戴 芹，王偉銘

1.復(fù)旦大學(xué)附屬徐匯醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200031；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200025

IgA腎病是以多聚體IgA1系膜區(qū)沉積、系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)合成增加以及炎性細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞以及T細(xì)胞）浸潤(rùn)為特征的自身免疫性疾?。?］。低糖基化IgA1（glycosylation deficiency IgA1，Gd-IgA1）在循環(huán)中增多，并在系膜區(qū)沉積是IgA 腎病的重要特征［2］。我們的既往研究［3］發(fā)現(xiàn)，IgA 腎病患者血漿Gd-IgA1 濃度越高，尿蛋白的量則越多。Gd-IgA1 分子的血清濃度與腎小球組織損害程度也密切相關(guān)［4］，IgA 腎病的病理表現(xiàn)亦和預(yù)后相關(guān)［5-7］。上述研究結(jié)果均提示血漿中Gd-IgA1 濃度與IgA腎病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

Gd-IgA1 通過(guò)自身積聚或者與自身抗體IgG 結(jié)合形成免疫復(fù)合物沉積在腎臟引發(fā)腎臟損傷［8］。系膜細(xì)胞受到損傷后會(huì)出現(xiàn)系膜細(xì)胞肥大、增殖和系膜基質(zhì)擴(kuò)張等生物學(xué)反應(yīng)［9］。Gd-IgA1在系膜區(qū)沉積后繼發(fā)的炎癥、細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成導(dǎo)致了IgA腎病的進(jìn)展［10］。INOUE 等［11］通過(guò)ddY 小鼠研究發(fā)現(xiàn)：在不影響其血清IgA 濃度的情況下，抑制其腎組織中的炎癥可以延緩IgA 腎病的纖維化，改善IgA 腎病的預(yù)后。

本研究通過(guò)體外IgA 腎病細(xì)胞模型，應(yīng)用人炎癥因子蛋白芯片檢測(cè)系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的炎癥因子表達(dá)，并用組蛋白去乙?；福╤istone deacetylation，HDAC）抑制劑丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA）進(jìn)行干預(yù)，觀察其在IgA 腎病細(xì)胞模型中的抗細(xì)胞增殖和抗炎作用，希冀從表觀遺傳學(xué)角度為防治IgA 腎病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人系膜細(xì)胞（human renal mesangial cells，HMCs）購(gòu)于ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室（美國(guó)）。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 Jacalin/Agarose IgA1（Sigma，美國(guó)），丙戊酸鈉（Sigma，美國(guó)），人炎癥因子抗體芯片3 （AAH-INF-GS3-16；Raybiotech，美國(guó)），βactin rabbit mAb （HRP conjugate；CST，美 國(guó)），HDAC1（mouse monoclonal；CST，美國(guó)），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（ANOGEN，加拿大），其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2.2 主要儀器 超凈臺(tái)（1300系列A2；Thermo公司，美國(guó)）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（D-63450 Hanau；Heraeus公司，美國(guó)）；倒置相差顯微鏡（XSZ-D2；重慶光學(xué)儀器廠）；STS-2 型脫色搖床（上海斯特分析儀器有限公司）；低溫超速離心機(jī)（Eppendorf 公司，德國(guó)）等。

1.3 方法

1.3.1 親和層析法分離健康對(duì)照和IgA腎病患者中的IgA1 按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作，具體細(xì)節(jié)可參照我們的既往研究［12］。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

（1）細(xì)胞的干預(yù)方法 將狀態(tài)良好的HMCs按照1×105個(gè)/孔均勻種在6孔板或10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)。觀察細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，加入含1%FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h 后，分別加入不同類(lèi)型的IgA1 及同體積的PBS（對(duì)照組），或者VPA 預(yù)處理1 h。24 h 后收集培養(yǎng)上清液至無(wú)菌EP 管中?80 ℃保存待用。細(xì)胞用胰酶消化后PBS液洗2次，然后提取總蛋白。

（2）MTT 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為104～105個(gè)/mL，布板前反復(fù)吹打細(xì)胞懸液，盡可能使細(xì)胞均勻，以100 μL/孔加入細(xì)胞懸液，邊緣孔用無(wú)菌PBS 100 μL/孔填充。5%CO2、37 ℃孵育，至細(xì)胞貼壁后吸棄含10%FBS的DMEM，重新加入含有不同干預(yù)成分的1%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔，設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。5%CO2、37 ℃孵育20 h。每孔加入10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL MTT 溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀570 nm 處測(cè)量各孔的吸光度值。

1.3.3 AAH-INF-GS3-16 芯片操作流程 本實(shí)驗(yàn)共分為5 組： N-IgA1 組、 N-aIgA1 組、 P-IgA1 組、P-aIgA1以及無(wú)干預(yù)成分的僅含同體積PBS的對(duì)照組。玻片芯片完全干燥，加樣，封閉，孵育1 h；按操作說(shuō)明清洗芯片；每孔加入80 μL 配置好的生物素標(biāo)記抗體（16 孔）；室溫2 h；清洗后每孔加入70 μL 的1 500倍稀釋的熒光劑?鏈霉親和素，避光密封4 ℃過(guò)夜孵育。第2 日清洗芯片，拆除后再次清洗；放入離心機(jī)，甩干液體。用芯片掃描儀GenePix 4000B Microarray Scanner 掃描信號(hào)（掃描參數(shù)：PMT，650；波長(zhǎng)532 nm；分辨率10 μm）。

1.3.4 免疫印跡法 HMCs 在RIPA 緩沖液中裂解，提取總蛋白。蛋白質(zhì)定量后，以10 μg 蛋白上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后，加入一抗，4 ℃過(guò)夜孵育；洗膜10 min，3 次；加HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2 000），37 ℃孵育1 h；洗膜10 min，3 次。顯影：用Image reader LAS-4000 程序顯影拍攝。圖像分析：Image pro plus 圖像分析軟件處理數(shù)據(jù)。

1.3.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的表達(dá)

將提取的培養(yǎng)上清液按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)調(diào)節(jié)濃度，設(shè)立空白對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔及樣品檢測(cè)孔，依次加入一抗、二抗，最后顯色，觀察到樣本孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔變藍(lán)，每孔加入50 μL 終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀各孔的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism 6.0作圖。多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同IgA1 干預(yù)系膜細(xì)胞后培養(yǎng)上清液中炎癥因子的表達(dá)

2.1.1 人炎癥因子蛋白芯片的結(jié)果 如圖1 所示：P-aIgA1組蛋白芯片中有多個(gè)蛋白顯著高表達(dá)。

圖1 蛋白芯片檢測(cè)不同IgA1干預(yù)HMCs后培養(yǎng)上清液中炎癥因子的表達(dá)Fig 1 Expression of inflammatory factor in cultured HMCs supernatant induced by different IgA1s

2.1.2 蛋白芯片結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 如圖2所示，與對(duì)照組比較，P-aIgA1 組HMCs 培養(yǎng)上清液中白介素-6 可溶性受體（interleukin-6 soluble receptor，IL-6sR）、受激活調(diào)節(jié)的正常T 細(xì)胞表達(dá)和分泌因子（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）、金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）、金屬蛋白酶組織抑制因子2 （tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP2）、TNF-α 和腫瘤壞死因子Ⅱ型受體（tumor necrosis factor type Ⅱreceptor，TNFRⅡ）的表達(dá)水平均顯著上調(diào)（均P<0.01），分別為對(duì)照組的34 倍、124 倍、269 倍、100 倍、1.6 倍以 及52 倍；N-aIgA1、P-IgA1、P-aIgA1 都 能 促 進(jìn)TIMP2的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。

圖2 人炎癥因子蛋白芯片的統(tǒng)計(jì)分析Fig 2 Statistical chart of the array

2.2 不同成分的IgA1對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響

分別用含N-IgA1、P-IgA1、P-aIgA1 的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMCs 24 h后（以同體積的PBS干預(yù)HMCs為對(duì)照組），用MTT法觀察HMCs的增殖程度。結(jié)果（圖3）顯示：與對(duì)照組相比，N-IgA1 組對(duì)HMCs 的增殖無(wú)顯著的影響，P-IgA1 及P-aIgA1 都能顯著促進(jìn)HMCs的增殖（P=0.045 和P=0.003）；與N-IgA1 組相比，P-aIgA1 組HMCs 出現(xiàn)了顯著的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.036）。

圖3 不同的IgA1對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響Fig 3 Effects of different IgA1s on the proliferation of mesangial cell

2.3 不同濃度的P-aIgA1對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響

分別用含25、50、100 和250 μg/mL P-aIgA1 的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMCs（以同體積的PBS 干預(yù)HMCs 為對(duì)照組），觀察其對(duì)HMCs 增殖的影響。如圖4 所示，25 μg/mL 的P-aIgA1 就可以明顯地促進(jìn)HMCs的增殖，50 μg/mL 和100 μg/mL 的濃度促進(jìn)HMCs的增殖程度相似，250 μg/mL 促進(jìn)HMCs 的增殖程度最高。

圖4 不同濃度的P-aIgA1對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響Fig 4 Effects of different concentrations of P-aIgA1 on the proliferation of mesangial cell

2.4 不同IgA1對(duì)HMCs中HDAC1蛋白的影響

采用Western blotting 方法檢測(cè)了不同IgA1 對(duì)系膜細(xì)胞HDAC1 蛋白的影響，以同體積PBS 干預(yù)的HMCs 為對(duì)照組（圖5）。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，P-aIgA1、P-IgA1 及N-IgA1 均不同程度地增加了HMCs 中HDAC1 的表達(dá)，分別是對(duì)照組的（8.64±0.59） 倍、（5.42±0.16） 倍 和（5.87±0.58） 倍；與N-IgA1 組相比，P-aIgA1 組顯著增加了HDAC1 表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021）。

圖5 不同IgA1對(duì)系膜細(xì)胞HDAC1蛋白的影響Fig 5 Effects of different IgA1s on HDAC1 protein in HMCs

2.5 VPA對(duì)系膜細(xì)胞增殖及分泌TNF-α蛋白的影響

2.5.1 VPA 對(duì)P-aIgA1 引起的系膜細(xì)胞增殖的抑制作用 以同體積的PBS 干預(yù)HMCs 為對(duì)照組，用50 μg/mL 的P-aIgA1 作用HMCs 前分別用50、100、200、400、1 000 μg/mL的VPA進(jìn)行預(yù)處理1 h，觀察其對(duì)HMCs 增殖的抑制作用（圖6）。與對(duì)照組相比，50 μg/mL 的P-aIgA1 顯著促進(jìn)了HMCs 的增殖（P=0.009）。低濃度（50～200 μg/mL）的VPA 抑制HMCs增殖的作用不明顯，400 μg/mL的VPA 出現(xiàn)了顯著的抑制作用（P=0.028），1 000 μg/mL 的VPA 出現(xiàn)了過(guò)度抑制（P=0.002）。

圖6 不同濃度的VPA對(duì)P-aIgA1作用的HMCs增殖的影響Fig 6 Effects of different concentrations of VPA on the proliferation of mesangial cell induced by P-aIgA1

2.5.2 VPA 對(duì)系膜細(xì)胞分泌TNF-α 蛋白的影響 分別用N-IgA1、P-IgA1、P-aIgA1 及P-aIgA1+VPA 作用HMCs 24 h 后（以同體積的PBS 干預(yù)HMCs 為對(duì)照組），用ELISA法觀察HMCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白表達(dá)（圖7）。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，P-aIgA1 組TNF-α 蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）；與P-aIgA1 組比較，P-aIgA1+VPA組TNF-α 蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.035），表明VPA 可以抑制P-aIgA1 誘導(dǎo)的HMCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白的表達(dá)。

圖7 不同干預(yù)成分對(duì)HMCs培養(yǎng)上清液TNF-α 蛋白表達(dá)水平的影響Fig 7 Effects of different stimulators on TNF-α protein in HMCs cultured supernatant

3 討論

IgA腎病是全球活檢報(bào)告中最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球腎炎［13］，好發(fā)于年輕人，在診斷后20年內(nèi)，有30%～40%的患者發(fā)展為終末期腎?。?4-15］。然而，目前臨床上卻沒(méi)有有效的治療手段能夠阻止疾病的進(jìn)展。

腎組織中系膜細(xì)胞增殖及局部的炎癥是促進(jìn)IgA腎病疾病進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。本研究通過(guò)體外IgA 腎病模型探討含有Gd-IgA1復(fù)合物沉積腎臟后引發(fā)的系膜細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)。應(yīng)用人炎癥因子蛋白芯片觀察不同成分的IgA1 對(duì)人系膜細(xì)胞分泌炎癥因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，P-aIgA1 組HMCs培養(yǎng)上清液中IL-6sR、RANTES、TIMP1、TIMP2、TNF-α 和TNFRⅡ的表達(dá)水平顯著上調(diào)。上述結(jié)果表明P-aIgA1最能促進(jìn)系膜細(xì)胞釋放促炎癥因子。

為了進(jìn)一步研究不同成分的IgA1 對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響，我們分別用N-IgA1、P-IgA1和P-aIgA1作用于HMCs 24 h 后，用MTT 法觀察HMCs 的增殖程度。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，N-IgA1 組對(duì)HMCs的增殖無(wú)顯著的影響，P-aIgA1 及P-IgA1 組能夠顯著促進(jìn)HMCs 增殖。接著我們分別用不同濃度的P-aIgA1 作用HMCs，觀察其對(duì)HMCs 增殖的不同影響。結(jié)果顯示：25 μg/mL 的P-aIgA1 就可以明顯地促進(jìn)HMCs 的增殖，50 和100 μg/mL 的濃度促進(jìn)HMCs的增殖程度相似，250 μg/mL 促進(jìn)HMCs 的增殖程度最高，顯示了P-aIgA1 促進(jìn)HMCs 增殖呈濃度依賴(lài)。上述研究結(jié)果表明P-aIgA1 能顯著促進(jìn)系膜細(xì)胞釋放促炎癥因子和系膜細(xì)胞增殖，但是其內(nèi)在機(jī)制并不清楚。

組蛋白乙?；揎検潜碛^遺傳學(xué)的重要作用機(jī)制之一，組蛋白乙酰化和去乙?；揎椩谀I臟的發(fā)育和腎臟疾病的發(fā)生過(guò)程中起著多重作用［14，16-17］。我們前期研究［18］已發(fā)現(xiàn)：IgA腎病患者腎組織中HDAC1顯著上調(diào)，H3Ac蛋白水平明顯下調(diào)。為了進(jìn)一步研究體外IgA腎病模型中組蛋白乙酰化情況，我們用不同成分的IgA1干預(yù)HMCs，觀察其對(duì)系膜細(xì)胞中HDAC1蛋白的影響。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，N-IgA1、P-IgA1、P-aIgA1刺激HMCs后均不同程度地增加了HMCs的HDAC1表達(dá)；與N-IgA1 組相比，P-aIgA1 組更顯著地增加了HDAC1蛋白。由此可見(jiàn)，HDAC1在P-aIgA1干預(yù)系膜細(xì)胞的過(guò)程中顯著升高，參與了系膜細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)。

HDACs 蛋白是細(xì)胞內(nèi)最重要的蛋白之一，它能廣泛地調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能［19］。HDAC 抑制劑如VPA 的研究，正在成為一個(gè)有吸引力的領(lǐng)域。VPA抗細(xì)胞增殖、抗炎及抗纖維化作用也日益受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，VPA可通過(guò)激活線粒體固有的凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［20］；可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)［21］。我們?cè)谇捌谘芯恐羞€發(fā)現(xiàn)：VPA 可以顯著下調(diào)體外IgA 腎病模型中HDAC1 的表達(dá)，上調(diào)H3Ac 的表達(dá)，顯著減輕細(xì)胞外基質(zhì)的合成［12］。

本研究繼續(xù)觀察了不同濃度VPA 對(duì)HMCs 分泌TNF-α 及HMCs 增殖的影響。本研究應(yīng)用P-aIgA1 顯著促進(jìn)HMCs 增殖，然后分別用不同濃度的VPA 進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：400 μg/mL 出現(xiàn)了顯著的抑制細(xì)胞增殖作用。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，VPA 也顯著抑制了P-aIgA1 誘導(dǎo)的TNF-α 的表達(dá)。有研究表明，VPA 不僅可以抑制TNF-α 的表達(dá)，還可以抑制NF-κB 和IL-6等炎癥信號(hào)通路［22］。

綜上所述，P-aIgA1 能顯著促進(jìn)系膜細(xì)胞釋放促炎癥因子和系膜細(xì)胞增殖，且促細(xì)胞增殖作用呈濃度依賴(lài)。體外IgA 腎病細(xì)胞模型中存在乙酰化修飾異常，其參與了系膜細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)。HDAC抑制劑VPA 可以部分逆轉(zhuǎn)上述反應(yīng)，提示其在疾病干預(yù)方面有一定應(yīng)用前景，可為從表觀遺傳學(xué)角度防治IgA腎病提供新的思路。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究遵守《赫爾辛基宣言》的宗旨，并經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No［2010］29）。研究對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

This study was conducted in accordance with theDeclaration of Helsinki， and was reviewed and approved by the Ethics Committee of Ruijin Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （No［2010］29）. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

戴芹、王偉銘參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；戴芹參與論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by DAI Qin and WANG Weiming. The manuscript was drafted and revised by DAI Qin. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-01

·Accepted：2022-06-03

·Published online：2022-06-28