徐斐翔，汪 升，薛明明，童朝陽(yáng)，陳玉梅

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診科，上海 200032

心力衰竭是心血管疾病的終末階段，其患病率的不斷上升，對(duì)醫(yī)療保健系統(tǒng)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生巨大影響［1］。研究［2］表明，心肌細(xì)胞數(shù)量減少是心肌梗死等心肌損傷因素導(dǎo)致心力衰竭的主要原因。因此，提高心肌細(xì)胞增殖能力成了心臟疾病治療的關(guān)鍵。

近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long noncoding RNA，lncRNA）參與調(diào)控心肌細(xì)胞增殖，在心臟再生醫(yī)學(xué)中具有重要意義［3］。如lncRNA NR_045363 通過與微RNA（microRNA，miR）-216a的相互作用刺激心肌細(xì)胞增殖并改善心肌功能［4］。lncRNA of Dachshund Homolog 1（lncDACH1）在出生后的小鼠心臟中表達(dá)升高，心臟特異性過表達(dá)lncDACH1可抑制心臟再生，敲除lncDACH1可以重新激活心肌細(xì)胞增殖潛力；lncDACH1通過直接與蛋白磷酸酶1 催化亞基α 結(jié)合，增加心肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)心肌再生［5］。然而，現(xiàn)有l(wèi)ncRNA 數(shù)據(jù)資源有限，仍需大量研究探索其參與心肌細(xì)胞增殖的生物學(xué)功能和分子機(jī)制。

lncRNA-B230352I09 是一條功能未知的lncRNA，在新生1 d 的小鼠心臟組織高表達(dá)，但在7 d 的小鼠心臟組織中幾乎不表達(dá)［6］。相關(guān)研究［7］表明，出生1 d 的小鼠在心尖切除手術(shù)后心肌細(xì)胞仍具有增殖能力，損傷心肌能完全恢復(fù)；而出生7 d的小鼠接受同樣手術(shù)后，心肌細(xì)胞卻喪失了增殖的能力。因此，我們推測(cè)lncRNA-B230352I09 可能參與心臟再生過程。本研究擬通過H9C2 心肌細(xì)胞探索lncRNA-B230352I09 對(duì)心肌細(xì)胞增殖及周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 H9C2 細(xì)胞 鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.1.2 試劑與儀器 無(wú)菌超凈臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜（Thermofisher公司，美國(guó)），DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Gibco 公司，美國(guó)）；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、探針、定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（Life Technology公司，美國(guó)）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK8）、陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 3000 （Lipo3000）、5-乙 炔 基-2'-脫 氧 尿 嘧 啶（5-ethynyl-2'-deoxyuridine， EdU） 免 疫 熒 光 試 劑 盒（Invitrogen公司）；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（凱基生物公司，中國(guó)）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）儀（ABI公司，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 H9C2 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 將大鼠的H9C2 心肌細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)于含有10%FBS 和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2和95%飽和濕度。間隔1 d 更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合度達(dá)到80%后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 lncRNA-B230352I09 過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-B230352I09）和陰性對(duì)照（negative control，NC）載體（pcDNA-NC）由上海吉瑪生物公司合成。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合度達(dá)50%～60%時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)液，加入轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和Lipo3000 轉(zhuǎn)染液，培養(yǎng)6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（無(wú)任何處理）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pcDNA-NC）、lncRNA-B230352I09過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染pcDNA-B230352I09）。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) CCK8 法：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞按照3 000 個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，隨后分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h加入CCK8 溶液，孵育2 h 后置于酶標(biāo)儀，測(cè)量450 nm 波長(zhǎng)的吸光度（optical density，OD）值，繪制生長(zhǎng)曲線。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3 次。EdU 檢測(cè)：化學(xué)試劑EdU 可以特異地結(jié)合到新合成的DNA 中并被熒光顯微鏡檢測(cè)，用來(lái)評(píng)估細(xì)胞增殖情況。將培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞進(jìn)行EdU 標(biāo)記、固定、洗滌和通透，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）細(xì)胞核染色后，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后72 h 用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，70%乙醇、20 ℃固定過夜，固定好的細(xì)胞使用碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色液染色，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期中G1期、S期、G2期細(xì)胞比例變化。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次。

1.2.5 RT-PCR 檢測(cè) 用RNA 提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板，GAPDH為內(nèi)參，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因的引物，其中l(wèi)ncRNA-B230352I09 的正向引物序列為5'ATCACAA CAATCCCTTCCAC3'，反向引物序列為5'GCAACA GAAAAGAAACCAAGA3'。細(xì)胞周期蛋白（cyclin D1）正向引物序列為5'GCCCTCCGTTTCTTACTTCA 3'，反向引物序列為5'CTCCTCTTCGCACTTCTGCT 3'。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1 （cyclin dependent protein kinase 1，CDK1） 正 向 引 物 序 列 為5'TCTTCGCTCGTTAAGAG TTAC3'，反向引物序列為5'ATCTGCCAGTTTGATT GTTC3'。GAPDH正 向引物序列為5′GACCTGACCT GCCGTCTA3′，反向引物序列為5′AGGAGTGGGT GTCGCTGT3′。PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃，10 min 預(yù)變性，95 ℃15 s，60 ℃1 min，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行F檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢 測(cè)lncRNA-B230352I09 過 表 達(dá)效率

空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及l(fā)ncRNA-B230352I09過表達(dá)組3 組間lncRNA-B230352I09 表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），其中空白對(duì)照組和pcDNA-NC 組相比，lncRNA-B230352I09 的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與pcDNA-NC 組相比，lncRNAB230352I09過表達(dá)組中l(wèi)ncRNA-B230352I09表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），提示轉(zhuǎn)染構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 lncRNA-B230352I09過表達(dá)效率的檢測(cè)Fig1 Detection and validation of lncRNA-B230352I09 overexpression efficiency

2.2 lncRNA-B230352I09 過 表 達(dá) 對(duì)H9C2 細(xì) 胞 增殖的影響

CCK8檢測(cè)顯示：在不同時(shí)間點(diǎn)（24 h、48 h、72 h）3組細(xì)胞增殖能力差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-B230352I09過表達(dá)組表現(xiàn)為明顯的時(shí)間依賴性細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（圖2A），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24 h：P=0.000；48 h：P=0.000；72 h：P=0.001）。熒光顯微鏡下觀察EdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)果顯示pcDNA-B230352I09過表達(dá)組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組（圖2B）。

圖2 lncRNA-B230352I09過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effect of lncRNA-B230352I09 overexpression on proliferation of cardiomyocytes

2.3 lncRNA-B230352I09 過 表 達(dá) 對(duì)H9C2 細(xì) 胞 周期的影響

轉(zhuǎn)染72 h 后檢測(cè)細(xì)胞周期，如圖3A 所示，3 組在G1期和S 期細(xì)胞比例差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000），在G2期細(xì)胞比例的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其 中pcDNA-NC 組G1期 細(xì) 胞 比 例 為（57.99±0.09）%，S 期為（25.78±0.1）%，G2期為（16.23±0.06）%；pcDNA-B230352I09 過表達(dá)組G1期細(xì)胞比例為（52.19±1.3）%，S 期為（31.72±1.2）%，G2期為（16.09±0.15）%。和pcDNA-NC 組相比，pcDNAB230352I09過表達(dá)組G1期細(xì)胞比例減少，S期細(xì)胞比例明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＝0.000）。進(jìn)一步利用RT-PCR 檢測(cè)心肌細(xì)胞cyclin D1 和CDK1的mRNA表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)：3組間基因mRNA 表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＝0.000）；與pcDNA-NC 組比較， pcDNA-B230352I09 組cyclin D1 和CDK1的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（圖3B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＝0.000）。

圖3 lncRNA-B230352I09過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響Fig 3 Effect of lncRNA-B230352I09 overexpression on cell cycle of cardiomyocytes

3 討論

預(yù)防心力衰竭的理想手段需要補(bǔ)償丟失的心肌細(xì)胞，然而，一些研究［8］已經(jīng)確定心臟中沒有心臟干細(xì)胞，且新增心肌細(xì)胞來(lái)源于現(xiàn)有的心肌細(xì)胞。因此，尋找成熟心肌細(xì)胞的增殖調(diào)控因素成為研究學(xué)者的焦點(diǎn)。已有大量研究［9］表明可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)、多種信號(hào)通路如Hippo 和NRG-1/ErbB 通路等促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，提示誘導(dǎo)成熟心肌細(xì)胞增殖能力的激活是促進(jìn)內(nèi)源性心臟修復(fù)和預(yù)防心力衰竭的可行方法。本研究從細(xì)胞增殖的角度探討lncRNA-B230352I09在心肌細(xì)胞中的作用。實(shí)驗(yàn)采用CCK8 法間接測(cè)定心肌細(xì)胞增殖數(shù)量，EdU 檢測(cè)心肌細(xì)胞的DNA 合成情況。結(jié)果表明lncRNA-B230352I09 過表達(dá)的心肌細(xì)胞數(shù)量、DNA合成均明顯增加，提示lncRNA-B230352I09能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和分裂。

目前普遍認(rèn)為心肌細(xì)胞終末分化時(shí)變成雙核細(xì)胞而“退出”細(xì)胞周期，不再增殖［10］，故成年心肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵過程是使其重新進(jìn)入細(xì)胞周期。細(xì)胞周期的進(jìn)行取決于細(xì)胞周期蛋白和CDK 的協(xié)調(diào)反應(yīng)，調(diào)節(jié)DNA 合成和細(xì)胞分裂。在出生后心臟生長(zhǎng)期間，心肌細(xì)胞周期活動(dòng)開始減少，伴隨細(xì)胞周期蛋白和CDK 的表達(dá)減少［11］。因此，靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖是心臟再生的有效方法。研究［12］顯示，CDK1、CDK4、cyclin B1 和cyclin D1的過表達(dá)明顯促進(jìn)小鼠、大鼠和人心肌細(xì)胞的細(xì)胞分裂，減少心肌損傷后瘢痕的形成。其中cyclin D1是G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入S 期［13］。在 本 研 究 中 發(fā) 現(xiàn)，lncRNA-B230352I09 過表達(dá)的H9C2 心肌細(xì)胞CDK1和cyclin D1 的mRNA 水平明顯增加；且流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示lncRNAB230352I09 可促進(jìn)心肌細(xì)胞進(jìn)入S 期。因此，我們得出結(jié)論：lncRNA-B230352I09 能夠通過調(diào)節(jié)cyclin D1 和CDK1，促進(jìn)心肌細(xì)胞進(jìn)入S 期，增強(qiáng)心肌細(xì)胞增殖能力。

本研究仍存在不足之處：①H9C2 心肌細(xì)胞［14］來(lái)源大鼠胚胎心臟組織，雖然作為心臟疾病常用研究對(duì)象，但不能真實(shí)反映原代心肌細(xì)胞的生物性狀及人體成熟心肌細(xì)胞的狀態(tài)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。②本研究?jī)H觀察到lncRNA-B230352I09 對(duì)H9C2 心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)狀態(tài)下增殖表型的作用，對(duì)其損傷刺激狀態(tài)下的表型變化有待進(jìn)一步探索。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，lncRNA B230352I09 有可能通過促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖成為維持心臟結(jié)構(gòu)和改善心臟功能的潛在有效途徑。 本研究為lncRNAB230352I09 在缺血缺氧損傷心肌細(xì)胞中的研究奠定了一定基礎(chǔ)，為應(yīng)用于慢性心力衰竭等心臟疾病的治療提供了一定理論依據(jù)。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

陳玉梅、童朝陽(yáng)參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；徐斐翔、汪升參與了實(shí)驗(yàn)的具體執(zhí)行；徐斐翔、汪升、薛明明參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by CHEN Yumei and TONG Chaoyang. The experiments were performed by XU Feixiang and WANG Sheng. The manuscript was drafted and revised by XU Feixiang， WANG Sheng and XUE Mingming.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-02-14

·Accepted：2022-05-16

·Published online：2022-05-28