jù) 59 例PMP22基因異常的患者中，男性37 例，女性22 例，男女比例1.7∶1。就診時年齡40.0（23.0，47.0）歲，發(fā)病年齡34.0（14.0，49.5）歲，發(fā)病年齡小于10 歲者7 例，從發(fā)病到確診病程6.000（2.750，14.750）年。

在26 例PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病先證者中，19 例PMP22重復突變先證者的發(fā)病年齡為40.0（25.0，49.0）歲，發(fā)病年齡小于10歲者3例，從發(fā)病到此次確診病程5.00（3.50，8.50）年。5 例PMP22缺失突變先證者的發(fā)病年齡為15.0（14.0，24.0）歲，從發(fā)病到此次確診病程0.088（0.034，2.103）年。2例PMP22點突變先證者均于出生后數(shù)月發(fā)病。從發(fā)病到此次確診病程分別為12與20年。

2.2.2 臨床表現(xiàn) 對先證者的臨床癥狀進一步分析（圖2）。在19 例PMP22重復突變先證者中，首發(fā)癥狀為肢體無力者13 例（68.4%）、肢體麻木3 例（15.8%）、肢體無力合并肢體麻木3 例（15.8%）。PMP22重復突變先證者中存在四肢末梢型感覺障礙7例（36.8%）、雙上肢肌力減退11 例（57.9%）、雙下肢肌力減退16 例（84.2%），以肢體遠端握力減退或足背屈無力為常見表現(xiàn)。11 例（57.9%）患者存在不同程度的肌肉萎縮，以雙手骨間肌萎縮多見，嚴重者雙膝關節(jié)以下肌肉極度萎縮，呈“鶴腿樣”。16 例存在四肢腱反射減低（84.2%）、5 例存在雙手震顫（26.3%）、1 例出現(xiàn)雙眼輕度短暫水平眼震（5.3%）?？玳摬綉B(tài)5 例（26.3%）、弓形足畸形6 例（31.6%），足內翻畸形2 例（10.5%）。所有PMP22重復突變患者未出現(xiàn)爪形手畸形、脊柱側彎畸形、共濟失調等臨床癥狀。

圖2 PMP22基因重復突變和缺失突變先證者的臨床特點Fig 2 Clinical features of probands with PMP22 duplication and deletion mutations

在5 例PMP22缺失突變的先證者中，4 例（80.0%）患者因足下垂就診、1例（20.0%）患者因右手麻木無力就診，患者癥狀較輕。存在四肢末梢型感覺障礙2例（40.0%）、雙上肢肌力減退2例（40.0%）、雙下肢肌力減退2 例（40.0%），出現(xiàn)右手虎口、大小魚際、骨間肌肌肉萎縮1 例（20.0%）。四肢腱反射減低2例（40.0%）、跨閾步態(tài)1例（20.0%）。

2 例PMP22點突變患者的首發(fā)癥狀為四肢無力，病程長，臨床癥狀重，均存在肌肉萎縮、四肢肌力減退、腱反射消失。其中1 例患者有馬蹄足畸形和四肢末梢型感覺減退，另1 例患者有嚴重的脊柱側彎畸形。

2.2.3 電生理特點 16 例PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病患者進行神經(jīng)電生理檢測，均以脫髓鞘病變?yōu)橹?。與正常參考值相比，12 例PMP22重復突變的患者MCV 明顯減慢，SCV 減慢或未引出，CMAP 波幅明顯降低或未引出。與正常參考值相比，神經(jīng)傳導速度減低及CMAP 波幅下降多呈對稱性，部分患者肌電圖可見纖顫波。PMP22缺失突變的4位先證者肌電圖呈脫髓鞘性周圍神經(jīng)病變，可伴有軸索損害（50.0%），以單一運動神經(jīng)局部脫髓鞘為主要改變。其中，尺神經(jīng)MCV 減慢者占50.0%，CMAP 波幅下降者占37.5%；腓總神經(jīng)MCV 減慢者占87.5%，CMAP 波幅下降者占25.0%，提示神經(jīng)傳導阻滯。正中神經(jīng)SCV 均減慢，波幅下降者占50.0%；尺神經(jīng)SCV均減慢，波幅均下降。

與PMP22缺失突變患者相比（表1），PMP22重復突變患者在左右兩側的正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)的MCV、CMAP、SCV 明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在PMP22的2 種突變表型中，左右肢體MCV、CMAP、SCV 未見明顯差異（P>0.05），表現(xiàn)為對稱性神經(jīng)病變。

表1 PMP22重復突變和缺失突變患者的電生理參數(shù)比較Tab 1 Comparison of electrophysiological parameters between PMP22 duplication group and PMP22 deletion group

Continued Tab

2.2.4 病理特點 對8 例PMP22重復突變、3 例PMP22缺失突變和1 例PMP22點突變患者行腓腸神經(jīng)活檢，其中2 例PMP22重復突變患者行腓腸神經(jīng)和腓腸肌聯(lián)合活檢。在光學顯微鏡下，MGT 染色可見有髓神經(jīng)脫髓鞘，H-E 及CD3、CD20、CD68免疫組化染色未見明顯炎性細胞浸潤，也未見淀粉樣物質沉積。透射電鏡下觀察，8 例PMP22重復突變患者腓腸神經(jīng)活檢可見髓神經(jīng)纖維密度程度降低，伴大量有髓神經(jīng)纖維的“洋蔥球樣”結構出現(xiàn)，部分患者的無髓神經(jīng)纖維密度減少（圖3A）。2 例PMP22重復突變的腓腸肌活檢可見散在和成組分布的小角狀萎縮肌纖維，呈群組化現(xiàn)象，提示神經(jīng)源性肌肉病變。3 例PMP22缺失突變患者腓腸神經(jīng)活檢可見有髓神經(jīng)纖維密度輕度降低，伴個別有髓神經(jīng)纖維髓鞘增厚（圖3B）。1 例PMP22點突變患者腓腸神經(jīng)活檢可見慢性重度脫髓鞘性周圍神經(jīng)病病理改變，也見大量“洋蔥球樣”有髓神經(jīng)纖維。

3 討論

PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病是一組因PMP22基因突變所導致的遺傳性周圍神經(jīng)病，其臨床表現(xiàn)和嚴重程度在同一家族成員或不同家系間存在差異；一些家族成員臨床無癥狀，僅在家系篩查時被診斷［2，14］。與PMP22重復突變的患者相比，PMP22缺失突變的HNPP 患者癥狀相對較輕，發(fā)病早，病程較短［6，15］。僅有少數(shù)患者有嚴重殘疾，見于PMP22點突變患者。既往研究［16］表明，PMP22點突變比重復突變或缺失突變引起的臨床癥狀更為嚴重，可表現(xiàn)為DSS 表型。疼痛是CMT1A 患者常見的主訴，55%～70%的CMT1A 患者會出現(xiàn)疼痛，主要局限于足部，呈神經(jīng)性或肌肉性疼痛［17］。但在本研究中，僅有1例PMP22重復突變患者（散發(fā)病例）在病程中出現(xiàn)疼痛。疼痛的病因并不明確，可能與病程、行走的姿勢異常、感覺或自主神經(jīng)病變等因素有關。PMP22缺失突變所致的HNPP 表型以感覺運動性神經(jīng)病最多見，通常無疼痛表現(xiàn)。有2 例PMP22缺失突變的HNPP 患者，臨床表現(xiàn)不典型，在基因檢測診斷之前擬診斷為CMT，說明HNPP 表型具有明顯的臨床異質性，易被誤診。

PMP22 蛋白在周圍神經(jīng)中高度表達，是髓鞘磷脂的跨膜糖蛋白成分，具有協(xié)調髓鞘磷脂的功能。PMP22 蛋白通過適當?shù)慕Y構折疊和調節(jié)參與維持Schwann 細胞的穩(wěn)態(tài)［18-20］。PMP22基因劑量效應是導致CMT1A 和HNPP 的重要機制。CMT1A 患者皮膚活檢、腓腸神經(jīng)活檢中的PMP22mRNA 和蛋白水平升高，而HNPP 患者上述水平降低，支持了這一觀點［18-21］。染色體內和染色體間的作用也可以調節(jié)基因的結構和表達。PMP22重復的DNA 可能會打亂正?；蚪M的結構和表達，導致PMP22轉錄不穩(wěn)定，引起PMP22 表達的失調，這可以解釋一些PMP22基因重復突變患者即使PMP22mRNA 和蛋白水平處于正常范圍內，仍然存在典型CMT1A 的臨床癥狀［22］。在HNPP 患者中，PMP22 蛋白缺乏會導致連接蛋白復合體移位，破壞髓鞘間的緊密連接和黏著連接，致使鞘磷脂過度滲透，髓鞘通透性異常增加，抑制動作電位的傳遞，導致可逆性神經(jīng)傳導阻滯；可逆性神經(jīng)傳導阻滯是HNPP 臨床癥狀反復緩解、復發(fā)的基礎［23］。

本研究2 例PMP22點突變的患者均為DSS 表型，患者分別攜帶p.S72L 和p.G100V 突變。既往曾有p. S72P 和p. S72W 突 變 所 致DSS 的 報 道［24-25］。p.G100V 突變則可表現(xiàn)為DSS 和CMT 2 種臨床類型［11-12］。DSS是CMT1疾病譜中的一種特殊表型，其發(fā)病早、癥狀重、進展快，主要的遺傳方式為常染色體隱性遺傳，偶有常染色體顯性遺傳。PMP22點突變導致的表型可從輕度的HNPP表型到DSS和先天性髓鞘形成障礙性神經(jīng)?。╟ongenital hypomyelinating neuropathy，CHN） 等重度早發(fā)性髓鞘障礙神經(jīng)?。?6-27］，具有高度臨床異質性。

神經(jīng)電生理是評價神經(jīng)功能的有效檢查手段。本研究顯示MCV、CMAP、SCV在左右肢體中差異未見統(tǒng)計學意義，表現(xiàn)為對稱性神經(jīng)病變［28］。PMP22重復突變患者的左右正中運動神經(jīng)平均MCV分別為（18.943±3.114）和（18.529±4.095）m/s，與既往研究結果（約為20 m/s）接近［29］。個別CMT1A患者出現(xiàn)了神經(jīng)傳導阻滯，表現(xiàn)為對稱性多部位神經(jīng)傳導阻滯；而HNPP患者表現(xiàn)為局灶性運動和SCV減慢，以尺神經(jīng)多見。本研究發(fā)現(xiàn)2例臨床無癥狀者，經(jīng)電生理檢查發(fā)現(xiàn)脫髓鞘病變，通過PMP22基因檢測確診，提示在先證者家族成員中可優(yōu)先選擇電生理評估神經(jīng)傳導速度。

PMP22基因重復突變可導致髓鞘厚度增加、反復脫髓鞘和髓鞘再生，逐漸形成經(jīng)典的“洋蔥球樣”結構［30］。PMP22缺失突變患者的腓腸神經(jīng)活檢呈局灶性髓鞘增厚和節(jié)段性脫髓鞘，縱切面可見局部髓鞘增厚區(qū)域隆起，形似臘腸，故稱作“臘腸樣”結構［31］。PMP22點突變患者可出現(xiàn)類似PMP22重復突變形成的“洋蔥球樣”結構，從病理上不能將二者進行區(qū)分［32］。廣泛的有髓神經(jīng)“洋蔥球樣”改變是CMT1A 患者的病理特征，可在患兒6 歲后逐漸形成，可與其他周圍神經(jīng)病鑒別［33］。本研究部分PMP22重復突變患者（散發(fā)病例）的病理結果顯示有繼發(fā)性軸突變性表現(xiàn)。繼發(fā)性軸突變性是脫髓鞘神經(jīng)病變的常見特征，這一過程常與患者的行走異常和長期殘疾有關［34］。在PMP22缺失突變患者腓腸神經(jīng)中可見部分明顯增粗的有髓神經(jīng)纖維，符合髓鞘肥厚性周圍神經(jīng)病的病理改變。髓鞘縮短和異常增厚可導致HNPP 神經(jīng)傳導速度減慢，臨床表現(xiàn)嚴重的青年患者肌電圖也可出現(xiàn)神經(jīng)傳導速度顯著減慢［35］。

總之，本研究總結了PMP22基因相關性周圍神經(jīng)病的臨床特征，包括發(fā)病年齡、嚴重程度、家族內和家系間的異質性、神經(jīng)電生理特點及病理特點。臨床疾病譜的變化可能受到PMP22基因不同突變的影響，PMP22重復突變導致CMT1A，PMP22缺失突變導致HNPP，PMP22點突變導致DSS。對于神經(jīng)電生理和病理檢查呈脫髓鞘表現(xiàn)的患者，排除獲得性病因后，應予以PMP22基因拷貝數(shù)變異和點突變的基因檢測；對于家族中無癥狀者，可行神經(jīng)傳導速度篩查或PMP22基因檢測，從而有助于該病的優(yōu)化診斷以及遺傳咨詢。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究已通過上海交通大學醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會的審核批準（文件號2021-219）。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by the Ethics Committee of Shanghai Sixth People's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （approval letter No. 2021-219）. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻/Authors'Contributions

曹立、鐘平、欒興華參與了研究設計；朱嘯巍、詹飛霞參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by CAO Li， ZHONG Ping and LUAN Xinghua. The manuscript was drafted and revised by ZHU Xiaowei and ZHAN Feixia. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-12-06

·Accepted：2022-05-06

·Published online：2022-05-28