孫寶婷，崔建東，賈士儒

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457)

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)主要分布在高等植物、部分微生物以及某些藻類中，是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶[1]. PAL可催化苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)生成反式肉桂酸(trans-cinnamic acids，t-CA)和氨(NH3)，可用于合成苯丙氨酸，治療部分腫瘤、苯丙酮尿癥等[2-4]，在生物化工、食品和醫(yī)藥行業(yè)中被廣泛應(yīng)用．

雖然游離酶具有活力高、特異性強的優(yōu)點，但游離酶多為液態(tài)，穩(wěn)定性差，對于酶的回收、重復(fù)使用、運輸、儲存有一定的影響，導(dǎo)致酶活力降低，嚴(yán)重影響其應(yīng)用效果．因此，為了改善PAL的催化性能，利用固定化技術(shù)將PAL固定是提高天然PAL穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性、重復(fù)使用性以及改善PAL催化性能的重要方法．與游離酶相比，被固定的酶具有更強的耐受高溫、變性劑和酸堿等極端條件的能力，同時也增強了酶的機械性能，提高了操作穩(wěn)定性，利于回收和重復(fù)利用．例如，Cui等[5]將PAL吸附交聯(lián)固定在粗孔微球硅膠上，所得的固定化PAL表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，在一定程度上實現(xiàn)了PAL的回收并重復(fù)使用．交聯(lián)劑戊二醛對PAL的失活作用使得固定化PAL的酶活回收率很低，僅有24.68%. 將PAL包埋固定在仿生硅顆粒中，所得固定化PAL同樣表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，但是由于PAL包埋在硅膠內(nèi)，導(dǎo)致了傳質(zhì)阻力較高，所以固定化PAL的酶活力較低[6]．另外，趙雅敏[7]以碳酸鈣為模板固定化PAL，其酶活回收率僅有15%左右．盡管通過固定化可以改善PAL的部分催化性能，但現(xiàn)有固定化方法存在載體機械強度低、顆粒均一性差、孔徑難以調(diào)控、具有較大擴散阻力等問題，導(dǎo)致酶的固定化效率較低．因此，選擇適當(dāng)?shù)妮d體和固定化方法對提高PAL的固定化效率尤為重要.

對于酵母來源的PAL而言，固定化的載體所提供的環(huán)境對被固定的酶有很大的影響．大多數(shù)重金屬離子對PAL的酶活力有抑制作用[8-9]，并且PAL是一種酸性蛋白，根據(jù)不同來源，其最適pH為8.0～9.5[10]．因此，載體自身的pH環(huán)境對PAL的酶活力有較大影響，在選用載體時，金屬離子及載體環(huán)境pH對PAL固定化后酶活力的保持有很大影響．金屬有機骨架(metal-organic framework，MOF)是一種由金屬離子或離子簇與有機配體通過配位作用連接而成的配位聚合物多孔材料[11-12]，具有可調(diào)節(jié)的孔隙率、高比表面積和結(jié)晶度、優(yōu)良的機械穩(wěn)定性和多樣性[13-16]．因此，MOF近年來被認(rèn)為是一種優(yōu)良的酶固定化載體[13,17-19]．作為MOF的一種，鋯基金屬有機骨架材料(UiOs系列)不僅具有優(yōu)良的酸堿耐受性、熱穩(wěn)定性[20]，而且具有較大的比表面積和可調(diào)控的孔徑，在吸附與分離[21-24]、光催化降解[25-27]、載 藥[28-29]、傳感器[30-32]等方面展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，已經(jīng)被用作多種酶的固定化載體[33-36]．

前人對PAL的固定化，多局限于交聯(lián)法和包埋法，這兩種方法固定化效率不高，且對酶活力損傷較大．因此，為了提高PAL的催化性能，本研究以UiO-66-NH2為載體，采用吸附法將PAL吸附固定在UiO-66-NH2上，制備出PAL@UiO-66-NH2固定化酶顆粒，考察其催化性能，以期改善PAL對極端條件(酸、堿、變性劑、高溫等條件)的耐受性和可操作性，為PAL的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考．

1 材料與方法

1.1 材料

來源于重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21的PAL(0.02U/mg)保存于本實驗室；2-氨基對苯二甲酸、氯化鋯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鈉，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉，OXOID公司；總蛋白(TP)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司．

FEI-Apreo型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)，F(xiàn)EI公司；FV1000型激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)，日本Olympus有限公司；LGJ-10型冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；FE20型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-6100型紫外分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；B15-1型磁力攪拌器，上海思樂儀器有限公司；H2050R型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司．

1.2 方法

1.2.1 UiO-66-NH2的合成

稱取116.5mg氯化鋯、90.5mg 2-氨基對苯二甲酸置于100mL螺口瓶中，加入51.05mL DMF，再加入11.45mL乙酸，渦旋振蕩均勻，超聲15min．將以上體系轉(zhuǎn)移至高溫高壓反應(yīng)釜中，120℃反應(yīng)16h后將所得產(chǎn)物以8000r/min離心10min，沉淀后用DMF洗滌3次，甲醇洗滌2次，置于真空干燥機中60℃過夜干燥，即得UiO-66-NH2．

1.2.2 PAL@UiO-66-NH2的制備

將實驗室構(gòu)建的重組大腸桿菌BL21接種于含30μg/mL卡那霉素的100mL LB培養(yǎng)基中，37℃、220r/min培養(yǎng)10h作為種子液．以5%的接種量接種于190mL含30μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A600為0.6～0.8時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使其終濃度為0.1mmol/L，28℃、180r/min過夜培養(yǎng)，6000r/min離心，收集得到的菌體用0.9%生理鹽水反復(fù)洗滌3次；將洗滌后的菌體用50mmol/L pH 8.0的PBS緩沖液重懸，置于冰水浴中，使用超聲破碎儀破碎．破碎條件：總功率的45%，工作3s，間歇6s，破碎液在12000r/min條件下離心20min，取上清液加入硫酸銨，使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%；沉淀3h后，8000r/min離心10min，棄去上清液，沉淀用25mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)溶解，裝入透析袋，用10mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)透析后凍干，得PAL固體粉末．

稱取6mg PAL，用6mL 10mmol/L pH 8.0的PBS緩沖液溶解，向裝有60mg UiO-66-NH2顆粒的離心管中加入6mL PAL溶液(0.02U/mg)，緩慢攪拌1h；8500r/min離心8min，棄去上清液，沉淀用10mmol/L的PBS緩沖液(pH 8.0)洗滌3次，得到PAL@UiO-66-NH2．

1.2.3 酶活力與酶活回收率的測定方法

PAL轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸(L-Phe)生成的t-CA在278nm處有吸光度，并且在一定范圍內(nèi)，t-CA質(zhì)量濃度與吸光度呈線性關(guān)系．采用紫外分光光度計測定PAL的酶活力，PAL酶活力單位(U)定義：在一定條件下，1min內(nèi)催化L-Phe生成1μmol t-CA所需要的酶量．測定條件：1.5mL離心管中依次加入490μL pH 8.8Tris-HCl、500μL 50mmol/L L-Phe和10μL PAL或PAL@UiO-66-NH2，40℃反應(yīng)10min，然后加入40μL 4mol/L HCl終止反應(yīng)，10000g離心后，在278nm紫外波長處測定上清液的吸光度．以吸光度為橫坐標(biāo)、t-CA質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝14.08x－0.526，R2＝0.999．酶活力按照式(1)計算．

式中：ρ為t-CA的質(zhì)量濃度，mg/L；V為反應(yīng)體系的體積，mL；M為t-CA的摩爾質(zhì)量，148.16g/mol；t為反應(yīng)時間，10min．

固定化酶的酶活回收率按照式(2)計算．

1.2.4 PAL@UiO-66-NH2顆粒的固定化效率的測定

PAL@UiO-66-NH2顆粒的固定化效率按照式(3)計算．

1.2.5 UiO-66-NH2顆粒的添加量與吸附時間對PAL@UiO-66-NH2酶活回收率的影響

分別稱取5、10、15、20、25mg UiO-66-NH2顆粒置于10mL離心管中，加入1mg/mL的PAL溶液1mL，勻速攪拌1h；8000r/min離心10min后，沉淀用pH 7.4的10mmol/L PBS緩沖液洗滌3次；參照1.2.3節(jié)的方法測定酶活力，并計算酶活回收率，考察UiO-66-NH2顆粒的添加量對PAL@UiO-66-NH2酶活回收率的影響．

稱取10mg UiO-66-NH2顆粒置于10mL離心管中，加入1mg/mL的PAL溶液1mL，勻速攪拌0.5、1、1.5、2、2.5h時后取1mL；8000r/min離心10min，沉淀用pH 7.4的10mmol/L PBS緩沖液洗滌3次．參照1.2.3節(jié)的方法測定酶活力，并計算酶活回收率，考察吸附時間對PAL@UiO-66-NH2酶活回收率的影響．

1.2.6 UiO-66-NH2的催化性能

最適催化溫度：將10μL游離PAL和10μL優(yōu)化完成后的PAL@UiO-66-NH2懸浮液分別加入490μL 50mmol/L Tris緩沖液(pH 8.8)和500μL 50mmol/L L-Phe反應(yīng)體系中，在20～70℃下參照1.2.3節(jié)的方法測定酶活力，確定最佳催化溫度．

最適催化pH：將10μL游離PAL和PAL@UiO-66-NH2分別加入490μL不同pH的緩沖液(pH 3.0～11.0)和500μL 50mmol/L L-Phe反應(yīng)體系中，在40℃下參照1.2.3節(jié)的方法測定酶活力，確定最佳催化pH．

溫度耐受性：取相同酶活力的游離PAL和PAL@UiO-66-NH2分別加入490μL 50mmol/L Tris緩沖液(pH 8.8)中，置于50℃水浴鍋，分別處理10、20、30、40和50min；冷卻后加入500μL 50mmol/L L-Phe反應(yīng)體系中，參照1.2.3節(jié)的方法測定酶活力．

pH耐受性：取相同酶活力的游離PAL和PAL@UiO-66-NH2分別在50mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH為3.0、5.0)及50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH為7.0、9.0、11.0)中處理1h后，參照1.2.3節(jié)的方法測定酶活力．

重復(fù)使用性：取0.5mL PAL@UiO-66-NH2、2mL 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.8)和 2.5mL 50mmol/L L-Phe，40℃反應(yīng)10min，10000g離心后，參照 1.2.3節(jié)的方法測定酶活力．將回收的PAL@UiO-66-NH2用去離子水洗1次，重新懸浮于2.5mL 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.8)中，渦旋振蕩使其分散均勻，加入2.5mL 50mmol/L L-Phe進(jìn)行酶促反應(yīng)后再次測定酶活力．重復(fù)測定10次，確定PAL@UiO-66-NH2的重復(fù)使用性．

變性劑耐受性：取相同酶活力的游離PAL和PAL@UiO-66-NH2，將PAL@UiO-66-NH2進(jìn)行8000 r/min離心10min后，棄去上清液，分別加入十二烷基硫酸鈉(SDS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)、鹽酸胍(6mol/L)、尿素(6mol/L)處理1h，參照1.2.3節(jié)的方法測定酶活力.

PAL和UiO-66-NH2的表觀動力學(xué)：將50mmol/L L-Phe分別稀釋為2.5、5、12.5、25mmol/L的不同濃度進(jìn)行游離PAL、PAL@UiO-66-NH2顆粒的催化反應(yīng)，測定其278nm處的吸光度．利用雙倒數(shù)法測定米氏常數(shù)(Km)和酶促反應(yīng)的最大速率(vmax)．Km為酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大值一半時的底物濃度，用來檢測酶與底物的親和能力．

1.2.7 PAL@UiO-66-NH2顆粒的表征

利用FEI-Apreo型場發(fā)射掃描電子顯微鏡、 FV1000型激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察．

異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記PAL：在避光條件下，將50mg FITC溶于8mL二甲基亞砜(DMSO)，加入100mL溶有1g PAL的磷酸鈉緩沖液(0.2mol/L，pH 8.0)，室溫下避光攪拌溶解2h；加入無水乙醇沉淀標(biāo)記好的蛋白，離心去除多余的FITC；加入100mL去離子水溶解沉淀，再加入等量乙醇沉淀、離心，直至將未標(biāo)記蛋白的殘留FITC去除．

2 結(jié)果與分析

2.1 PAL@UiO-66-NH2的表征

UiO-66-NH2和PAL@UiO-66-NH2的場發(fā)射掃 描電子顯微鏡圖及激光掃描共聚焦顯微鏡圖如圖1 所示.

圖1 UiO-66-NH2和PAL@UiO-66-NH2的場發(fā)射掃描電子顯微鏡圖及激光掃描共聚焦顯微鏡圖 Fig. 1 FESEM and LSCM images of UiO-66-NH2 and PAL@UiO-66-NH2

UiO-66-NH2顆粒呈正八面體，大小為300～500nm，PAL@UiO-66-NH2的形態(tài)與UiO-66-NH2一致，仍然是正八面體．與UiO-66-NH2光滑的表面相比，PAL@UiO-66-NH2表面顯得更粗糙，這種現(xiàn)象可能是PAL@UiO-66-NH2表面吸附PAL后產(chǎn)生的．為了進(jìn)一步證明PAL吸附在UiO-66-NH2顆粒的表面，用FITC標(biāo)記PAL，在激光掃描共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，可以清晰地看到UiO-66-NH2顆粒散發(fā)出綠色熒光，如圖1(c)所示．這表明PAL被吸附到UiO-66-NH2顆粒上，成功制備出PAL@UiO-66-NH2顆粒．

2.2 UiO-66-NH2的添加量與吸附時間對PAL@ UiO-66-NH2酶活回收率的影響

UiO-66-NH2的添加量與吸附時間對酶活回收率的影響如圖2所示．

圖2 UiO-66-NH2的添加量與吸附時間對酶活回收率的影響 Fig. 2 Effects of addition of UiO-66-NH2 and adsorption time on enzyme activity recovery

由圖2(a)可知：在相同吸附時間和相同PAL濃度條件下，PAL@UiO-66-NH2的酶活回收率隨著UiO-66-NH2添加量的增加而增加；當(dāng)UiO-66-NH2添加量達(dá)到10mg時，酶活回收率相對較高；繼續(xù)增加UiO-66-NH2的添加量并不能顯著提高酶活回收率．因此，選擇UiO-66-NH2添加量為10mg．

由圖2(b)可知：吸附時間為0.5～1.5h時，酶活回收率變化不大，但1.5h后，酶活回收率有所下降. 這可能的原因是隨著吸附時間的延長，孔隙吸附的酶分子達(dá)到了飽和，過多的酶分子相互堆積，導(dǎo)致酶促反應(yīng)時酶分子之間的活性位點相互遮蔽，底物進(jìn)入酶分子的空間位阻也相應(yīng)增大．因此，當(dāng)酶分子堆積到一定程度后，隨著時間的延長，酶活回收率反而下 降[37-38]. 考慮制備周期和成本，選用0.5h為最優(yōu)吸附時間．在此最優(yōu)條件下，UiO-66-NH2顆粒對PAL的負(fù)載率達(dá)到了(91.11±1.57)%．PAL@UiO-66-NH2顆粒的酶活回收率為(90.01±3.18)%，比優(yōu)化前提高了35%．

2.3 PAL@UiO-66-NH2的催化性能

2.3.1 催化溫度和pH

PAL@UiO-66-NH2催化溫度和pH優(yōu)化結(jié)果如圖3所示．

圖3 PAL@UiO-66-NH2催化溫度和pH優(yōu)化 Fig. 3 Optimization of catalytic temperature and pH of PAL@UiO-66-NH2

由圖3(a)和3(c)可知，PAL@UiO-66-NH2的最適催化溫度和最適催化pH與天然PAL的相同，都是45℃和pH 9.0．這可能是由于PAL是通過較弱的吸附作用固定在UiO-66-NH2顆粒上，固定化并沒有影響天然PAL的結(jié)構(gòu)，從而使其最適催化溫度和pH沒有發(fā)生變化．但是，PAL@UiO-66-NH2在不同的溫度條件下表現(xiàn)出比天然PAL更高的酶活力，表明固定化使PAL能適應(yīng)更廣泛的催化溫度．由圖3(b)可知，在50℃處理條件下，隨著處理時間從10min延長到50min，天然PAL的酶活殘留率從10%下降至3%左右，而PAL@UiO-66-NH2仍然能保持84%～96%的酶活殘留率．由圖3(c)可知，盡管PAL@UiO-66-NH2表現(xiàn)出與天然PAL相同的最適催化pH，但是PAL@UiO-66-NH2在不同的pH條件下表現(xiàn)出比天然PAL更高的相對酶活力．由圖3(d)可知，PAL@UiO-66-NH2在酸性和堿性條件下的酶活殘留率均高于天然PAL．這些結(jié)果表明，當(dāng)天然PAL被吸附在UiO-66-NH2顆粒上以后，由于載體對PAL的遮蔽保護(hù)作用，提高了PAL對高溫和極端pH的耐受性，使PAL保持一定的酶活力．

2.3.2 動力學(xué)參數(shù)

PAL與PAL@UiO-66-NH2的表觀動力學(xué)參數(shù)測定結(jié)果見表1．

表1 PAL與PAL@UiO-66-NH2的表觀動力學(xué)參數(shù) Tab. 1 Comparison of apparent kinetic parameters of PAL and PAL@UiO-66-NH2

與天然PAL相比，PAL@UiO-66-NH2具有較大的Km值，表明PAL固定化后，由于載體的存在，形成較大的底物擴散限制效應(yīng)和傳質(zhì)阻力，從而使底物與PAL的親和力減弱，PAL@UiO-66-NH2的vmax降低．以前的研究[39-41]也表明，固定化后的酶比游離酶具有更大的Km和更小的vmax，本研究的結(jié)果與之前的報道一致．

2.3.3 重復(fù)使用性和變性劑耐受性

PAL@UiO-66-NH2的重復(fù)使用性結(jié)果如圖4(a)所示，在連續(xù)重復(fù)使用5次后，PAL@UiO-66-NH2仍能保持80%左右的初始酶活力，表明PAL@UiO-66-NH2具有較好的可操作性．由圖4(b)可知：PAL@ UiO-66-NH2表現(xiàn)出更強的變性劑耐受性，例如在2% SDS處理后，天然PAL只能保留7%的初始酶活力，而PAL@UiO-66-NH2卻能保留18%的初始酶活力．

圖4 PAL@UiO-66-NH2的重復(fù)使用性及變性劑耐受性Fig. 4 Reusability and denaturing agent tolerance of PAL@UiO-66-NH2

3 結(jié) 論

本研究使用吸附法將PAL固定在UiO-66-NH2顆粒上，優(yōu)化的制備條件為1mg/mL PAL、10mg UiO-66-NH2顆粒、吸附時間0.5h，在此條件下所得PAL@UiO-66-NH2顆粒的酶活回收率為(90.01±3.18)%，比優(yōu)化前提高了約35%．與游離PAL相比，PAL@UiO-66-NH2固定化酶具有良好的pH耐受性、溫度耐受性、變性劑耐受性，且重復(fù)使用性良好，連續(xù)使用5次之后仍能保持80%左右的初始酶活力.