王昕芃，王君穎，蔡佳翌，付婉彬，鐘 華

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院血液科，上海 200127；2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院中心實驗室，上海 200127

原發(fā)免疫性血小板減少癥 （immune thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性自身免疫性疾病，其特征是由于血小板破壞增加和血小板生成受損導致的血小板計數(shù)減少從而出現(xiàn)出血、紫癜等促凝血紊亂癥狀，嚴重時可導致顱內出血等嚴重并發(fā)癥并危害生命［1］。血小板在骨髓微環(huán)境中生成：造血干細胞從成骨細胞微環(huán)境遷移到血管微環(huán)境并最終分化為巨核細胞，隨后經(jīng)歷增殖、分化和成熟最終產生血小板。骨髓微環(huán)境主要由非造血細胞、可溶性因子和細胞外基質蛋白組成，它們共同構成一個復雜的調控網(wǎng)絡，可調節(jié)巨核細胞的成熟和血小板的生成。骨髓微環(huán)境中許多組分都參與調節(jié)血小板前體形成和最終血小板釋放到血流中的過程［2］。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）作為骨髓微環(huán)境中的重要組成部分，其最大特點是具有強大的免疫抑制功能。MSC 可以同時抑制T 細胞和B 細胞的增殖與活化，并降低抗原提呈細胞共刺激分子的表達，刺激調節(jié) 性T 細 胞（regulatory T cell，Treg 細 胞） 的 分化［3-5］。MSC 被認為對巨核細胞的功能具有調節(jié)作用。越來越多的證據(jù)［6-8］表明ITP中的MSC表現(xiàn)出增殖和功能受損，MSC缺陷在ITP的發(fā)病機制中起關鍵作用。我們之前的研究［9］表明，來自ITP 患者的MSC 表現(xiàn)出細胞凋亡增加，以及支持巨核細胞分化和血小板生成的能力不足。與此同時，有文獻［10-11］報道了輸注MSC 可有效改善ITP 小鼠模型的血小板水平。有臨床試驗［12］顯示，通過靜脈輸注給予慢性難治性ITP患者人臍帶MSC取得了較好療效。

已有研究［13-14］表明，異常的DNA 甲基化與ITP的病因有關。甲基化缺陷導致甲基化相關基因過表達，如CD70和FOXP3（forkhead box P3），這些基因可以參與自身免疫反應，最終加速ITP 的進展。與此同時，有文獻報道了DNA 甲基轉移酶抑制劑可以減少MSC 衰老［13］、改善細胞遷移［15］、恢復干細胞干性［16］、 提 升 免 疫 抑 制 功 能［17］。 地 西 他 濱（decitabine，DAC）是一種有雙重功能的DNA 甲基轉移酶抑制劑，低劑量時表現(xiàn)出去甲基化作用，可引導細胞分化成熟，而高濃度的DAC 可產生細胞毒活性，導致細胞死亡。臨床上，地西他濱主要應用于治療骨髓增生異常綜合征、鐮狀細胞貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血。臨床研究［18］證明，低劑量地西他濱可促進ITP 患者巨核細胞的分化成熟和血小板生成，但對于低劑量地西他濱是否通過改善MSC 的功能發(fā)揮上述作用目前尚不清楚。本研究旨在研究低劑量地西他濱對ITP 患者來源的MSC 的增殖、凋亡等生物學行為的調節(jié)作用并探索其機制，為慢性ITP 臨床治療提供新的實驗室理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究納入2020 年4 月—2021 年10 月上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院血液科門診或住院的ITP 發(fā)病期患者10 例，其中女性7 例、男性3 例，平均年齡65.7歲，中位年齡70.5歲，平均血小板計數(shù)45.7×109/L（中位數(shù)41×109/L）。患者診斷依據(jù)2009 年國際協(xié)作組制定的ITP 診斷標準［19］。所有患者在收集標本前4周內未接受任何ITP治療。

納入同期非ITP 患者10 例作為對照（NC）組，均為經(jīng)過骨髓穿刺證實無巨核細胞成熟障礙的血液科門診或住院患者，并且無其他累及骨髓異常的疾病；其中男性4 例、女性6 例，平均年齡57.4 歲，中位年齡62.5 歲，平均血小板計數(shù)為170×109／L（中位數(shù)170.5×109／L）?；颊咛卣鲄R總見表1。標本的取得均獲得了患者的知情同意。

表1 納入研究的ITP患者和對照組的臨床信息Tab 1 Clinical information of the ITP patients and the normal controls enrolled in the study

1.2 主要試劑和儀器

DMEM 低糖培養(yǎng)液購自中國杭州吉諾生物技術有限公司，胎牛血清（FBS）購自美國賽默飛世爾科技有限公司，CCK-8 試劑盒購自東仁化學科技（日本）有限公司，人間充質干細胞分析試劑盒（human MSC analysis kit）、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒購自美國BD 生物科學有限公司，EdU 細胞增殖檢測試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，微管熒光探針（tubulin-tracker red）、Hoechst 33258購自上海碧云天生物技術有限公司，抗促凋亡蛋白BAX 抗體（目錄號5023）、 抗胱天蛋白酶3（caspase3）抗體（目錄號9662）、抗cleaved-caspase3抗體（目錄號9664） 購自美國Cell Signaling Technology 公司，山羊抗兔IgG 二抗（目錄號ab205718）、兔抗小鼠IgG 二抗（目錄號ab6728）購自美國Abcam公司。

多功能酶標儀（Synergy H1M）購自美國BioTek儀器有限公司，化學發(fā)光及雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（Odyssey FC）購自美國Licor生物科技有限公司，流式細胞分析儀（LSRFortessa）購自美國BD 生物科學有限公司，激光共聚焦顯微拍攝系統(tǒng)（LSM 800）購自德國蔡司集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 MSC 的分離培養(yǎng)及表面標志物的鑒定 取骨髓穿刺標本3～5 mL 置于EDTA 抗凝管中，加入DMEM 低糖培養(yǎng)基后重懸，離心，棄上清液；下層沉淀接種于細胞培養(yǎng)瓶，以DMEM 培養(yǎng)基（含10%FBS）培養(yǎng)，并采用差速貼壁法使MSC 黏附。第2～6代細胞用于后續(xù)實驗。

骨髓MSC 鑒定：使用人間充質干細胞分析試劑盒對體外培養(yǎng)的骨髓MSC 進行初步表型鑒定。取分離傳代的第3 代細胞，按試劑盒使用書操作，于流式細胞儀上檢測。

1.3.2 熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)和細胞增殖情況 將EdU 試劑加入已貼壁24 h 的MSC 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h。隨后用預冷PBS 洗滌2 次，并用4%多聚甲醛固定15 min。經(jīng)0.1% Triton-X 透化和BCA 封閉后，按EdU細胞增殖檢測試劑盒說明書操作。隨后將細胞與Hoechst 33258 和微管熒光探針一起溫育，洗滌封片后在熒光顯微鏡下觀察染色的細胞。

1.3.3 CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖狀況檢測 將細胞濃度調至2×105/mL，每孔100μL 接種到96 孔細胞培養(yǎng)板上，并培養(yǎng)12～24 h，隨后將CCK-8 試劑添加到孔中并孵育，最后在酶標儀上測定450 nm 處的吸光度值［D（450 nm）］。

1.3.4 細胞凋亡水平檢測 將貼壁24 h 的MSC 細胞爬片，用預冷PBS 洗滌2 次，并用4%多聚甲醛固定15 min。加入少量Hoechst 33258 覆蓋樣本后室溫放置3～5 min。吸除Hoechst 33258 染色液，用PBS 洗滌2～3次，每次3～5 min。封片后熒光顯微鏡下觀察。

采用細胞凋亡雙染試劑盒檢測細胞凋亡水平。收集細胞重懸于結合緩沖液（binding buffer），每份樣品約5×105個細胞，隨后按照說明書操作，最后在流式細胞儀上檢測。實驗重復3次。

1.3.5 地西他濱濃度探索 根據(jù)參考文獻［8，10，12］探索地西他濱的最適濃度和作用時間。將ITP 患者來源的MSC（MSC-ITP）按地西他濱的處理濃度（10、5、1、0.5 和0 μmol/L）分為5 個組。每個組設5 個孔，CCK-8 法分別記錄0 h、12 h、24 h、48 h 時的吸光值。找到刺激MSC-ITP 的最佳處理濃度和處理時間。

1.3.6 Western blotting檢測凋亡相關蛋白表達量 將細胞用預冷的PBS 洗滌2 次，并在冰上裂解細胞，提取蛋白。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。之后將膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h。清洗3 次，加入一抗（抗BAX 抗體、抗caspase3 抗體、抗cleaved-caspase3 抗體）孵育，β-肌動蛋白（β-actin）作為內參蛋白。清洗3 次，加入抗小鼠或抗兔的二抗孵育。使用ECL 化學發(fā)光試劑盒進行顯影。所有實驗進行3次，通過ImageJ軟件進行定量分析，通過將每個蛋白條帶的單獨灰度除以β-肌動蛋白來計算歸一化灰度。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用Graphpad Prism 8.0 軟件對各實驗結果進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的定量資料采用±s表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析法。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。每組數(shù)據(jù)獨立重復3次。

2 結果

2.1 MSC表型鑒定

采用流式細胞術分析研究體外培養(yǎng)的ITP 患者來源（n=5）及對照組來源（n=5）的細胞表面抗原標志物。ITP 患者及對照組細胞表面表達CD90、CD73和CD105 （圖1），不表達CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR等。這些結果表明ITP患者及對照組體外培養(yǎng)并分離的長梭形貼壁細胞在表型上與典型的MSC一致。

圖1 流式細胞術鑒定體外培養(yǎng)MSC表型Fig 1 Phenotype of MSCs cultured in vitro identified by flow cytometry

2.2 ITP 患者來源MSC 細胞形態(tài)異常和細胞增殖減弱

如圖2 所示，MSC-NC 在培養(yǎng)過程中擴增并獲得紡錘形形態(tài)；相比之下，MSC-ITP 擴增速度較慢（圖2A）。CCK-8 法測定顯示，MSC-ITP 與對照組相比增殖能力較低（圖2B）。EdU 測定也顯示MSC-ITP與對照組相比增殖能力受損；微管熒光探針顯示MSC-ITP 與對照組相比，細胞體積增大，形態(tài)扁平，失去長梭形形態(tài)并出現(xiàn)多個類似絲足的長細胞突起（圖2C）。

圖2 ITP患者來源MSC增殖水平和細胞形態(tài)檢測Fig 2 Detection of proliferation and morphology of MSCs derived from ITP patients

2.3 ITP患者來源MSC基礎凋亡增多

使用Hoechst 33258 染液對MSC 的凋亡進行形態(tài)學測定。MSC-NC 具有正常的圓形和規(guī)則的細胞核；相比之下，在MSC-ITP 中觀察到較多的細胞核碎裂，呈致密濃染，這是凋亡細胞的特征（圖3A）。我們使用雙染凋亡試劑盒進一步評估了細胞凋亡率。MSCITP的總凋亡率（AV+PI+/?）顯著高于MSC-NC，且主要以晚期凋亡（AV+PI+）為主（圖3B）。

圖3 ITP患者來源MSC基礎凋亡水平檢測Fig 3 Detection of basal apoptosis in MSCs derived from ITP patients

2.4 地西他濱增強ITP 患者來源MSC 增殖活性的最佳濃度

用CCK-8 法研究DNA 甲基轉移酶抑制劑地西他濱對MSC-ITP 細胞增殖能力的提升作用。如圖4 顯示，地西他濱對促進MSC-ITP 的作用具有一定的濃度依賴性，其最佳作用濃度為2.5 μmol/L，最佳作用時間為24 h；與其他濃度相比，2.5 μmol/L 地西他濱處理24 h 后，培養(yǎng)體系中MSC-ITP 的增殖效率最高。

圖4 CCK-8法測定不同劑量、不同處理時間下地西他濱對MSC-ITP增殖的影響Fig 4 Effect of decitabine on MSC-ITP proliferation under different doses and working hours detected by CCK-8 assay

2.5 地西他濱處理后ITP患者來源MSC凋亡減少

如圖5A 所示，MSC-ITP 在2.5 μmol/L 地西他濱處理24 h后細胞核形態(tài)得到改善，細胞核的碎裂和凝聚減少，MSC-ITP總凋亡率顯著降低（P=0.015），而MSC-NC 凋亡也減少，但差異無統(tǒng)計學意義（圖5B）。

圖5 2.5 μmol/L地西他濱處理24 h后MSC-ITP的凋亡檢測Fig 5 Apoptosis detection of MSC-ITP after 2.5 μmol/L decitabine treatment for 24 h

2.6 地西他濱減少MSC 凋亡可能與線粒體凋亡通路有關

線粒體在細胞凋亡中發(fā)揮著關鍵性作用。為了研究地西他濱處理后MSC-ITP 凋亡過程中線粒體凋亡通路活化水平的變化，采用Western blotting 進行蛋白層面的研究。如圖6 結果顯示：MSC-ITP 凋亡相關蛋白BAX、caspase3 和cleaved-caspase3 水平均較高，用2.5 μmol/L 地西他濱處理24 h后，這些蛋白水平均顯著下降（均P<0.05）。從蛋白水平證明低劑量地西他濱可以降低MSC 的凋亡水平，且這種保護作用可能與抑制線粒體凋亡通路有關。

圖6 Western blotting檢測凋亡相關蛋白BAX、caspase-3和cleaved-caspase3的表達量Fig 6 Expression levels of apoptosis-related proteins BAX,caspase-3 and cleaved-caspase3 detected by Western blotting

3 討論

原發(fā)ITP 發(fā)病機制目前尚未完全闡明，免疫失耐受導致血小板破壞增加或血小板產生不足可能是患者發(fā)病的重要原因。免疫異常主要涉及體液免疫、細胞免疫2個方面［20］：體液免疫方面，表現(xiàn)為T細胞亞群功能異常和細胞比例失調導致B細胞異常激活，產生大量血小板表面膜糖蛋白特異性抗體，并加強了單核巨噬系統(tǒng)對血小板的破壞；細胞免疫方面，表現(xiàn)為細胞毒性T細胞的異?；罨瘜е聦φＱ“宓臍龆?，同時Treg 細胞的減少和功能受損，輔助T 細胞Th1/Th2比例失衡，Th17及Th22細胞增多等。

成骨細胞、血管周圍細胞、內皮細胞、間充質細胞和各種成熟的免疫細胞等多種細胞構成了骨髓微環(huán)境［21］。血小板生成發(fā)生在骨髓微環(huán)境中，其中各個組分都會影響血小板的生成。ITP 患者的骨髓微環(huán)境異常表現(xiàn)包括Th1、Tc1 和Th17 細胞的過度極化以及Treg 細胞的顯著減少［22］。MSC 作為骨髓微環(huán)境中重要組成部分，是十分重要的免疫抑制類細胞。很多研究［6-8］發(fā)現(xiàn)，慢性ITP患者來源的骨髓MSC的增殖能力受損，抑制活化T細胞增殖的能力較弱，誘導Treg細胞的能力較弱。此外，在ITP 動物模型或患者中，通過移植正常骨髓或臍帶的MSC 可逆轉Th1/Th2 細胞因子的失衡狀態(tài)，改善血小板的生成，并減輕巨核細胞功能障礙，這表明MSC 的損傷可能與ITP 的發(fā)病機制有關［23］。

多種自身免疫性疾病存在基因組DNA 的異常甲基化，且異常甲基化與疾病的發(fā)病有關。ITP 作為一種自身免疫性疾病，同樣存在DNA甲基化異常現(xiàn)象。研究［24］發(fā)現(xiàn)，ITP 患者血漿S-腺苷同型半胱氨酸濃度升高，外周血單個核細胞中DNA 甲基轉移酶3A（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A） 和DNMT3B在mRNA 水平上顯著低于對照組。地西他濱是一種具有雙重機制的去甲基化藥物：低劑量地西他濱（<5 μmol/L）處理可以促進巨核細胞生長分化［18，25］、調節(jié)T 細胞穩(wěn)態(tài)［26］、抵御MSC 衰老［16］等；大劑量地西他濱（>10 μmol/L）處理人骨髓增生異常綜合征（MDS）細胞系SKM-1 后，凋亡率大于20%［27］。在急性T 淋巴細胞白血病細胞株MOLT4 細胞中，地西他濱作用呈現(xiàn)劑量依賴性，10 μmol/L 誘導凋亡率為43.70%，50 μmol/L誘導凋亡率為62.38%［28］。

研究表明低劑量地西他濱在免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用?；贕O 和KEGG 數(shù)據(jù)庫的基因微陣列分析［29］發(fā)現(xiàn)，地西他濱上調的基因大部分富集于免疫調節(jié)通路和與免疫相關的信號轉導通路。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MSC-ITP 與對照組相比增殖能力受損，增殖速度明顯緩慢；同時細胞形態(tài)改變，表現(xiàn)為細胞體積增大，形態(tài)扁平，失去長梭形形態(tài)，并出現(xiàn)多個類似絲足的長細胞突起，而這種細胞形態(tài)改變被認為是受到微環(huán)境中炎癥相關介質的影響［30］。在其細胞核染色過程中我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MSC-ITP 的細胞核碎塊狀致密濃染明顯較多，整體細胞核大小形態(tài)也不均一，這些是凋亡的主要特征。凋亡試劑盒和流式細胞術進一步評估了細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)MSC-ITP的總凋亡率高于MSC-NC，其中主要以晚期凋亡為主。

有不同文獻報道了地西他濱對于MSC 的刺激作用，然而其最佳工作濃度和工作時間不盡相同。本研究利用濃度曲線測定顯示，地西他濱濃度為2.5 μmol/L且在處理24 h 后，培養(yǎng)體系中MSC-ITP 的增殖效率最高；而在10 μmol/L 處理時則無明顯的促細胞增殖作用。利用2.5 μmol/L 地西他濱處理24 h 后，MSCITP 細胞核形態(tài)改善，細胞核的碎裂和凝聚減少。我們的結果顯示，去甲基化藥物可能有刺激MSC 增殖、減少MSC-ITP凋亡的作用。

細胞凋亡，也稱為程序性細胞死亡，是一種細胞自主機制，依賴于通路控制的caspase 和核酸酶的激活，導致受損細胞死亡而不影響鄰近細胞［31］。線粒體凋亡通路是凋亡最重要的通路。在細胞凋亡過程中，線粒體膜通透性增加，促凋亡因子釋放到細胞質中，從而激活caspase家族下游蛋白caspase3，凋亡進入不可逆階段［32］。我們的研究表明MSC-ITP 與對照組相比，凋亡通路蛋白水平更高，證明MSC-ITP 的凋亡與線粒體凋亡通路相關；而在小劑量地西他濱處理后MSC-ITP與對照組都表現(xiàn)出BAX降低，caspase-3和cleaved-caspase3 減少，證明MSC 凋亡被抑制，且低劑量地西他濱的這種保護作用可能與其抑制線粒體凋亡通路有關。

綜上所述，本研究通過體外培養(yǎng)ITP 患者和對照組來源的MSC 進行生物學行為比較，證明MSC-ITP表現(xiàn)出增殖能力受損和細胞凋亡增多，這表明MSC可能是ITP 發(fā)病機制中的重要一環(huán)。我們證明低劑量地西他濱可能通過抑制線粒體凋亡通路來保護ITP 患者來源的MSC 免受凋亡。本研究為進一步闡明ITP的發(fā)病機制及提升相關針對性治療的研究提供了新的體外實驗理論依據(jù)。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實驗均已通過上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院倫理委員會的審核批準（文件號RA-2014-267）。所有實驗過程均遵照《上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院倫理標準/守則》的條例進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by Ethics Committee of Renji Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （Approval Letter No. RA-2014-267）， and all experimental protocols were carried out by followingGuidelines of Renji Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻/Authors'Contributions

王昕芃、蔡佳翌、王君穎、鐘華參與實驗設計；王昕芃、付婉彬、鐘華參與論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意最終稿件的提交。

The study was designed by WANG Xinpeng， CAI Jiayi， WANG Junying and ZHONG Hua. The manuscript was drafted and revised by WANG Xinpeng， FU Wanbing and ZHONG Hua. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-02-11

·Accepted：2022-05-11

·Published online：2022-06-28