倪 佳，徐瑩瑩，鄧婉玲，宋苗苗，石 靜，孫達權

(1.貴陽市婦幼保健院·貴陽市兒童醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2.寧波市第一醫(yī)院 疝肝膽肛腸外科，浙江 寧波 315000；3.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025)

絲裂原活化蛋白激酶3(Mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)是由MAPK3 基因編碼的一種分子量44 kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又名細胞外信號調節(jié)激酶1(Extracellular signal-regulatedkinase 1，ERK1)，是MAPK家族的重要成員之一，它通常與分子量42 kDa的絲裂原活化蛋白激酶1(Mitogen- activated protein kinase 1，MAPK1)共同組成MAPK1/3，是Ras(Rat sarcoma proto-oncoprotein)-MAPK信號通路的重要成員[1-3]。大量研究表明，MAPK1/3不僅參與細胞的多種生理功能，如細胞的生長增殖、遷移、分化、穩(wěn)態(tài)調節(jié)和凋亡等，也與多種細胞病變有關，許多癌基因編碼的蛋白可通過持續(xù)激活MAPK1/3，誘發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展和腫瘤血管生成等[4-7]。到目前為止，雖然有許多文獻描述了MAPK1/3的生物學功能，但單獨研究MAPK3對肝細胞癌影響作用的文獻較少。本研究通過克隆人MAPK3基因和構建MAPK3基因穩(wěn)轉克隆肝細胞癌細胞株，研究MAPK3基因對肝細胞癌細胞生長增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞 人永生化肝上皮細胞THLE-3(C4144)和人肝細胞癌細胞Hep 3B(SCSP-5045)分別購自上海冠導生物工程有限公司和中科院上海細胞庫，均有STR鑒定結果。THLE-3細胞用含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)，Hep 3B細胞用含有10 %胎牛血清的MEM(minimum Eagle’s medium)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5 % CO2。

1.2 主要試劑 PrimeScriptTMIV 1st strand cDNA Synthesis Mix(6215A)、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase(R045A)、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(9762)、DL10,000 DNA Marker(3584A)、pMDTM18-T Vector Cloning Kit(6011)、EcoR I(1040A)、XhoI(1094A)、T4 DNA Ligase(2011A)(TaKaRa，日本)，質粒小提試劑盒(DP103)、DH5a 感受態(tài)細胞(CB101)、無內毒素質粒小提中量試劑盒(DP118)(天根生物，中國)，MEM(含GlutaMAXTM添加劑，41090036)、RPMI 1640 培養(yǎng)基(31870082)、PierceTMBCA 蛋白定量試劑盒(23225)、TRIzolTM試劑(15596026)、LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(11668019)、GeneticinTM選擇性抗生素(11811023)(ThermoFisher Scientific，美國)，優(yōu)級胎牛血清(11011-8611)(天杭生物，中國)，PCR引物和DNA測序(博邁德，中國)，真核表達載體pEYFP-N1長期保存于本實驗室，可用于檢測YFP的GFP-tag (3A10) monoclonal antibody(AP0675M)、ERK1/2 (L352) polyclonal antibody(BS1112)、GAPDH polyclonal antibody(AP0063)、Stat3 (S727) polyclonal antibody(AP0366)、Stat3 (phospho-S727) polyclonal antibody(BS4180)、MMP-2 (L638) polyclonal antibody(BS1236)、HRP標記的二抗(BS13278、BS12478)(巴傲得，中國)，E-Cadherin(WL01482)、N-Cadherin(WL01047)、Vementin(WL01960)、c-Myc(WL01781)(萬類生物，中國)，基底膠Matrigel(356234)(索萊寶，中國)。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆與測序 根據NCBI中人MAPK3的基因序列(NM_002746)和真核表達載體pEYFP-N1的多克隆位點設計并合成一對聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)引物(見表1)，在上游引物的5′端引入XhoI酶切位點，下游引物的5′端加入EcoR I酶切位點，小寫部分為XhoI酶切位點，最前端的兩個堿基為保護性堿基；小寫部分為EcoR I酶切位點，最前端的兩個堿基為保護性堿基。

表1 人MAPK3的PCR引物

用6 cm小皿培養(yǎng)人肝上皮細胞THLE-3，當細胞生長融合至80%時，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞3次后，加入1 mL TRIzol試劑，充分吹打和裂解細胞，按說明書程序提取細胞總RNA，并將RNA溶液定容至1 μg/μL。按cDNA反轉錄試劑盒說明書流程合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA模板，用人MAPK3 PCR引物根據高保真DNA聚合酶說明書操作流程體外擴增獲得人MAPK3基因蛋白編碼區(qū)。

用1%瓊脂糖凝膠電泳分離和純化PCR擴增獲得的人MAPK3基因蛋白編碼區(qū)，通過3′末端加“A”試劑盒給純化的PCR產物加“A”，然后克隆入pMD18-T載體中。經轉化、篩選培養(yǎng)和酶切鑒定后，對可能含有MAPK3基因的重組載體進行DNA測序，測序結果用BioXM 2.6進行比對，測序正確的質粒命名為pMD18T-MAPK3。

1.3.2 構建重組真核表達質粒 用XhoI/EcoR I雙酶切真核表達載體pEYFP-N1和含有目的基因的pMD18T-MAPK3，用1%瓊脂糖凝膠分離和純化骨架載體和目的基因，并用T4連接酶將兩者連接起來。經轉化、抗生素篩選培養(yǎng)、質粒抽提和雙酶切鑒定后，對可能重組正確的質粒進行DNA測序，測序正確的重組真核表達載體命名為pEYFP-MAPK3。

1.3.3 構建穩(wěn)轉克隆肝細胞癌細胞株 用無內毒素質粒小提中量試劑盒提取質粒pEYFP-MAPK3，并將DNA濃度定容為1 μg/μL。 在6孔板中按最大細胞數的50%鋪板人肝細胞癌細胞Hep 3B，細胞貼壁后更換為無血清的MEM細胞培養(yǎng)液，按LipofectamineTM2000 Transfection Reagent說明書對細胞穩(wěn)定轉染pEYFP-MAPK3，轉染后6 h更換為含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉染后48h在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞熒光。將轉染的細胞消化并傳至10 cm細胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，轉移后72 h后在培養(yǎng)液中加入600 μg/mL的G418，篩選培養(yǎng)5d后更換為含300 μg/mL Geneticin的細胞培養(yǎng)液。待細胞長成單克隆后，在倒置熒光顯微鏡下挑取帶黃色熒光的單克隆細胞株，轉移到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，經擴大培養(yǎng)后進行驗證和后續(xù)實驗。該實驗方法是根據文獻[8]和具體實驗改編而成。

1.3.4 蛋白免疫印跡實驗 細胞生長融合至70%時，胰酶消化并收集細胞，抽提細胞蛋白并用BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白溶液進行定量，制備蛋白樣品后進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。電泳結束后對蛋白進行濕法轉膜，用TBST清洗對PVDF膜3次，用5%脫脂奶粉在37℃封閉30 min，TBST清洗3次，一抗4℃孵育過夜，TBST清洗3次，二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次，ECL發(fā)光成像。用Image J獲取目的條帶的灰度值。

1.3.5 細胞生長增殖實驗 取1 000個細胞鋪于E-Plate L16中，每孔用含10%胎牛血清的MEM定容至終體積200 μL，室溫下放置30 min，將E-Plate L16放到iCelligence分析儀上進行實時檢測。在系統自動掃描“Scan Plate”后，開始繪制出相應的細胞增殖曲線。細胞指數值與細胞數量成正相關，即細胞指數越大，孔內細胞數目越多，細胞增殖能力越強。

1.3.6 劃痕愈合實驗 將細胞按100%的融合率接種于12孔板中，每組設置3個復孔。待細胞貼壁后用10 μL的槍頭緊貼著消毒過的直尺在孔中間按“|”輕輕劃痕，PBS洗去漂浮的細胞，加入1 mL新鮮的不含血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在0、48 h時分別在顯微鏡下記錄細胞的愈合情況。

1.3.7 細胞侵襲實驗 將基底膠用MEM細胞培養(yǎng)液按1∶10稀釋(冰浴操作)，取稀釋后的基底膠100 μL加入到Transwell小室中，細胞培養(yǎng)箱中放置5 h，倒掉小室中的液體，用磷酸鹽緩沖液清洗1次。將消化并用磷酸鹽緩沖液清洗后的細胞用無血清的MEM細胞培養(yǎng)液稀釋混勻，按100%的融合率接種至Transwell小室中，并用MEM定容至200 μL；在24孔板的孔中加入600 μL含10%胎牛血清的MEM細胞培養(yǎng)液，將鋪了細胞的Transwell小室移入24孔板中，培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，4%多聚甲醛室溫固定30 min后用結晶紫染色，自來水清洗脫色，用棉簽拭去小室內側的細胞。每孔隨機選取3個視野拍照記錄，每組設置3個復孔。

1.4 統計學分析 用軟件SPSS 21.0對實驗數據進行分析。兩組組間分析采用獨立樣本t檢驗分析，P< 0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 獲得人MAPK3基因蛋白編碼區(qū)和重組真核表達質粒pEYFP-MAPK3 如圖1A所示，以人肝上皮細胞cDNAs為模板，通過RT-PCR獲得長度約1.1 kb的人MAPK3基因的蛋白編碼區(qū)。TA克隆后，DNA測序結果顯示RT-PCR產物正是人MAPK3基因的蛋白編碼區(qū)，且無任何形式的突變。將人MAPK3基因蛋白編碼區(qū)通過XhoI/EcoR I酶切位點插入到真核表達載體pEYFP-N1中，構建pEYFP-MAPK3(見圖1B)，DNA測序結果顯示MAPK3準確插入到pEYFP-N1的預定堿基中，其質粒圖譜如圖1C所示。

A：RT-PCR擴增人MAPK3基因蛋白編碼；B：Xho I/ EcoR I雙酶切鑒定重組真核表達質粒pEYFP-MAPK3；C：質粒pEYFP-MAPK3圖譜。

2.2 建立MAPK3基因穩(wěn)轉克隆肝癌細胞株 用脂質體法將重組質粒pEYFP-MAPK3導入肝細胞癌細胞Hep 3B后，經藥物篩選培養(yǎng)和克隆集落擴大培養(yǎng)，選取熒光顯微鏡下呈黃色熒光的細胞集落(見圖2A)，分別用可以檢測YFP蛋白的GFP標簽抗體和檢測MAPK3蛋白的MAPK3/2抗體對細胞內表達的目的蛋白進行驗證，結果如圖2B所示，篩選獲得的單克隆肝細胞癌細胞株內過表達帶有YFP的MAPK3融合蛋白MAPK3-YFP，證明MAPK3基因穩(wěn)轉克隆肝細胞癌細胞株構建成功。

A：外源MAPK3基因融合蛋白(MAPK3-YFP)在熒光顯微鏡下使肝細胞癌細胞Hep 3B呈黃色；B：外源MAPK3-YFP在肝細胞癌細胞Hep 3B(Ov-MAPK3)中表達。

2.3MAPK3基因促進肝細胞癌細胞生長增殖、遷移和侵襲 為分析MAPK3基因對肝細胞癌細胞表型的影響，本組以表達外源YFP蛋白的Hep 3B為對照細胞，通過實時無標記細胞分析技術發(fā)現表達MAPK3融合蛋白的肝細胞癌細胞的生長和增殖速率明顯提高(P=0.017，見圖3A)；同時，細胞損傷-愈合實驗結果顯示MAPK3能夠顯著提高癌細胞的遷移能力(P=0.022，見圖3B)；另外，細胞侵襲實驗結果顯示肝癌細胞表達外源MAPK3后，侵襲的癌細胞數增加(見圖3C)。以上結果顯示，在肝細胞癌細胞中過表達外源MAPK3基因后，可以促進癌細胞的生長和增殖速度、遷移能力和侵襲能力。

A：MAPK3基因促進肝癌細胞Hep 3B生長增殖；B：MAPK3基因促進肝癌細胞Hep 3B遷移；C：MAPK3基因促進肝癌細胞Hep 3B侵襲；*：與對照組比較， P<0.05。

2.4MAPK3基因影響肝癌細胞內相關的基因表達 為分析MAPK3基因是如何影響肝細胞癌細胞表型的，本組先對MAPK3下游分子信號傳導子及轉錄激活子(Signal transducer and activator of transcription，Stat3)進行分析，發(fā)現過表達MAPK3在不影響Stat3蛋白整體水平，但可以顯著提高p-Stats727的表達水平(P=0.046)，并促進Stat3的靶基因蛋白c-Myc(P=0.031)和基質金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)(P=0.043)的表達水平(見圖4)。此外，過表達的MAPK3還可以明顯促進肝細胞癌細胞中N-Cadherin的表達(P=0.025)并抑制E-Cadherin(P=0.017)的表達，但Vimentin的表達基本不受MAPK3過表達的受影響(見圖4)。這些蛋白表達變化可能就是引起肝細胞癌細胞表型變化的分子基礎。

*：與對照組比較， P<0.05。

3 討論

肝細胞癌具有復雜的腫瘤分子發(fā)病途徑，MAPK途徑是其重要的途徑之一[9]。MAPKs是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘炔康闹匾獋鬟f者，MAPK1/3是ERK家族的重要成員，主要通過修飾轉錄因子而影響靶基因的轉錄與表達，參與細胞代謝和生理活動[10-11]。研究表明，MAPK1/3異常表達及其信號通路活化與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切的關系[1,3,7,9,11]。但是，MAPK1/3并非是一個蛋白，也不是同一個基因的表達產物；實際上它們是一對由高度同源的基因，即MAPK1基因和MAPK3基因，各自編碼的不同蛋白質，兩者在蛋白質的一級結構上具有85%的相似性。由于這兩個蛋白的分子量相近且的免疫原相似，且具有諸多類似的生物學功能而被書寫成MAPK1/3。事實上，兩種蛋白質的一級結構上還是存在些許差異的。首先，MAPK3蛋白在N-末端比MAPK1多出一段氨基酸殘基序列：GGEPRRTEGVGPGVPGE，這可能可以賦予MAPK3新的蛋白特性和對應的生物學功能。研究發(fā)現，由于MAPK3 N-末端的這段特殊序列存在，導致其在胞質中磷酸化活化后的入核速度顯著低于MAPK1，使細胞核內MAPK3總體磷酸化水平降低，最終導致MAPK3的促細胞增殖能力顯著降低[12-13]。但MAPK3仍具有調節(jié)細胞生長增殖的能力，如在大鼠PC12細胞中，用microRNA-15b-5p結合MAPK3 3′UTR RNA，抑制ERK1表達后可減緩細胞的生長增殖速度[14]。還有研究發(fā)現，MAPK3可以促進白血病細胞HL-60的生長增殖速率，這一促進作用可以被與MAPK3 3′UTR RNA 結合的miR-143所阻斷[15]。此外，MAPK3還在其他多個方面展現其獨特的生物學作用，包括特異性調控脂肪細胞分化[16]、誘發(fā)實驗性哮喘[17]、誘導破骨細胞形成[18]、抑制視網膜損傷[19]、自身免疫性腦脊髓炎[20-21]以及誘導肝纖維化進程[22]等。這些研究均表明，除與MAPK1相似的生物學功能外，MAPK3還具有不同于MAPK1的特殊生物學功能。因此，有必要單獨展開MAPK3和MAPK1的生物學功能研究以及兩者之間的關聯性和差異性。

為分析MAPK3在肝細胞癌細胞中的作用，本研究首先以人肝上皮細胞來源的mRNA為模板，利用RT-PCR反轉錄擴增獲得人MAPK3基因的蛋白編碼區(qū)，并構建了真核表達載體pEYFP-MAPK3；通過脂質體轉染、geneticin藥物篩選、克隆選取培養(yǎng)與蛋白免疫印跡鑒定，成功獲得過表達MAPK3基因的肝細胞癌細胞克隆株。然后，利用實時無標記細胞分析技術、細胞損傷-愈合實驗和細胞侵襲實驗分別證明過表達ERK1基因可以加速肝細胞癌細胞的生長增殖速率、提高肝細胞癌細胞的遷移能力和侵襲能力。有趣的是在另一個研究中，我們發(fā)現當用RNAi單獨敲低肝細胞癌細胞內源性MAPK3后，細胞的生長增殖能力并未受到顯著影響(數據未列出)，這可能與肝細胞中MAPK1的表達量顯著多于MAPK3有關，并且在四肢類生物中MAPK3基因和MAPK1基因呈現功能冗余[23]。由此我們認為，要完全了解MAPK3在肝細胞癌細胞中的作用，不僅要結合MAPK3基因敲除的結果，還要與MAPK1基因過表達與敲除的肝細胞癌細胞表型相結合，才有可能能得出全面并精準的實驗結論，準確掌握MAPK3在肝細胞癌細胞中的生物學功能。

此外，我們還對過表達MAPK3后導致肝細胞癌細胞表型惡化的分子基礎進行了初步探索，發(fā)現肝細胞癌細胞過表達MAPK3后，細胞內MAPK3的下游靶蛋白Stat3的磷酸化水平上升。Stat3是一種功能復雜的核轉錄因子和癌蛋白，廣泛高表達和超活化于多種癌細胞和腫瘤生態(tài)系統中的非癌細胞中，研究指出人類有超過50%的腫瘤組織中Stat3高度表達并具有成百上千個轉錄靶基因[24-25]。我們對其中兩個具有促進細胞生長作用的c-Myc和可引起細胞外基質降解的MMP-2的靶基因蛋白進行分析驗證，發(fā)現細胞內的c-Myc和MMP-2表達同時升高。另外，研究還發(fā)現過表達MAPK3可以促進N-Cadherin并抑制E-Cadherin的表達。這些基因的表達變化可能與MAPK3誘導肝細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲有關。但是，我們相信MAPK3增強肝細胞癌細胞的癌性不僅僅與上述基因的表達變化有關，應該還有更多基因受MAPK3的表達而受到影響，而這些基因需要進一步去探索和挖掘。