劉夢(mèng)媛，鄭 翔，許永杰，王進(jìn)京，馮姍姍，張志敏，吳明松，李學(xué)英

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,貴州 遵義 563099;2.貴州省人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 貴陽(yáng) 550002;3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099；4.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563006)

2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示肺癌發(fā)病率居第二，死亡率居第一[1]。在我國(guó)，肺癌也是最主要的致死癌癥之一[2]，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)，其中NSCLC約占肺癌的80%～85%，肺腺癌和肺鱗癌是NSCLC的兩種主要病理亞型，是肺癌相關(guān)死亡的主要原因之一。隨著手術(shù)、放療、化療等治療方法的進(jìn)步，肺癌預(yù)后得到改善，但5年生存率仍不高[3-4]。因此，識(shí)別肺癌的潛在生物標(biāo)志物，進(jìn)一步探索肺癌發(fā)病的分子機(jī)制是一項(xiàng)緊迫而具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ERGIC3異常高表達(dá)也促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和遷移，但ERGIC3基因的作用機(jī)制及其與LUAD病理特征的相關(guān)性尚未研究。本研究旨在通過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證ERGIC3在LUAD中的表達(dá)及其與腫瘤病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為L(zhǎng)UAD的預(yù)后及發(fā)展機(jī)制的研究提供新的思路。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基中間隔室蛋白3(Endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment 3,ERGIC3)又稱(chēng)Erv46、ERp43，定位于染色體20q11.22，包括14個(gè)外顯子。所編碼的蛋白質(zhì)的分子量為43.2kDa，是由 383個(gè)氨基酸殘基組成的II型跨膜蛋白，也是ERGIC膜蛋白家族成員之一，作為COPII囊泡的成分[5]，介導(dǎo)分泌性蛋白從糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到順面高爾基網(wǎng)的運(yùn)輸，還有助于新合成的蛋白質(zhì)的折疊、糖基化[6]。抑制ERGIC3表達(dá)可影響細(xì)胞生長(zhǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[7-8]。此外，ERGIC3是一新的腫瘤相關(guān)基因，在多種腫瘤中異常高表達(dá)，可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌[7,9-12]生長(zhǎng)，且在肝癌[13]中異常高表達(dá)，但ERGIC3在肺腺癌中的作用機(jī)制及與生存預(yù)后的關(guān)系尚需進(jìn)一步探索。眾所周知，腫瘤的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，高通量測(cè)序技術(shù)在復(fù)雜疾病中的應(yīng)用具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。尤其在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和其它類(lèi)型細(xì)胞之間，構(gòu)成了復(fù)雜的微環(huán)境，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)防治療提供了重要的環(huán)境基礎(chǔ)。

癌癥基因組圖譜(The cancer genome atlas,TCGA)計(jì)劃通過(guò)基因芯片技術(shù)、高通量基因組測(cè)序，結(jié)合多維數(shù)據(jù)整合分析方法，將人類(lèi)34種類(lèi)型癌癥的基因表達(dá)水平及基因組變異圖譜繪制出來(lái)，獲得了海量數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)使對(duì)癌癥分子遺傳學(xué)的了解進(jìn)程加快，為精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)體化治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，開(kāi)啟了癌癥研究的新時(shí)代[14-15]，也極大地推動(dòng)了生物信息學(xué)與醫(yī)學(xué)的相互發(fā)展。生物信息學(xué)是多學(xué)科交叉，以互聯(lián)網(wǎng)為媒介，數(shù)據(jù)庫(kù)為載體，收集、整理和分析DNA和蛋白質(zhì)等的學(xué)科，從分子層面揭示疾病潛在的作用方式和發(fā)生機(jī)制。通過(guò)生信分析篩選出與疾病相關(guān)的潛在基因、miRNA和信號(hào)通路等，為臨床上對(duì)該疾病的早期診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。因此，本研究基于TCGA公共數(shù)據(jù)集，利用生物信息學(xué)方法，挖掘ERGIC3在肺腺癌免疫微環(huán)境中的作用及其預(yù)后價(jià)值，以期為深入探索ERGIC3在肺腺癌中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 方法

1.1 ERGIC3表達(dá)水平分析 通過(guò)TIMER 1.0(http://timer.cistrome.org/)[16]識(shí)別ERGIC3在泛癌中的表達(dá)，UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)用于評(píng)價(jià)ERGIC3在肺腺癌中的表達(dá)及與臨床病理信息的相關(guān)性。The Human Protein Atlas(HPA)(https://www.proteinatlas.org/)[17-18]被用來(lái)比較ERGIC3在LUAD及正常肺組織中的蛋白質(zhì)水平的表達(dá)差異。

1.2 生存預(yù)后分析 基于Kaplan-Meier plotter(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=lung)按照默認(rèn)參數(shù)對(duì)ERGIC3進(jìn)行單因素生存分析。以總生存期(Overall survival,OS)、首次進(jìn)展生存期(first progression,FP)和進(jìn)展后生存期(Post-progression survival,PPS)為生存分析的指標(biāo)。

1.3 蛋白互作和GO富集分析 使用 STRING(http://www.string-db.org)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與ERGIC3相互作用的蛋白，并通過(guò)WEB-based GEneSeTAnaLysis Toolkit (WebGestalt)(http://www.webgestalt.org/)[19]網(wǎng)站對(duì)與ERGIC3互作的基因進(jìn)行功能富集分析。

1.4 免疫浸潤(rùn)分析 通過(guò)TIMER 1.0(http://timer.cistrome.org/)[16]檢測(cè)ERGIC3表達(dá)與LUAD中6種免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)的浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。

1.5 microRNA預(yù)測(cè) 應(yīng)用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)和miRDB(http://mirdb.org/)3個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能靶向ERGIC3的microRNA，并通過(guò)Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對(duì)上述3個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)的microRNA取交集。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 差異表達(dá)、蛋白網(wǎng)絡(luò)、免疫浸潤(rùn)和microRNA預(yù)測(cè)等采用在線分析工具分析。生存數(shù)據(jù)采用log-rank檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERGIC3在肺腺癌中顯著高表達(dá) 使用TIMER獲得ERGIC3在多種腫瘤中的差異表達(dá)結(jié)果，ERGIC3在LUAD中表達(dá)差異明顯(見(jiàn)圖1A)。應(yīng)用UALCAN對(duì)TCGA的515個(gè)肺腺癌組織和59個(gè)對(duì)照肺組織樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ERGIC3在肺腺癌中的mRNA水平高表達(dá)，而在肺組織中低表達(dá)(P<0.05，見(jiàn)圖1B)。為驗(yàn)證這一趨勢(shì)，檢測(cè)HPA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，可以看到ERGIC3在肺腺癌組織中染色強(qiáng)度多為中強(qiáng)陽(yáng)性，而在正常肺組織中表達(dá)極弱或陰性(見(jiàn)圖1C)。從這些數(shù)據(jù)可以預(yù)測(cè)，ERGIC3的表達(dá)升高可能促進(jìn)肺腺癌生長(zhǎng)。

A：ERGIC3在泛癌中的表達(dá)水平；B：ERGIC3在肺腺癌中表達(dá)明顯增高； C：ERGIC3在LUAD組織和正常肺組織中的免疫組化分析結(jié)果。

2.2 ERGIC3表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的相關(guān)性 通過(guò)UALCAN分析ERGIC3的表達(dá)與肺腺癌臨床特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，ERGIC3在患者不同性別(見(jiàn)圖2A)、吸煙習(xí)慣(見(jiàn)圖2B)、年齡(見(jiàn)圖2C)和種族(見(jiàn)圖2D)；各個(gè)分期(見(jiàn)圖2E)；腫瘤不同組織學(xué)類(lèi)型(見(jiàn)圖2F)；轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)(見(jiàn)圖2G)和TP53突變腫瘤組織中(見(jiàn)圖2H)均高表達(dá)。有趣的是，在煙齡小于15年的患者中ERGIC3的表達(dá)高于煙齡大于15年的患者(P<0.05)， 在性別上，男女性患者腫瘤組織中ERGIC3表達(dá)量升高(P<0.05)，男性高于女性(P<0.05)。而ERGIC3在不同年齡和種族等的肺腺癌組織表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)。

A:ERGIC3在患者不同性別；B:吸煙習(xí)慣；C:年齡;D:種族；E:各個(gè)分期；F:腫瘤不同組織學(xué)類(lèi)型；G:轉(zhuǎn)移淋巴結(jié);H:TP53突變腫瘤組織中的表達(dá)情況。

2.3 ERGIC3在肺腺癌中的預(yù)后價(jià)值 為了探討ERGIC3對(duì)肺腺癌生存期的影響，我們應(yīng)用Kaplan-meier構(gòu)建模型，評(píng)估了ERGIC3在肺腺癌中的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果顯示，ERGIC3的高表達(dá)水平與肺腺癌患者不良的總體生存率(n=1 927)有關(guān)，中位生存期約為75個(gè)月，5年生存率約為50%(見(jiàn)圖3A)。此外，ERGIC3高表達(dá)的肺腺癌患者首次進(jìn)展生存期(n=982)(見(jiàn)圖3B)和進(jìn)展后生存期(n=344)(見(jiàn)圖3C)相對(duì)于低表達(dá)的肺腺癌患者更短，中位生存期分別約為60個(gè)月和15個(gè)月，5年生存率分別約為50%和15%(見(jiàn)圖3B、C)。提示ERGIC3與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且ERGIC3表達(dá)上調(diào)與肺腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)。

A：ERGIC3高表達(dá)或低表達(dá)與總生存期；B：首次進(jìn)展生存期；C：進(jìn)展后生存期的關(guān)系。

2.4 ERGIC3的蛋白互作及可能的生物學(xué)功能 為了進(jìn)一步研究肺腺癌中ERGIC3的潛在生物學(xué)功能，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定到10個(gè)與ERGIC3相互作用的蛋白質(zhì)，分別是ERGIC2、SEC13、SEC63、RER1、SURF4、MAGT1、GTPBP3、COG3、VPS45和PHF3(見(jiàn)圖4A)。篩選出與ERGIC3有互作關(guān)系的基因后，對(duì)基因相關(guān)的功能進(jìn)行注釋?zhuān)詶l形圖形式集中展示了ERGIC3相關(guān)基因在GO的3個(gè)層次下富集條目的分布，分別是生物過(guò)程(見(jiàn)圖4B)、細(xì)胞組分(見(jiàn)圖4C)和分子功能(見(jiàn)圖4D)。這些基因在生物過(guò)程條目下主要富集在Localization、Metabolic process、Biological regulation、Cellular component organization和Response to stimulus(見(jiàn)圖4B)。在細(xì)胞組分條目中主要是Endomembrane system、Membrane、Endoplasmic reticulum、Golgi apparatus和Vesicle顯著富集(見(jiàn)圖4C)，而在分子功能條目中主要是Protein binding、Transporter activity、Ion binding、Structural molecule activity和Nucleic acid binding是分組中的顯著富集項(xiàng)(見(jiàn)圖4D)。以上提示，ERGIC3參與的功能集中在分子合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、修飾、定位和細(xì)胞應(yīng)激，這些細(xì)胞功能主要在細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)中進(jìn)行，說(shuō)明ERGIC3相關(guān)基因在蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基復(fù)合體的運(yùn)輸中發(fā)揮了重要作用。

A:ERGIC3的蛋白互作關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)是蛋白質(zhì)，邊表示蛋白質(zhì)之間的相互作用；B～D:與ERGIC3相關(guān)基因的GO功能富集分析。

2.5 ERGIC3差異表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性分析 本課題組前期研究表明，ERGIC3在肝癌中是一個(gè)免疫相關(guān)基因，于是我們采用TIMER 1.0算法評(píng)估了ERGIC3表達(dá)量與肺腺癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示，ERGIC3的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞純度呈微弱的正相關(guān)(r=0.18,P<0.05)。ERGIC3水平與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.164,P<0.05)、CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.163,P<0.05)、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.136,P<0.05)、嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.223,P<0.05)和樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.222,P<0.05)呈負(fù)相關(guān)。有趣的是，B 細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.086,P>0.05)與ERGIC3的表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性(見(jiàn)圖5)。

圖5 在肺腺癌中ERGIC3的表達(dá)與腫瘤純度和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性

2.6 以E RGIC3為靶點(diǎn)的microRNA預(yù)測(cè) 很多癌癥相關(guān)基因受microRNA調(diào)控，microRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[20]。我們通過(guò)TargetScan、starbase和miRDB 3個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)與ERGIC3 mRNA 的3’-UTR相互作用的潛在microRNA。在TargetScan中鑒定出57個(gè)microRNA，starbase和miRDB分別預(yù)測(cè)到10個(gè)和6個(gè)microRNA。Venny2.1.0對(duì)上述3個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)的microRNA取交集,結(jié)果顯示，只有hsa-miR-4731-5p是TargetScan、starbase和miRDB的共同元素?？梢?jiàn)，ERGIC3可能通過(guò)microRNA途徑調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的病理生理學(xué)功能。

圖6 3種生物信息學(xué)算法預(yù)測(cè)的microRNA數(shù)量

3 討論

ERGIC3是ERGIC膜蛋白家族成員之一，主要參與蛋白質(zhì)的囊泡運(yùn)輸[5-6,8,21]。GO富集分析結(jié)果顯示ERGIC3相關(guān)基因主要富集在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體和囊泡等方面，這與先前報(bào)道相符合。囊泡運(yùn)輸對(duì)于細(xì)胞的生理過(guò)程至關(guān)重要， 其運(yùn)輸障礙與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22]。通過(guò)分析我們認(rèn)為異常表達(dá)的ERGIC3可能通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)[10]的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸來(lái)影響肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移。我們通過(guò)大數(shù)據(jù)研究，新發(fā)現(xiàn)ERGIC3還參與到了肺腺癌免疫微環(huán)境的調(diào)控。

近年來(lái)，腫瘤免疫療法獲得了發(fā)展勢(shì)頭，通過(guò)增強(qiáng)T細(xì)胞活性來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)的藥物已經(jīng)在廣泛的實(shí)體腫瘤中顯示出了臨床療效[23]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如程序性細(xì)胞死亡蛋白1(Programmed cell death protein1，PD-1)/程序性細(xì)胞死亡蛋白配體1(Programmed cell death protein ligand1，PD-L1)抑制劑為肺癌、腎癌和其他類(lèi)型的腫瘤帶來(lái)更多的生存獲益，并已被批準(zhǔn)用于某些癌癥的治療[23]。為進(jìn)一步闡明肺腺癌中ERGIC3的免疫功能，使用TIMER算法計(jì)算免疫細(xì)胞群的豐度，ERGIC3的表達(dá)水平與CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，而與B細(xì)胞無(wú)關(guān)。研究表明各種免疫細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有顯著影響[24-25]，比如M2型的巨噬細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管形成參與腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移等[26]。提示ERGIC3在LUAD發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)中，其高表達(dá)抑制了上述免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織，從而抑制免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除作用，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)過(guò)程。

microRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)靶向不同的基因參與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展[20,27]。本研究借助TargetScan、starbase和miRDB及Venny2.1.0發(fā)現(xiàn)hsa-miR-4731-5p可能是以ERGIC3為靶點(diǎn)的新的microRNA。先前研究發(fā)現(xiàn)miR-490-3p通過(guò)靶向ERGIC3調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (Epithelial-mesenchymal transition， EMT)[13]，然而，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)miR-490-3p顯著影響NSCLC細(xì)胞中ERGIC3的表達(dá)[9]，可見(jiàn)，ERGIC3在不同癌癥中的調(diào)控機(jī)制可能不同。此外，文獻(xiàn)表明miR-203a下調(diào)誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞中ERGIC3過(guò)表達(dá)[9]。hsa-miR-4731-5p[28]，尤其是miR-203a[29]是潛在的肺腺癌的腫瘤標(biāo)志物，可能為肺腺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估增加新成員。

總之，該研究除了進(jìn)一步證明ERGIC3在肺腺癌中高表達(dá)、與肺腺癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移有關(guān)外，新發(fā)現(xiàn)為ERGIC3在肺腺癌的免疫調(diào)節(jié)中的潛在作用，以及與ERGIC3調(diào)控相關(guān)的microRNA在肺腺癌的發(fā)病機(jī)制與潛在預(yù)后生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)具有重要意義。