王 磊,白艷輝,趙 冬,劉偉明,李 佳，蔣雨光，王秀麗

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 麻醉科，河北 石家莊 050051；2.保定市第一中心醫(yī)院 麻醉科,河北 保定 071000；3.保定市第二醫(yī)院 檢驗科，河北 保定 071000；4.保定華醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院 檢驗科，河北 保定 071000)

下肢缺血再灌注是繼發(fā)肺損傷的主要原因之一[1-2]，其機制可能是缺血缺氧致細胞內(nèi)的線粒體功能受損，導(dǎo)致細胞腫脹壞死，再灌注過程中氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)進一步致組織損傷加重[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體形態(tài)功能障礙是肺損傷發(fā)生發(fā)展的重要標志[5-6]，SIRT3位于線粒體內(nèi)，參與線粒體的多種生物調(diào)節(jié)：如抗氧化應(yīng)激、能量合成代謝、細胞裂變?nèi)诤系?。SIRT3過表達可抑制氧化應(yīng)激，改善器官缺血再灌注損傷[7-8]。FoxO3a作為SIRT3的下游轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下廣泛存在心、肺、肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)中，參與細胞內(nèi)多種生化代謝調(diào)控[9]。其轉(zhuǎn)錄活性受到乙?；揎椀恼{(diào)節(jié)，在氧化應(yīng)激刺激下SIRT3使FoxO3a去乙?；饔迷鰪?，降低其轉(zhuǎn)錄活性，從而增強抗氧化能力[10]。通過調(diào)節(jié)SIRT3/ FoxO3a信號通路可降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕肝缺血再灌注所致的器官損傷[11]。三葉苷是多穗柯葉的主要提取物，且有抗炎、抗氧化等功效[12-13]，作為SIRT3激動劑[14]，可通過上調(diào)SIRT3緩解腦缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷。但三葉苷是否能通過調(diào)節(jié)SIRT3/FoxO3a通路改善下肢缺血再灌注繼發(fā)的肺損傷尚不清楚，因此本研究以SIRT3/FoxO3a通路為切入點，探討三葉苷預(yù)處理對下肢缺血再灌注繼發(fā)肺損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實驗動物 MDA、SOD、GSH-Px試劑盒購自上海碧云天公司；I抗SIRT3、I抗FoxO3a購自美國Abcam公司；8～10周齡雄性C57BL6小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.2 方法 將50只小鼠[體重(30±2) g]采用數(shù)字表法隨機分為5組，每組10只，即假模型組(Control組)、缺血再灌注組(IR組)、三葉苷組(TLB+IR組)、三葉苷+SIRT3抑制劑組(3-TYP+TLB+IR組)、SIRT3抑制劑組(3-TYP+IR組)。模型制備：參照文獻[15]制備下肢IR模型，巴比妥鈉進行麻醉后，用止血帶結(jié)扎雙后肢根部造成后肢缺血，缺血3 h后松解止血帶，對雙后肢進行按摩以加速血流復(fù)灌，再灌注3 h后，分離肺組織并留取外周血備用，遂即處死小鼠。Control組僅進行麻醉后開胸，分離肺組織等操作，不對后肢血管進行夾閉。TLB+IR組于造模前給予三葉苷30 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)3 d。3-TYP+TLB+IR組于造模前連續(xù)3 d經(jīng)腹腔注射SIRT3選擇性抑制劑50 mg/(kg·d)，30 min后經(jīng)灌胃給予三葉苷30 mg/(kg·d)。

1.3 指標檢測

1.3.1 血氣分析及氧化應(yīng)激指標測定 抽取動脈血，利用血氣分析儀記錄動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)。取部分左肺組織，加入細胞裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，留取上清，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD、GSH-Px活力。

1.3.2 肺組織病理學(xué)觀察及凋亡檢測 右肺組織進行濕、干稱重，計算肺濕/干比值，取部分左肺組織制備組織切片，HE染色后光鏡下觀察肺組織形態(tài)，參照文獻[16]隨機抽取10個高倍視野進行評分。切片經(jīng)脫蠟至水、組織透化、TUNEL標記、DAPI復(fù)染、鏡檢肺組織凋亡情況。

1.3.3 肺組織SIRT3、FoxO3a蛋白表達測定 取部分左肺組織勻漿，加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF冰上裂解2 h后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min后取上清，采用Western blot法，95 ℃變性10 min，PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入I抗SIRT3、I抗FoxO3a分別置搖床孵育2 h，棄I抗，TBST漂洗后加入辣根過氧化酶標記的II抗，搖床孵育1 h，棄II抗，TBST漂洗，用化學(xué)發(fā)光法曝光顯影，采用Quantity one 軟件進行分析，以各目的蛋白條帶灰度值與GAPDH 條帶灰度值的比值反映各目的蛋白表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，假模型組與模型組間比較用t檢驗，不同模型組間采用兩因素兩水平析因設(shè)計方差分析，評分資料應(yīng)用秩和檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Control組與模型組各項指標比較 T檢驗比較Control組與模型組小鼠各項指標，與Control組比較，模型組各指標均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。提示缺血再灌注模型制備成功。

表1 Control組與模型組各項指標比較

2.2 各組小鼠動脈血氣分析比較 TLB可以增加缺血再灌注小鼠的PaO2，降低PaCO2；3-TYP可以降低缺血再灌注小鼠的PaO2，升高PaCO2。TLB和3-TYP對缺血再灌注小鼠PaO2的影響無交互作用(見表2、3)。

表2 TLB、3-TYP對缺血再灌注小鼠PaO2影響

表3 TLB、3-TYP對缺血再灌注小鼠PaCO2影響

2.3 小鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)及損傷評分、凋亡率、W/D比值測定 光鏡下可見Control組肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，未見明顯異常；IR組、3-TYP+TLB+IR組、3-TYP+IR組均可見肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁毛細血管擴張充血明顯，伴大量炎性細胞浸潤，肺泡內(nèi)滲出較多；TLB+IR組肺泡形態(tài)相對完好，肺泡壁毛細血管擴張充血較輕，伴少許炎性細胞浸潤(見圖1、表4)。TLB可以降低缺血再灌注小鼠肺W/D比值、細胞凋亡率；3-TYP可以升高缺血再灌注小鼠肺W/D比值、細胞凋亡率。TLB和3-TYP對缺血再灌注小鼠肺W/D比值和細胞凋亡率的影響無交互作用(見表5、6)。

表4 各組間小鼠肺組織病理評分比較

A:Control組;B:IR組;C:TLB+IR組;D:3-TYP+TLB+IR組;E:3-TYP+IR組;×200。

表5 TLB、3-TYP對缺血再灌注小鼠肺W/D比值影響

表6 TLB、3-TYP對缺血再灌注小鼠細胞凋亡率影響

2.4 小鼠肺組織氧化應(yīng)激指標測定 TLB可以降低缺血再灌注小鼠MDA，提高SOD、GSH-Px活性；3-TYP可以升高缺血再灌注小鼠MDA、降低SOD、GSH-Px活性。TLB和3-TYP對缺血再灌注小鼠MDA、SOD、GSH-Px的影響無交互作用，見表7～9。

表7 TLB、3-TYP對缺血再灌注小鼠MDA影響

表8 TLB、3-TYP對缺血再灌注小鼠SOD影響

表9 TLB、3-TYP對缺血再灌注小鼠GSH-Px影響

2.5 小鼠肺組織SIRT3、FoxO3a蛋白表達測定 三葉苷可以上調(diào)缺血再灌注小鼠SIRT3表達，下調(diào)FoxO3表達；3-TYP可以下調(diào)缺血再灌注小鼠SIRT3表達，上調(diào)FoxO3表達。TLB和3-TYP對缺血再灌注小鼠SIRT3、FoxO3表達的影響無交互作用，見表10～11。

表10 TLB、3-TYP對缺血再灌注小鼠SIRT3表達影響

表11 TLB、3-TYP對缺血再灌注小鼠FoxO3表達影響

3 討論

下肢缺血再灌注不僅影響局部缺血組織的功能，還會導(dǎo)致遠隔器官的功能障礙，其中肺是最易受損的器官之一[1-4]。本實驗經(jīng)后肢根部結(jié)扎之后再灌注，發(fā)現(xiàn)IR組血氣指標惡化，病理切片示肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺損傷評分及凋亡指數(shù)顯著升高，提示下肢缺血再灌注肺損傷的模型制備成功。

SIRT3是一種依賴煙酰胺腺苷二核苷酸的去乙?；?，通過抗細胞氧化應(yīng)激、能量合成代謝等方式對細胞起著重要的保護作用。激活SIRT3可改善缺血再灌注所致的氧化應(yīng)激損傷、抑制炎癥和保護線粒體功能[17]。三葉苷作為SIRT3激活劑，可激活線粒體內(nèi)的SIRT3，抑制線粒體膜電位降低，減少活性氧過度生成，減輕細胞免受氧化損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，三葉苷預(yù)處理可使Trilobatin+IR組SIRT3蛋白表達增強，抗氧化酶SOD、GSH-Px活性增高、過氧化物MDA含量降低，血氣指標改善，肺損傷評分及凋亡指數(shù)顯著降低，提示三葉苷可通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護下肢缺血再灌注所致的肺損傷。

FoxO3a蛋白通過被SIRT3去乙?；绞秸{(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，并在細胞分化、凋亡及氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Guo等[19]發(fā)現(xiàn)FoxO3a啟動區(qū)域H4乙?；皆龈?，可促進SOD上調(diào)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實驗發(fā)現(xiàn)通過抑制SIRT3，3-TYP+Trilobatin+IR組SIRT3蛋白表達下調(diào)，F(xiàn)oxO3a蛋白表達增高，肺損傷評分及凋亡指數(shù)增高，提示下調(diào)SIRT3蛋白表達，可顯著減弱三葉苷在抗氧化應(yīng)激方面的保護作用，加重缺血再灌注所致的肺損傷。其機制可能是三葉苷通過上調(diào)線粒體內(nèi)SIRT3蛋白表達，去乙酰泛素化降解FoxO3a蛋白，使其蛋白表達降低，降低細胞活性氧水平，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]，改善缺血再灌注引起的肺損傷。本研究不足之處：①由于本研究樣本量相對較少，對于肺病理學(xué)評分采用秩和檢驗分析，只能得出Control組與模型組有統(tǒng)計學(xué)差異，而模型組之間由于樣本量較少，評分分值差異不明顯，故今后的研究適當增加樣本量。②下肢缺血再灌注繼發(fā)肺損傷的作用機制十分復(fù)雜，并非由單一細胞因子起決定性作用，還有其他細胞因子和炎性介質(zhì)的相互作用，相互制約，共同調(diào)節(jié)肺臟的發(fā)生發(fā)展，這也是本課題組進一步的研究方向。

綜上所述，三葉苷預(yù)處理可能通過調(diào)節(jié)SIRT3/ FoxO3a通路，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善下肢缺血再灌注繼發(fā)的肺損傷。