鞠憬，徐彬，劉洋，曹禹，胡亞捷，周萬(wàn)慧，楊玉英，李士澤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

中性粒細(xì)胞（Polymorphonuclears，PMNs）作為免疫系統(tǒng)中第一個(gè)遷移到炎癥部位的細(xì)胞，是固有免疫系統(tǒng)中含量最豐富的一類先天免疫效應(yīng)細(xì)胞；被激活后可通過(guò)吞噬作用、脫顆粒以及一種不同于細(xì)胞死亡的新形式，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）的方式參與機(jī)體免疫[1-2]。它一旦從血液中被招募到感染部位，就會(huì)迅速發(fā)揮其功能，NETs 是它對(duì)抗?jié)撛诓≡w的第三種機(jī)制，這也是它對(duì)微生物和無(wú)菌炎癥的反應(yīng)，更是一種獨(dú)特的細(xì)胞程序性死亡，稱為嗜中性粒細(xì)胞病。在此過(guò)程中組蛋白、顆粒蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白包裹的核源解濃縮DNA 的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)擠壓到細(xì)胞外空間。由于細(xì)胞外染色質(zhì)原纖維可以纏繞微生物，這種結(jié)構(gòu)被稱為NETs。它作為中性粒細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)作用的另一種表現(xiàn)形式早在1996 年外國(guó)學(xué)者TAKEI 等描述了通過(guò)丙二醇甲醚醋酸酯（1-Methoxy-2-propyl acetate，PMA）刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的獨(dú)特現(xiàn)象，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了一種不同于細(xì)胞凋亡和壞死的新途徑。有研究顯示，細(xì)菌、干擾素、缺氧、佛波酯等均可刺激PMNs 生成NETs[3-4]。冷空氣作為北方地區(qū)主要的應(yīng)激源之一嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展。當(dāng)寒冷刺激發(fā)生時(shí)，處于冷應(yīng)激狀態(tài)的動(dòng)物體將啟動(dòng)一系列非特異性的固有免疫反應(yīng)來(lái)響應(yīng)刺激，在此過(guò)程中會(huì)引起免疫細(xì)胞的活化，破壞動(dòng)物體免疫功能[5-6]。

冷暴露作用于機(jī)體時(shí)可激活MyD88 介導(dǎo)的調(diào)控途徑，啟動(dòng)下游的NF-κB 通路促進(jìn)炎癥物質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)作用，toll 樣受體2、4 在此過(guò)程中起關(guān)鍵性作用[7-8]。ANCA 相關(guān)性小血管炎發(fā)病過(guò)程當(dāng)中伴隨有NETs 的形成，而這一過(guò)程主要依賴于TLR2、TLR4 模式識(shí)別受體[9]；而在慢性阻塞性肺疾病患者的外周血PMNs 中也有表述TLR2、TLR4的表達(dá)上調(diào)[10]；那么作為主要的模式識(shí)別受體TLR2、TLR4 被敲除的情況下對(duì)NETs 形成中的影響還未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。

因此，研究通過(guò)使用TLR2、TLR4 基因敲除小鼠，給予冷刺激后提取腹腔原代PMNs 的方法探討了冷暴露能否誘導(dǎo)NETs 的形成，以及TLR2、TLR4 在此過(guò)程中的作用，進(jìn)而為深層次的研究冷應(yīng)激對(duì)NETs 的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與細(xì)胞培養(yǎng)

試驗(yàn)使用的小鼠均為C57BL/6 8 周齡SPF（Specific pathogen free，SPF）級(jí)雄性TLR2 和TLR4 基因敲除小鼠，體重為28~30 g，均購(gòu)自美國(guó)Jackson 實(shí)驗(yàn)室。且試驗(yàn)動(dòng)物均已獲得黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

將TLR2 和TLR4 基因雙敲除小鼠隨機(jī)平均分為常溫對(duì)照組（n=4）和4 ℃冷暴露組（n=4，4 ℃人工氣候室中飼養(yǎng)3 h·d-1），連續(xù)刺激一周后全部處死，提取腹腔原代PMNs；加入于RPMI 1640 培養(yǎng)基中，并置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑

小鼠骨髓中性粒細(xì)胞分離試劑盒（天津?yàn)笕A科生物科技有限公司，中國(guó)）；SytoxTMGreen（Thermo Fisher，美國(guó)）；抗熒光淬滅Hoechst33342 封片液（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；MPO 單克隆抗體、山羊抗兔熒光二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公，中國(guó)）；CitH3 單克隆抗體（Abcam，英國(guó)）；RPMI Medium 1640 basi（Invitrogen，美國(guó)）；WizardGenomic DNA Purification Kit、GoTaqMaster Mixes （Promega，美國(guó)）；RPMI Medium 1640（Solarbio，中國(guó)）；dsDNA HS Assay Kit for Qubit（上海翊圣生物科技有限公司，中國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 普通PCR

取尾組織作為樣本，按說(shuō)明書(shū)步驟操作提取DNA 模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，以TLR2 和TLR4 雙敲除小鼠的KO 型基因與野生型（WT）基因做對(duì)照。PCR反應(yīng)總體系（25μL）：酶12 μL；上下游引物各1 μL（序列見(jiàn)表1）；DEPC 水10 μL；DNA 模板1 μL。

表1 TLR2 和TLR4 特異性引物序列Table 1 TLR2 and TLR4 specific primer sequences

TLR2 基因KO 型與WT 型PCR 程序?yàn)椋篖id，105 ℃；95 ℃，5 min；95 ℃，1 min；56 ℃，1 min；72 ℃，1 min；Repeat back to step 2，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min；后于4 ℃保存。

TLR4 基因KO 型與WT 型PCR 程序?yàn)椋篖id，105 ℃；95 ℃，5 min；95 ℃，1 min；60 ℃，1 min；72 ℃，1 min；Repeat back to step2，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min；后于4 ℃保存。

將儀器調(diào)制400 mA，200 V 后，加入TLR2 和TLR4 基因KO 型與WT 型的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

1.2.2 小鼠腹腔原代PMNs 的分離

抽取1 mL 7.5%的酪蛋白溶液于注射器中水浴加熱，注入小鼠腹腔內(nèi)。24 h 后收集PMNs，將試驗(yàn)小鼠處死置于解剖板上，消毒后做淺腹部中線切口，暴露出完整的腹膜。注射5 mL PMNs 分離培養(yǎng)基，輕輕的按摩腹膜腔以去除附著的PMNs 抽出腹腔灌洗液，按照PMNs 分離試劑盒說(shuō)明書(shū)提取灌洗液中的PMNs 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 掃描電鏡

哀樂(lè)又一次響起在這屋里，阿東被這悲哀之聲壓迫得透不過(guò)氣。但阿里卻立即把頭伸出被子。他的臉上露出平靜表情。仿佛真的是在聽(tīng)母親的聲音。他不說(shuō)話，只側(cè)耳傾聽(tīng)。

將分離的小鼠腹腔原代PMNs，均勻接種到有細(xì)胞爬片的24 孔板中培養(yǎng)，2 h 貼壁后，使用2.5%戊二醛固定6 h；PBS 緩慢沖洗3 次。進(jìn)行濃度為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精梯度脫水各濃度脫水2 次，5 min·次-1。乙酸異戊脂置換處理30 min 后進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥；并粘于樣品臺(tái)上導(dǎo)電處理。處理后的爬片通過(guò)掃描電子顯微鏡獲取圖像。

1.2.4 NETs 的產(chǎn)量檢測(cè)

使用dsDNA QubitR對(duì)NETs 進(jìn)行定量。將PMNs加入96 孔板（1×105個(gè)·孔-1）培養(yǎng)2 h，更換培養(yǎng)基（無(wú)酚紅無(wú)血清的1640）培養(yǎng)3 h。收集培養(yǎng)液離心，取上清加入染料孵育5 min 后，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值，并計(jì)算出cfDNA 的濃度。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

提取原代PMNs 總蛋白，使用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)量并計(jì)算濃度，并將其調(diào)成一致。將處理好的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分離，根據(jù)Marker大小切去多余的膠后，將其轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。5%的脫脂乳封閉（此步驟后，每進(jìn)行下一步驟前均需洗脫殘留物3 次，10 min·次-1）；加入按1∶600 稀釋的MPO、1∶1 000 稀釋的CitH3 的一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜；再加入按1∶10 000 稀釋的對(duì)應(yīng)的二抗孵育1 h。將處理好的膜放入化學(xué)放光成相儀器中觀察，用Image Lab軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠TLR2、TLR4 基因型鑒定

TLR4 基因的KO 型和WT 型條帶大小分別為140、390 bp。TLR2 KO 和WT 基因條帶大小分別為334、499 bp。從圖1 中A 可以看出1~8 號(hào)均在140 bp處有條帶，10~17 號(hào)在390 bp 處均無(wú)條帶出現(xiàn)。圖B中1~8 號(hào)均在334 bp 處有條帶，10~17 號(hào)在499 bp處均無(wú)條帶出現(xiàn)。

圖1 KO 小鼠TLR2 和TLR4 基因型的鑒定Fig.1 Identification of TLR2 and TLR4 genotypes in KO mice

2.2 冷暴露對(duì)TLR2、TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形態(tài)變化的影響

為了確定冷暴露對(duì)NETs 形成的影響，通過(guò)掃描電鏡的方法在在超顯微立體結(jié)構(gòu)上對(duì)PMNs 的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。如圖2 中A B 所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與常溫對(duì)照組的PMNs 相比，冷暴露組的細(xì)胞表面發(fā)生明顯的褶皺和皺縮現(xiàn)象，并且在紅色箭頭標(biāo)記處有明顯的類似與偽足的結(jié)構(gòu)被釋放，并向周?chē)诱?；而常溫?duì)照組的PMNs 表面相對(duì)光滑沒(méi)有偽足生成。

2.3 冷暴露對(duì)TLR2、TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形成NETs 數(shù)量的影響

通過(guò)檢測(cè)PMNs 釋放到上清液中cfDNA 濃度的方法對(duì)NETs 進(jìn)行定量分析，PicoGreen 染色后放入熒光酶標(biāo)儀中檢測(cè)，結(jié)果如圖3 所示，與常溫對(duì)照組相比，冷暴露組的PMNs 上清液中cfDNA 濃度明顯升高，且差異顯著（P<0.001）。

圖3 冷暴露對(duì)TLR2、TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形成NETs 數(shù)量的影響Fig.3 The effect of cold exposure on the number of NETs formed by primary PMNs in the abdominal cavity of TLR2 and TLR4 knockout mice

2.4 冷暴露對(duì)TLR2、TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形成NETs 組件蛋白表達(dá)水平的影響

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，與常溫對(duì)照組相比冷暴露組的NETs 組件蛋白CitH3、MPO 的蛋白表達(dá)水平均有顯著升高（P<0.01、P<0.001）。

圖4 冷暴露對(duì)TLR2、TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形成NETs 組件蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 The effect of cold exposure on the protein expression level of NETs component ofprimary PMNs in the abdominal cavity of TLR2 and TLR4 knockout mice

3 討論

寒冷刺激是東北部主要應(yīng)激源之一，長(zhǎng)期暴露在冷環(huán)境中機(jī)體會(huì)表現(xiàn)出一系列不良反應(yīng)，以至于生長(zhǎng)發(fā)育和免疫系統(tǒng)受到不同程度的損傷。研究顯示，寒冷應(yīng)激狀態(tài)持續(xù)發(fā)生時(shí)會(huì)增加各種疾病感染的風(fēng)險(xiǎn)以及引自身抵抗力衰減等癥狀[11-12]。免疫細(xì)胞，特別是PMNs 形成的NETs 是理解免疫血栓形成的核心。它作為先天免疫的前哨細(xì)胞，負(fù)責(zé)防御宿主殺滅入侵的微生物。有研究表明，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)微粒復(fù)合物是中性粒細(xì)胞募集的有效誘導(dǎo)物，此過(guò)程依賴于微粒上表達(dá)的高遷移率族蛋白1，并通過(guò)TLR2 和TLR4 介導(dǎo)來(lái)共同完成[13]。sTLR9+ PMNs亞群中主要對(duì)TLR9 介導(dǎo)的全身性炎癥反應(yīng)起保護(hù)作用的關(guān)鍵受體[14]；那么TLR2 和TLR4 被敲除后對(duì)冷暴露條件下的PMNs 以及形成NETs 的能力有什么影響仍需進(jìn)一步研究。因此，試驗(yàn)選用TLR2 和TLR4 基因敲除小鼠并對(duì)其進(jìn)行基因型的鑒定，確定基因成功敲除后在4 ℃人工氣候室中飼養(yǎng)并提取腹腔原代PMNs 進(jìn)行以下試驗(yàn)。

為進(jìn)一步確定冷暴露對(duì)TLR2 和TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形態(tài)結(jié)構(gòu)和形成NETs 的影響以及與TLR2、TLR4 的聯(lián)系，我們利用掃描電鏡進(jìn)行了顯微結(jié)構(gòu)上的形態(tài)學(xué)檢測(cè)。有相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，患有乳房炎的奶牛所產(chǎn)出的奶中的中性粒細(xì)胞發(fā)生變形，同時(shí)有NETs 的形成，其形態(tài)呈現(xiàn)出向周?chē)煺钩鰝巫愕淖兓痆15]。在Mori Yuka 等[16]發(fā)表的一文中NETs 有相同的形態(tài)表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與常溫對(duì)照組相比冷暴露組的PMNs 表面發(fā)生明顯的皺縮現(xiàn)象、伴有類似于偽足結(jié)構(gòu)的NETs 向四周延伸，且與以上研究所得結(jié)果一致。說(shuō)明了冷暴露能夠改變PMNs 的形態(tài)，并誘導(dǎo)其生成并釋放NETs，且此過(guò)程不受TLR2、TLR4 基因介導(dǎo)的途徑調(diào)控。

NETs 主要由核酸和顆粒蛋白構(gòu)成，其中顆粒蛋白附著在以DNA 為骨架的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上是發(fā)揮主要功能的物質(zhì)，主要包括具有抗菌作用的中性粒細(xì)胞彈性蛋白（Neutrophil elastase，NE）、CitH3、MPO、組織蛋白酶G 等[17-19]。cfDNA 作為NETs 的主要核酸成分，在其它研究領(lǐng)域也備受關(guān)注。比如血漿cfDNA水平升高可預(yù)測(cè)膿毒癥患者多器官功能障礙[20]。在重癥肺炎患者的血漿cf-DNA/NETs 水平與預(yù)后進(jìn)程緊密相關(guān)[21]。同樣在NETs 參與調(diào)節(jié)急性力竭及規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)相關(guān)天然的作用[22]的一文中cfDNA 也作為關(guān)鍵的檢測(cè)指標(biāo)。因此，研究通過(guò)檢測(cè)cfDNA 的濃度來(lái)定量分析在冷暴露條件下NETs 的生成數(shù)量，結(jié)果顯示與常溫對(duì)照組相比冷暴露組TLR2、TLR4 基因敲除小鼠的腹腔原代PMNs 上清液中的cfDNA 的濃度顯著升高，說(shuō)明冷暴露促進(jìn)了NETs 的生成。

由于NETs 是以DNA 為骨架結(jié)構(gòu)上面還黏附著大量的蛋白質(zhì)，所以只檢測(cè)cfDNA 的濃度不足以說(shuō)明問(wèn)題，因此，研究還檢測(cè)了NETs 組件蛋白質(zhì)MPO、CitH3 等的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TLR2、TLR4 基因敲除小鼠在受到冷暴露后所提取的腹腔原代PMNs 的蛋白質(zhì)中MPO、CitH3 的表達(dá)水平與常溫對(duì)照組比均有顯著升高。進(jìn)一步說(shuō)明了在TLR2、TLR4 基因的敲除不影響冷暴露誘導(dǎo)NETs 的形成增加；有研究顯示，冷暴露作為內(nèi)源性因素可引起機(jī)體代謝變化，而導(dǎo)致H3 的瓜氨酸化的修飾，而組蛋白的這一修飾方式也是NETs 產(chǎn)生的主要原因之一[23-25]。

4 結(jié)論

綜上所述發(fā)現(xiàn)，敲除TLR2 和TLR4 基因的小鼠在受到冷暴露后，提取的腹腔原代PMNs 仍可生成NETs，說(shuō)明冷暴露能夠誘導(dǎo)TLR2 和TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代中性粒細(xì)胞形成NETs。