趙 琳,王 菁,楊金龍,陸盼盼,王亞楠,楊辛毅,姜正濤,潘晗雨,沈曉婷,粱智銘,朱煥章

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438;2.復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國家重點實驗室,上海 200438)

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計報告最新數(shù)據(jù)顯示,肺癌在36種常見癌癥中死亡率高居第一,發(fā)病率高居第二[1],5年總生存率僅為21%[2]。非小細(xì)胞肺癌(Non-Small-Cell Lung Cancer,NSCLC)是肺癌的主要類型,占肺癌病例的76%[3]。對于NSCLC的治療手段,其中包括手術(shù)、化療和放療,都未能達到預(yù)期的效果,因此亟需更有效的治療方法。近年來,免疫檢查點阻斷已成為包括NSCLC等許多實體瘤的常規(guī)治療方法[4]。越來越多的證據(jù)表明,免疫檢查點抑制劑(Immune Checkpoint Inhibitor,ICI)治療NSCLC是一種很有前景的選擇[5]。目前,美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的3種癌癥ICI藥物用于治療NSCLC,其平均客觀反應(yīng)率為20%[6]。這些藥物最初用于二線NSCLC轉(zhuǎn)移瘤治療方案[7-9]?，F(xiàn)在其作用已擴展到一線轉(zhuǎn)移瘤的治療方案[10]。在腫瘤免疫治療中,與免疫檢查點療法一起迅速發(fā)展的另一種療法是嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimeric Antigen Receptor T cell,CAR-T)療法。除了奇跡般地從急性白血病中幸存下來的Emily,還有兩名慢性白血病患者被CAR-T療法治愈[11-12]。然而,CAR-T在具有更復(fù)雜腫瘤微環(huán)境(Tumor Microenvironment,TME)的實體腫瘤中前景并不樂觀[13]?？乖碳さ腡細(xì)胞的活化伴隨著程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(PD-1)表達的上調(diào)。而在炎性腫瘤環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞也有PD-L1上調(diào)的反應(yīng)機制,與PD-1結(jié)合導(dǎo)致免疫逃逸[14]。PD-1檢查點阻斷和CAR-T細(xì)胞療法分別顯示出很有前景的療效,并已被FDA批準(zhǔn)用于治療血液病[15]。許多研究人員已經(jīng)考慮將CAR-T細(xì)胞治療與PD-1檢查點阻斷治療相結(jié)合,試圖攻克實體腫瘤。PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑與CART細(xì)胞結(jié)合的策略已被廣泛應(yīng)用[16-18]。然而,這種策略可能導(dǎo)致副作用,如全身毒性[18]。在一種更安全的方法中,CAR-T細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞并分泌PD-1/PD-L1 scFv,這增強了PD-1/PD-L1 scFv的特異性和CAR-T細(xì)胞在TME中的持久性[19-20]。本研究為了緩解PD-1/PD-L1對CAR-T的抑制作用,設(shè)計構(gòu)建了靶向間皮素(MSLN)并分泌PD-1 scFv E27的E27-MesoCAR-T細(xì)胞,并探究其抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料與動物

細(xì)胞系HEK293-17購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。過表達螢光素酶和人間皮素的NSCLC細(xì)胞株A549-ML之前由本實驗室構(gòu)建并進行凍存[21]。通過慢病毒感染A549-ML細(xì)胞構(gòu)建過表達PD-L1的細(xì)胞系A(chǔ)549-MPL。它們都培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中。

免疫缺陷雌性NSG小鼠購自上海南模生物公司,并在無特定病原體(Specific Pathogen-Free,SPF)條件下生存。所有動物體內(nèi)實驗皆通過動物倫理委員會的批準(zhǔn)而進行。

1.2 CAR慢病毒載體構(gòu)建

PD-1 scFv的序列借鑒了文獻[22],將原有的小鼠Ig K分泌信號調(diào)整為人IgG分泌信號后由金唯智公司合成。MesoCAR的結(jié)構(gòu)是由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(CD8 leader,anti-MSLN scFv P4和CD8 hinge)、CD8跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域和CD3ζ)組成的,序列同樣由金唯智公司合成。兩部分用T2A連接子連接后,再克隆到慢病毒載體p TRPE中。

1.3 CAR-T細(xì)胞的制備

首先從長海醫(yī)院采集健康獻血者的血液樣本,然后按照倫理和安全標(biāo)準(zhǔn)使用。采用密度梯度離心法純化外周血單個核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs),并通過Pan T細(xì)胞純化試劑盒(MiltenyiBiotec)從PBMCs中分離得到CD3+T細(xì)胞,培養(yǎng)于含5%胎牛血清(Gibco)、人IL-2和IL-15(R&D)的X-VIVO15(Lonza)培養(yǎng)基中,用CD3/CD28偶聯(lián)微珠(Thermo Fisher)激活。將CAR載體、p MD2.G和pSPAX2三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293-17細(xì)胞制備慢病毒。CD3+T細(xì)胞活化48 h后,上述慢病毒感染過夜。感染后,T細(xì)胞體外培養(yǎng)擴增12天,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CAR+T細(xì)胞比例。

1.4 CAR-T細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子釋放和增殖試驗

CAR-T細(xì)胞和A549-MPL細(xì)胞效靶比NCAR-T/NA549-MPL分別為1∶1、5∶1和10∶1,共孵育6 h后,釋放的乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)含量作為檢測CAR-T細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性的指標(biāo)。共培養(yǎng)24 h的上清通過酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)定量細(xì)胞因子的釋放。

在增殖實驗中,經(jīng)過長時間A549-MPL細(xì)胞的刺激后,CAR-T細(xì)胞以5×10/3孔的密度加入96孔板中。在48 h和72 h兩個時間點,加入CCK-8溶液(Dojindo),孵育4 h后檢測光密度(Optical density,OD)值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

在本研究中,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測一些細(xì)胞表面分子的表達。具體操作為,與抗體共孵育15 min后,收集細(xì)胞并洗滌兩次,然后用流式細(xì)胞儀(Beckman)收集細(xì)胞數(shù)據(jù)。

本研究中使用的抗體包括FITC標(biāo)記的人間皮素蛋白(Acro BioSystems)、PE標(biāo)記的小鼠抗人CD279單克隆抗體(BD)、PE標(biāo)記的小鼠抗人CD274單克隆抗體(BD)、生物素標(biāo)記的抗人間皮素單克隆抗體(Bio Legend)、APC標(biāo)記的鏈霉親和素(BD)等流式抗體。

1.6 Western blot

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293-17細(xì)胞后,收集1×106細(xì)胞并離心。分離細(xì)胞沉淀和上清,分別作為E27表達和分泌的Western blot檢測樣品。上清液和全細(xì)胞裂解液加載到SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。E27條帶通過兔抗HA一抗(CST)和羊抗兔IgG二抗(TransGen)標(biāo)記。β-actin條帶通過小鼠抗人β-actin一抗(TransGen)和山羊抗小鼠IgG二抗(TransGen)標(biāo)記。

1.7 NSCLC CDX小鼠模型的建立及CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性探究

采用A549-MPL細(xì)胞建立NSCLC CDX小鼠模型。按照5×10/6鼠的量計算所需A549-MPL細(xì)胞總數(shù),用PBS進行3～4次清洗,最終用PBS按照5×10/6(100μL·鼠)的細(xì)胞密度重懸,注射到6周的雌性NSG小鼠皮下。7天后,腹腔注射麻醉劑(1%戊巴比妥鈉的使用劑量為50 mg/kg),待5～10 min后麻醉劑起效,尾靜脈輸入體內(nèi)用Luciferase底物(Promega);3 min后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(IndiGO)拍照,曝光時間120 s,將圖像背景值調(diào)為6 500 cps,觀察每只小鼠的成瘤情況。小鼠隨機分為Mock組、MesoCAR組和E27-MesoCAR組(n=5)。每7天進行一次活體成像,監(jiān)測小鼠腫瘤的生長情況。

1.8 腫瘤的稱重和抑瘤率的計算

從死亡的對照組和實驗小鼠身上取出腫瘤組織,并用電子天平稱重。腫瘤抑制率η=(m對照組-m實驗組)/m對照組×100%,其中m對照組為對照組腫瘤平均重量,m實驗組為實驗組腫瘤平均重量。

1.9 免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)

小鼠皮下剝離的完整腫瘤組織塊,切取中間截面制作石蠟切片,進行免疫組化染色,詳細(xì)方法見參考文獻[21]的材料方法部分。

2 結(jié) 果

2.1 過表達PD-L1肺癌細(xì)胞系的構(gòu)建

以本實驗室構(gòu)建好的過表達間皮素的A549-ML細(xì)胞系為對象,設(shè)計并構(gòu)建含PD-L1(CD274)和篩選標(biāo)記的慢病毒載體(圖1(a)),制備病毒并感染上述MSLN+的A549-ML細(xì)胞,用潮霉素篩選一段時間,待細(xì)胞可以在較高濃度潮霉素培養(yǎng)條件下穩(wěn)定生長,流式細(xì)胞儀檢測其PD-L1的表達情況,撤掉潮霉素,大規(guī)模擴增凍存,獲得A549-MSLN-PD-L1(A549-MPL)細(xì)胞系。結(jié)果表明MSLN和PD-L1表達都在90%以上(圖1(b)、圖1(c)),可以作為靶細(xì)胞用于下游實驗。并且在底物存在的情況下,A549-MPL可以催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光(圖1(d)),使實時報告動物體內(nèi)腫瘤生長情況成為可能。

圖1 過表達PD-L1肺癌細(xì)胞系的構(gòu)建Fig.1 Construction of PD-L1-overexpressed NSCLC cell line

2.2 分泌型PD-1單鏈抗體E27的設(shè)計、構(gòu)建以及驗證

我們從免疫原性、分泌效率方面對分泌信號進行優(yōu)化,分別選擇了鼠IgKSS、人IL-2SS和人IgGSS 3種常用的分泌信號串聯(lián)在PD-1單鏈抗體E27和HA標(biāo)簽的前面,構(gòu)建到慢病毒載體骨架p TRPE上(圖2(a),見第408頁)。3種分泌信號的序列從NCBI官網(wǎng)獲得,分別為:(1)Ig KSS(ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC);(2)IL-2SS(ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT);(3)IgGSS:ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACCGCAACCGGAGTGCACAGC。

經(jīng)過EcoRV單酶切位點酶切和NcoⅠ三酶切位點酶切驗證載體并進一步測序,將序列正確的重組質(zhì)粒標(biāo)記為IgGSS-E27、IL-2SS-E27和Ig KSS-E27,并進行保種。

將3種質(zhì)粒分別瞬轉(zhuǎn)HEK293-17細(xì)胞,收集48 h胞內(nèi)總蛋白和培養(yǎng)基上清,通過抗HA標(biāo)簽的抗體進行Western blot檢測E27的表達和分泌(圖2(b));并且在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒質(zhì)量、細(xì)胞起始數(shù)量、培養(yǎng)體系相同和上樣量相同的情況下,可通過條帶顯色情況判斷3種分泌信號的分泌效率。由圖可以看出,3種分泌信號都可以成功地表達并分泌E27,根據(jù)條帶OD值可以分辨出IgGSS-E27載體的分泌效率稍有優(yōu)勢,且是人源序列,不會引起潛在的免疫反應(yīng),因此我們選擇IgGSS-E27序列進行下游載體的構(gòu)建。

圖2 分泌型PD-1單鏈抗體E27的慢病毒載體示意圖和E27的分泌Fig.2 Schematic diagram of E27 lentiviral vector and secretion of E27

2.3 E27-MesoCAR慢病毒載體的構(gòu)建與慢病毒制備

首先構(gòu)建MesoCAR,將CD8 leader、P4 scFv、CD8 hinge、CD8TM、4-1BB以及CD3ζ克隆到p TRPEGFP-T2A-m RFP上(圖3(a))。然后根據(jù)前期的優(yōu)化構(gòu)建帶有分泌型PD-1單鏈抗體元件的新型MesoCAR,將MesoCAR序列用T2A重組到Ig GSS-E27上,即p TRPE-MesoCAR-T2A-E27,簡稱為E27-MesoCAR(圖3(b))。以MesoCAR和E27-MesoCAR質(zhì)粒作為目的載體,利用三質(zhì)粒慢病毒包裝體系制備慢病毒,抽提病毒基因組,在WPRE區(qū)域設(shè)計引物,qPCR檢測病毒單位體積的顆粒數(shù)。

用已知濃度的MesoCAR大提質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品擬定標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3(c)),MesoCAR病毒的循環(huán)數(shù)閾值(Cycle Threshold,CT)為22,E27-MesoCAR病毒的CT值為22.92,代入回歸方程Y=-3.19X+37.08(R2=0.999 9),將得到的單位體積所含有的病毒顆粒數(shù)(N病毒)換算為滴度,分別為5.01×107/m L和2.75×107/m L。

圖3 CAR慢病毒載體示意圖及病毒滴度檢測Fig.3 Schematic diagram of CAR lentiviral vector and detection of virus titer

2.4 E27-MesoCAR-T細(xì)胞的制備及E27的表達

從血站獲取的健康人外周血中分離出外周血單個核細(xì)胞后,分選得到CD3+T細(xì)胞,CD3/CD28 Beads活化48 h后,用制備好的慢病毒感染T細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)為15),制備CAR-T效應(yīng)細(xì)胞。將慢病毒感染并培養(yǎng)擴增12 d后的CAR-T細(xì)胞作為檢測對象,對其CAR受體的表達以及E27的分泌情況進行了測定。以人源間皮素重組蛋白作為抗體標(biāo)記CAR陽性T細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示MesoCAR和E27-MesoCAR陽性率都在50%以上(圖4(a))。以收集細(xì)胞培養(yǎng)基離心后得到的上清為樣品,免疫印跡結(jié)果表明E27在原代T細(xì)胞中也能夠成功地表達并且分泌到胞外(圖4(b))。

圖4 CAR-T細(xì)胞的CAR陽性率以及E27的表達Fig.4 Proportion of CAR-T cells and expression of E27

2.5 E27-MesoCAR-T細(xì)胞的體外殺傷功能及細(xì)胞因子分泌

在scFv識別到腫瘤相關(guān)抗原后,CAR-T細(xì)胞將分泌細(xì)胞因子并脫顆粒。將Mock T、MesoCAR-T和E27-MesoCAR-T細(xì)胞與A549-MPL細(xì)胞共孵育,以CD107α、激活表面分子標(biāo)志物CD25/CD69以及IL-2、TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子作為指標(biāo),驗證其體外殺傷功能。再通過共孵育前后腫瘤細(xì)胞含量的變化以及實驗組和對照組之間死細(xì)胞釋放的LDH含量的比較,觀察CAR-T細(xì)胞殺傷效率。使CAR-T∶A549-MPL=2∶1,混合均勻并共同培養(yǎng),24 h后收集混合細(xì)胞并分為3份分別進行CD25/CD69、CD107α表達以及兩種細(xì)胞組成比例變化的流式細(xì)胞儀檢測。實驗結(jié)果(圖5,見第410頁)顯示,實驗組CD25表達上調(diào)(圖5(a)),說明CART細(xì)胞被特異性激活。實驗組特異性表達CD107α(圖5(b)),說明CAR-T細(xì)胞進行了脫顆粒。圖5(c)流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,實驗組腫瘤細(xì)胞比例降低、T細(xì)胞比例升高,說明CAR-T細(xì)胞特異性殺死了腫瘤細(xì)胞。

按照1∶1、5∶1和10∶1的比例,將CAR-T細(xì)胞和A549-MPL細(xì)胞共孵育。6 h后吸取50μL上清,檢測釋放的LDH與顯色試劑作用下的吸光值。結(jié)果如圖5(d)所示,隨著效靶比例的逐漸增加,CAR-T細(xì)胞裂解腫瘤細(xì)胞越來越充分,最高可達到60%,MesoCAR與Mock以及E27-MesoCAR與Mock之間都存在顯著性差異(P＜0.01)。以效靶比為10∶1共孵育,24 h培養(yǎng)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液檢測IL-2、TNF-α和IFN-γ3種細(xì)胞因子釋放,圖5(e)的ELISA結(jié)果顯示CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)基所含3種細(xì)胞因子的濃度從300～6 000 pg/m L不等,但均顯著高于對照組(P＜0.01),說明CAR-T細(xì)胞可以針對腫瘤細(xì)胞特異性大量分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子。

圖5 CAR-T細(xì)胞在體外對A549-MPL的特異性殺傷Fig.5 Specific lysis of CAR-T cells against A549-MPL in vitro

2.6 分泌型PD-1單鏈抗體E27增強CAR-T細(xì)胞增殖活性

CAR-T細(xì)胞在腫瘤表面抗原的反復(fù)刺激下會呈現(xiàn)出耗竭的狀態(tài),主要表現(xiàn)為PD-1等免疫檢查點分子表達上調(diào),T細(xì)胞活性與增殖能力下降,導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞逐漸失去殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。為了模擬浸潤瘤體的CAR-T細(xì)胞反復(fù)被抗原刺激的狀態(tài),將CAR-T和A549-MPL細(xì)胞共孵育,在48 h和72 h兩個時間點用CCK-8試劑盒檢測MesoCAR-T和E27-MesoCAR-T細(xì)胞的活力和增殖能力。第0天時,取等量CAR-T細(xì)胞,一組不做處理單獨培養(yǎng)即A549-MPL(-)組,一組與A549-MPL細(xì)胞共培養(yǎng)即A549-MPL(+)組。MesoCAR-T細(xì)胞在48 h時,共同孵育組T細(xì)胞數(shù)量略微領(lǐng)先于未處理組,但在72 h時共同孵育組T細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)落后于未處理組(圖6(a)左)。E27-MesoCAR-T細(xì)胞在48 h和72 h時,共同孵育組T細(xì)胞數(shù)量明顯多于未處理組(圖6(b)左),猜測是在腫瘤相關(guān)抗原刺激下CAR-T細(xì)胞擴增效率提高。我們又比較了兩個時間點OD值的改變倍數(shù),相較于MesoCAR-T細(xì)胞,A549-MPL(-)組和A549-MPL(+)組之間存在顯著性差異(圖6(a)右),E27-MesoCAR-T細(xì)胞兩組之間無明顯差異(圖6(b)右),表明在PD-L1+的A549-MPL反復(fù)刺激下,MesoCAR-T細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P＜0.01),而E27-MesoCAR-T細(xì)胞分泌的E27緩解了這種抑制。流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)過腫瘤細(xì)胞共孵育后的CAR-T細(xì)胞表面PD-1表達(圖6(c))和凋亡(圖6(d))情況,MesoCAR組44.0%的T細(xì)胞檢測到PD-1的表達,且34.4%的細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài);E27-MesoCAR組檢測到不足8.5%的PD-1表達和細(xì)胞凋亡。

圖6 E27可以增加MesoCAR-T經(jīng)過抗原反復(fù)刺激后的增殖能力Fig.6 E27 enhances the proliferation of MesoCAR-T cells after repetitive antigen stimulation

2.7 NSG小鼠體內(nèi)E27-MesoCAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用

2.7.1 E27-MesoCAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用

基于觀察到的在體外E27的分泌對于MesoCAR-T細(xì)胞耗竭的阻斷作用,我們繼續(xù)在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549-MPL的動物模型中評估E27-MesoCAR-T細(xì)胞的優(yōu)越性。首先于第0天在每只NSG小鼠皮下種植5×106個A549-MPL細(xì)胞,第7天通過尾靜脈靜脈注射第一輪對照組、MesoCAR-T組和E27-MesoCAR-T組細(xì)胞,每組5只小鼠,每只每輪注射1×107個細(xì)胞;第14天通過尾靜脈注射第2輪細(xì)胞。尾靜脈注射螢光素酶底物,每周檢測一次A549-MPL細(xì)胞系的化學(xué)發(fā)光,通過活體成像監(jiān)控小鼠腫瘤生長情況(圖7(a),見第412頁)。結(jié)果如圖7(b)(見第 412頁)所示,在第28天E27-MesoCAR組有1只小鼠活體成像未檢測到熒光,1只小鼠熒光值仍處于24 000 cps以下,而實驗組和對照組的其他小鼠熒光值均過曝(最大熒光值超過65 535 cps),對照組甚至出現(xiàn)因為腫瘤過大腫瘤局部壞死的情況(Mock組左數(shù)第2只小鼠背部呈現(xiàn)黑色的位置);我們利用Image J軟件統(tǒng)計了熒光面積,結(jié)果顯示E27-MesoCAR組和MesoCAR組與對照組腫瘤大小存在明顯差異(P＜0.01),同時E27-MesoCAR組和MesoCAR組腫瘤大小也存在差異(P＜0.05)(圖7(c),見第412頁)。第33天,待各組小鼠死后解剖取出皮下腫瘤,腫瘤實物圖如圖7(d)(見第 412頁)所示;稱量腫瘤重量,可以觀察到MesoCAR組和E27-MesoCAR組腫瘤重量較Mock組顯著性縮小(P＜0.01),抑瘤率分別為89.1%和97.4%(圖7(e),見第412頁)。

圖7 體內(nèi)E27-MesoCAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用Fig.7 Antitumor effect of E27-MesoCAR-T cells in vivo

2.7.2 PD-1阻斷型單鏈抗體E27增強MesoCAR-T細(xì)胞體內(nèi)的增殖和持久性

為了觀察T細(xì)胞在體內(nèi)的增殖情況,在第31天,通過小鼠眼眶靜脈采血,流式細(xì)胞儀檢測外周血中人CD3+T細(xì)胞的含量。結(jié)果顯示,E27-MesoCAR組小鼠外周血中人CD3+T細(xì)胞含量為27.3%,顯著性高于其他兩組(P＜0.01)(圖8(a))。隨機選擇1只Mock組、1只MesoCAR組和1只E27-MesoCAR組小鼠皮下剝離的腫瘤組織,進行ICH染色,染色指標(biāo)為人CD3,選擇代表性視野分別放大10倍和40倍觀察(圖8(b))。隨機選擇3個40×視野,計數(shù)腫瘤組織內(nèi)部T細(xì)胞的數(shù)量(圖8(c))。結(jié)果顯示,E27-MesoCAR組腫瘤組織內(nèi)T細(xì)胞數(shù)量顯著性多于MesoCAR組(P＜0.01),與E27抗體在體外可以阻斷腫瘤細(xì)胞長時間接觸導(dǎo)致的T細(xì)胞耗竭,增強其增殖能力以及持久性的結(jié)果相一致。

圖8 PD-1單鏈抗體E27增強MesoCAR-T細(xì)胞體內(nèi)的增殖和持久性Fig.8 E27 enhances the proliferation and persistence of MesoCAR-T cells in vivo

3 討 論

本文針對TME導(dǎo)致的免疫抑制問題,提出了聯(lián)合PD-1阻斷和CAR-T細(xì)胞治療的解決思路,對安全性和有效性做出了優(yōu)化。

首先,在分泌型PD-1單抗聯(lián)用MesoCAR-T細(xì)胞治療非小細(xì)胞肺癌方面完成了全部序列人源化的設(shè)計。CAR-T臨床試驗的主要安全性問題為脫靶毒性和細(xì)胞因子風(fēng)暴,但NSG小鼠由于較為嚴(yán)重的免疫缺陷以及與人種屬差異的存在,對于CAR-T安全性的準(zhǔn)確評估并不是合適的模型,相比較而言臨床數(shù)據(jù)更具有參考價值和意義。間皮素在肺癌患者中的表達頻率為60%～65%[23],已經(jīng)在美國臨床試驗網(wǎng)站注冊的23項試驗中有12項的適應(yīng)癥包含肺癌[24]。并且已經(jīng)公開的相關(guān)數(shù)據(jù)和結(jié)果顯示,除了由于鼠免疫原性的間皮素單鏈抗體引起的急性過敏反應(yīng)[25]和宿主對抗體以及T細(xì)胞的免疫反應(yīng)導(dǎo)致回輸?shù)腃AR-T持續(xù)時間較短療效不佳[26]之外,未出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征或神經(jīng)毒性等癥狀,因此我們認(rèn)為間皮素是CAR-T治療肺癌患者的一個安全有效的靶點。我們通過查閱大量文獻和專利,從序列種屬來源和PD-1阻斷方式角度優(yōu)化CAR載體。靶向間皮素的人源化單鏈抗體序列,這里我們參考了專利WO2013063419A1中的P4單抗序列,其構(gòu)成的抗間皮素CAR-T細(xì)胞在小鼠實驗中療效顯著[27]。現(xiàn)階段PD-1免疫檢查點療法和CAR-T療法的聯(lián)合治療臨床試驗共有17例,其中適應(yīng)癥為實體瘤的有11例[28]。聯(lián)合方式主要有3種:PD-1阻斷劑藥物、CAR-T細(xì)胞PD-1表達的干擾和CAR-T細(xì)胞分泌PD-1抗體?？紤]到分泌型抗體具有更強的靶向性可以避免系統(tǒng)給藥帶來的副作用,相較于單純的部分回輸T細(xì)胞PD-1表達干擾,分泌型抗體在自分泌封閉自身T細(xì)胞的同時也可以通過旁分泌的方式封閉腫瘤區(qū)域的其他免疫細(xì)胞,我們參考了專利US20180127502A1中的E27單抗序列,該單抗與抗原結(jié)合能力較強且在上清液中穩(wěn)定性極高[29],并且在保證分泌效率的情況下我們將分泌信號序列從原來的鼠源替換成了人源IgGSS序列。

其次,證明了在免疫抑制性的實體瘤微環(huán)境中,通過增強CAR-T細(xì)胞的增殖活性和抗凋亡能力,E27-MesoCAR-T在體內(nèi)外得到了更好的抗腫瘤效果,Hu等[30]在敲除PD-1以增強靶向間皮素CAR-T效應(yīng)功能的研究過程中也得到了相同的結(jié)論。

而在阻斷PD-1抗體的結(jié)構(gòu)設(shè)計上,本文選擇了以scFv的形式分泌到胞外。考慮到scFv的穩(wěn)定性較差、親和力較弱等特征,一種通過增加抗體結(jié)合價并引入Fc片段的結(jié)構(gòu)設(shè)計能否帶來更顯著的治療優(yōu)勢值得進一步驗證,如IgG4型單克隆抗體結(jié)構(gòu)[31]。另一方面,在肺癌小鼠模型的建立中依然存在改進完善的空間。本文選擇了高表達MSLN和PD-L1非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系作為靶細(xì)胞,在NSG小鼠背部皮下進行了移植。由于移植位置不屬于重要組織器官,也不影響小鼠正常活動,所以即使瘤體最大長度達到1.5 cm小鼠也不會因為荷瘤負(fù)擔(dān)過大而死,但達到動物實驗倫理的處死規(guī)定,因此不能采集到生存曲線的數(shù)據(jù),肺部原位移植不失為一個更為合理的小鼠模型[20]。而對于不同的患者腫瘤樣本來說,MSLN和PD-L1的陽性率都達到90%以上的情況是極少數(shù)的,在我們構(gòu)建的細(xì)胞模型中分泌型PD-1單抗的MesoCAR-T細(xì)胞展現(xiàn)出顯著的治療優(yōu)勢,但在患者體內(nèi)能否維持,還需要通過病人來源腫瘤異種移植的小鼠進一步探討。