朱洪萱，黃天養(yǎng)，余孝云，曹永軍，尚 強(qiáng)，張存珍，余琳玲，劉連生，崔國(guó)禎

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 生物工程系，廣東 珠海 519041；2.國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，廣東 珠海 519090；3.蘇州大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

花旗參是人參的一種，又稱西洋參，為五加科多年生草本植物西洋參的干燥根。花旗參原產(chǎn)于北美洲地區(qū)，經(jīng)過引種栽培，我國(guó)現(xiàn)已成為世界上花旗參三大主產(chǎn)國(guó)之一[1]，并收載于《中國(guó)藥典》?；ㄆ靺⒅泻卸喾N對(duì)人體有益成分[2]，其功能包括抗氧化[3]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂[4]、抗腫瘤[5-6]、防治腸炎[7]和調(diào)節(jié)免疫力等[8]。有研究表明，其主要活性成分為次生代謝物-人參皂苷(主要是三萜皂苷類化學(xué)物質(zhì))[9]。目前已分離鑒定的人參單體皂苷有40余種，其中Rhl、Rf、Re、Rc和Rb1為花旗參人參皂苷中的主要成分，各自具有其獨(dú)特的功能與活性，以上成分的血液含量多少直接影響其藥理學(xué)功能的產(chǎn)生。2020年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定了花旗參中以人參皂苷Rb1、Re和Rg1為質(zhì)量標(biāo)志物。

市場(chǎng)上常見的花旗參產(chǎn)品主要有人參口服液、膠囊、飲片等純參制劑及以花旗參為主要原料的復(fù)方制劑。在中藥各成分藥效作用的發(fā)揮中，入血吸收是關(guān)鍵因素之一。花旗參茶是把花旗參經(jīng)過65%的乙醇浸提濃縮后，再經(jīng)制粒工藝制備而成的花旗參顆粒制劑。目前，作為顆粒制劑的花旗參茶與純參制劑的花旗參飲片泡水口服后，入血的有效成分相關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)研究還未見報(bào)道。在本研究中，我們比較了大鼠灌胃相同質(zhì)量花旗參生藥制備的花旗參飲片水提物和花旗參茶水溶液后，觀察5種人參皂苷Rh1、Rf、Re、Rc和Rb1入血吸收情況及入血吸收前后濃度隨時(shí)間的變化，為花旗參制品的制備方法選擇和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 花旗參飲片購(gòu)自珠海市源春林藥業(yè)有限公司；鷹牌花旗參茶(后面統(tǒng)稱為花旗參茶)由健康藥業(yè)(中國(guó))有限公司加工生產(chǎn)(G20050764)，人參莖葉總皂苷以及人參皂苷單體Rh1(批號(hào)：HG027748198)、Rf(批號(hào)：HG027172198)，Re(批號(hào)：HG027169198)、Rc(批號(hào)：HG027168198)、Rb1(批號(hào)：HG027159198)和地高辛(批號(hào)：HD212626)對(duì)照品均購(gòu)自寶雞市辰光生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物 雄性SD大鼠(動(dòng)物合格證：SCXK(粵)2018-0002)，體重300～350 g，購(gòu)自于廣東實(shí)驗(yàn)中心，按照我們報(bào)道的方法[10]，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：倫審[2020]2-075號(hào)。

1.3 試劑 甲醇(批號(hào)：M116125)、乙腈(批號(hào)：A298777)、甲酸(批號(hào)：F298780)均為色譜純和肝素鈉(批號(hào)：H104201)均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.4 儀器 安捷倫1290-6530Q-TO超高壓液相色譜/四極桿串聯(lián)(美國(guó)安捷倫)，XS205DU RE分析天平(梅特勒)，Multifuge X1R高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific)，氮吹儀(中國(guó)鄭州寶晶電子科技有限公司)，旋渦器(中國(guó)艾卡儀器設(shè)備有限公司)。

1.5 花旗參溶液的制備 水泡花旗參飲片溶液的制備：取0.294 g花旗參飲片浸泡于42 mL沸水中浸泡4 h，將其去渣后備用；花旗參茶的制備：取由相同質(zhì)量制備的花旗參茶1.26 g(每包凈重3 g，花旗參生藥含量為0.7 g)溶于42 mL水中備用。

1.6 色譜-質(zhì)譜條件 參考我們報(bào)道的方法[11]，對(duì)色譜和質(zhì)譜的檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。Phenomenex C18色譜柱(150 mm×2.0 mm，5 μm)，柱溫45oC，流動(dòng)相為0.1%的甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～10 min，0～95% B；10～12 min，95%～5% B；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。對(duì)于質(zhì)譜條件，離子化方式采用電噴霧離子化(ESI)(負(fù)離子模式)；檢測(cè)電壓3.5 kV；霧化氣N2體積流量1.5 L/min；干燥氣N2體積流量5 L/min；曲型脫溶劑裝置(CDL)溫度250oC；加熱塊溫度200oC。選擇性離子監(jiān)測(cè)(SIM)各人參皂苷的[M+Cl]-或者[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 人參皂苷對(duì)照品溶液制備：分別精密稱取人參皂苷Rh1、Rf、Re、Rb1和Rc 1.0 mg置于量瓶中，然后加入甲醇溶解并定容至1 mL，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的母液對(duì)照品溶液，于-20oC保存。內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取1 mg地高辛置于量瓶中，然后加入甲醇溶解并定容至1 mL，制成1 mg/mL的母液內(nèi)標(biāo)溶液，于-20oC保存。

1.8 含藥血漿的制備 將18只雄性SD大鼠隨機(jī)分成花旗參組、花旗參飲片組和空白組，按大鼠體重計(jì)算給藥量，隔夜禁食后，前兩組分別給予花旗參茶以及水泡花旗參飲片溶液，用生藥濃度75 mg/kg灌胃，灌胃體積為0.1 mL/kg，空白組灌胃純凈水。然后分別于10、20、30、45 min及1、2、4、6、8、12、24、48、72 h眼底靜脈叢取血，置于含有肝素鈉的EP管中，每次0.15 mL，1 500 g，離心5 min，取上層血漿，于-80oC保存待用。

1.9 血漿樣品的處理 取50 μL血漿，加入1 mg/mL地高辛溶液(內(nèi)標(biāo))5 μL，震蕩30 s，加入1 mL甲醇，震蕩3 min，13 600 g離心3次，吸取上清液0.8 mL，置于45oC離心濃縮裝置氮吹儀40oC吹干；100 μL甲醇溶解樣品，過0.22 μm濾膜后，2 μL進(jìn)樣分析。

1.10 方法學(xué)考察

1.10.1 專屬性考察 取空白血漿和加入人參皂苷單體標(biāo)準(zhǔn)品及地高辛的血漿各50 μL，按1.5.6項(xiàng)血漿樣品處理方法處理，并按照1.5.2項(xiàng)色譜條件和1.5.3項(xiàng)質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，然后根據(jù)各人參皂苷單體標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的相對(duì)分子量提取離子色譜(EIC,Extract ion chromatograpy)圖，通過比對(duì)空白血漿及含有標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)的EIC圖，判斷方法專屬性。

1.10.2 線性關(guān)系和定量限考察 取大鼠空白血漿50 μL，加入不同量的混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0.2、1、5、12.5、25 mg/L，按1.5.6項(xiàng)血漿樣品處理方法處理，并按照1.5.2項(xiàng)色譜條件和1.5.3項(xiàng)質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。記錄各對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)與對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)作線性回歸，以信噪比S/N > 10的最低濃度作為定量限。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 大鼠空白血漿、空白血漿+混合對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液樣品的色譜圖見圖1。人參皂苷Rh1、Rf、Re、Rc、Rb1和內(nèi)標(biāo)地高辛在空白血漿中的保留時(shí)間分別為4.841、4.352、3.555、4.613、4.503、4.434 min，不加標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的空白血樣無(wú)色譜峰。在本試驗(yàn)條件下，人參莖葉總皂苷中5種人參皂苷成分與內(nèi)標(biāo)地高辛均有良好的分離度，血漿中雜質(zhì)不干擾目標(biāo)化合物的測(cè)定，表明方法專屬性良好。

A：空白血漿；B：空白血漿+混合對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 線性關(guān)系考察 5種人參皂苷成分在0.2～25 mg/L質(zhì)量濃度與峰面積比線性關(guān)系良好?？瞻字貜?fù)進(jìn)樣10次以上，測(cè)量的信噪比S/N值標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍作為最低定量限，最低定量限在0.2 mg/L。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 人參中5個(gè)指標(biāo)成分的線性關(guān)系和最低定量限

2.3 藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 基于本研究建立的方法對(duì)分別給予花旗參茶和水泡花旗參飲片的大鼠后不同時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品進(jìn)行測(cè)定，各人參皂苷單體的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。由圖2的結(jié)果可得，12個(gè)不同監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)花旗參茶處理組大鼠血漿中的人參皂苷單體Rh1、Rf、Re、Rc和Rb1的血藥濃度(包括最高血藥濃度)均比花旗參飲片處理組的血藥濃度高。

A：水泡花旗參飲片和花旗參茶Rc的血藥濃度對(duì)比；B：水泡花旗參飲片和花旗參茶Re的血藥濃度對(duì)比；C：水泡花旗參飲片和花旗參茶Rf的血藥濃度對(duì)比；D：水泡花旗參飲片和花旗參茶Rb1的血藥濃度對(duì)比；E：水泡花旗參飲片和花旗參茶Rh1的血藥濃度對(duì)比；如果以上樣品的監(jiān)測(cè)濃度超出線性范圍外，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇稀釋相應(yīng)的倍數(shù)后進(jìn)行上樣檢測(cè)。

血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)通過Winnonlin軟件擬合出大鼠給藥后非房室模型的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表2所示?；ㄆ靺⒉杞?jīng)灌胃給藥后，大鼠血漿中Rh1、Rf、Re、Rc、Rb1血藥濃度時(shí)間曲線下面積(AUC0-t)分別為(857.56±127.01)、(252.75±37.54)、(274.34±41.67)、(380.03±103.84)、(232.88±74.10)mg/h·L；；血藥濃度的峰值(Cmax)分別為(109.88±26.79)、(31.18±5.49)、(47.49±8.67)、(42.35±7.26)、(39.74±6.41)mg/L；血藥濃度達(dá)到峰值所需的時(shí)間(Tmax)分別為(1.00±0.17)、(1.00±0.27)、(1.00±0.24)、(0.75±0.23)、(1.00±0.17)h；半衰期(T1/2)分別為(39.83±7.41)、(78.02±22.04)、(123.71±54.17)、(143.85±48.53)、(62.12±24.07)h；在大鼠體內(nèi)停留時(shí)間(MRT)分別為(23.44±1.37)、(27.69±1.94)、(29.38±2.51)、(33.07±3.58)、(30.15±10.17)h。而水泡花旗參飲片經(jīng)灌胃口服后，大鼠血液內(nèi)大鼠血漿中Rh1、Rf、Re、Rc、Rb1血藥濃度時(shí)間曲線下面積(AUC0-t)分別為(119.17±9.80)、(26.03±2.92)、(10.91±1.98)、(25.47±1.80)、(27.85±3.00)mg/h·L；血藥濃度的峰值(Cmax)分別為(11.66±1.44)、(1.99±0.45)、(1.17±0.12)、(0.99±0.23)、(0.99±0.28)mg/L；血藥濃度達(dá)到峰值所需的時(shí)間(Tmax)分別為(3.33±1.15)、(3.33±1.15)、(2.00±0.35)、(1.00±0.13)、(1.67±0.58)h；半衰期(T1/2)分別為(34.61±4.98)、(50.79±17.50)、(60.78±23.18)、(41.65±9.14)、(31.47±21.60)h；在大鼠體內(nèi)停留時(shí)間(MRT)分別為(21.87±0.48)、(22.75±1.88)、(24.69±2.14)、(29.26±0.29)、(23.72±1.96)h?；ㄆ靺⒉杞M各皂苷的藥-時(shí)曲線下面積和血藥濃度的峰值均大于水泡花旗參飲片組。各皂苷在大鼠體內(nèi)駐留時(shí)間和半衰期都較水泡花旗參飲片組有明顯的增加，并能夠在更短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到更高的血藥濃度。藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明大鼠對(duì)花旗參茶中人參皂苷的吸收和代謝明顯優(yōu)于水泡花旗參飲片。

表2 水泡花旗參飲片和花旗參茶的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)比

3 討論

花旗參的主要活性成分為人參皂苷類化合物，根部中多達(dá)幾十種。人參皂苷的藥理活性，特別是在免疫調(diào)節(jié)方面的重要作用一直是國(guó)內(nèi)外專家和學(xué)者研究的熱點(diǎn)[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Re能夠通過巨噬細(xì)胞Toll樣受體4(TLR4)途徑來表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)活性[13]。人參皂苷Rc能夠抑制靶向結(jié)合激酶1(TBK1)并且對(duì)下游信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)來減輕炎癥反應(yīng)[14]。人參皂苷Rh1可以顯著降低IF-4、IF-5的合成，有效減輕哮喘的炎癥反應(yīng)[15]。然而有研究表明，人參皂苷體內(nèi)生物利用度較低，難以更好發(fā)揮其療效[16]。因此，研發(fā)具有緩釋長(zhǎng)效、生物利用度高的人參皂苷新劑型具有十分重要的臨床意義。

本研究將花旗參通過醇溶劑提取后，使人參總皂苷能夠充分提取，單體皂苷成分完全溶解，易被人體吸收，對(duì)今后研發(fā)人參皂苷新劑型的產(chǎn)品研發(fā)具有重要的參考價(jià)值。采用LC-MS的檢測(cè)方法，經(jīng)花旗參茶和花旗參飲片灌胃干預(yù)大鼠后，測(cè)定血漿中人參皂苷Rh1、Rf、Re、Rc、Rb1的含量，并通過藥代動(dòng)力學(xué)研究花旗參在大鼠體內(nèi)的代謝。試驗(yàn)結(jié)果(見圖2、表2)顯示，與泡水花旗參飲片組相比，花旗參茶組的血漿中人參皂苷Rh1、Rf、Re、Rc、Rb1達(dá)到最高血藥濃度的時(shí)間更短，達(dá)到的最高血藥濃度更高，有效成分的血藥濃度在相同時(shí)間消除率更低，表明花旗參茶有效總皂苷成分更容易被大鼠吸收進(jìn)入體內(nèi)，并且在大鼠體內(nèi)維持的時(shí)間更久，有更好的生物利用度。因此，花旗參茶的制備工藝，能提高藥材資源的利用率，對(duì)實(shí)現(xiàn)藥材資源的充分利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。