賈博為，金軍，莊齊，董偉峰，才曉溪，孫明哲，孫曉麗

（黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院/作物逆境分子生物學實驗室，大慶 163319）

植物不可移動，且生活在不斷變化的環(huán)境中，往往這個環(huán)境不利于植物的生長和發(fā)育。這些不利的環(huán)境條件包括生物脅迫，如病原感染和食草動物攻擊，以及非生物脅迫，如干旱、熱、冷、營養(yǎng)缺乏和土壤中過量的金屬離子。干旱、鹽和溫度脅迫是影響植物自然地理分布、限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和威脅糧食安全的主要環(huán)境因素。在非生物脅迫應答中，轉運蛋白在重建和維持離子平衡中起到重要作用，是反應植物脅迫耐性能力高低的指標之一。

陽離子質子逆向轉運蛋白（CPA，cation proton antiporter）主要參與單價陽離子的交換和轉運，除了Na+與H+的轉運發(fā)生逆轉，還參與單價陽離子，如K+和Li+[1]等的轉運。在進化關系上，陽離子質子逆向轉運蛋白可分為CPA1 和CPA2 兩個超家族。其中，CPA1 超家族可分為兩類，包括與植物耐鹽性相關、特征明確的重要調控基因，鹽過度敏感1 家族（SOS1，salt overly sensitive 1）和鈉氫交換蛋白家族（NHX，Na+/H+exchanger）?，F(xiàn)有研究表明豇豆、蘋果、馬齒莧、花生和菊芋NHX 基因可參與調節(jié)耐鹽性[2-6]。且鹽脅迫下，小麥根組織中NHX 的表達上調。而CPA2 由KEA（K+efflux antiporter）和CHX（cation/H+exchanger）兩個亞家族組成[7-8]。其中，CHX 亞家族成員最多，主要存在于高等植物中，參與維持pH 穩(wěn)態(tài)和離子平衡[9-10]。研究表明，AtCHX17 基因主要在花粉、根和葉片中表達，且受脫落酸、高鹽脅迫、酸性pH 和缺K+的誘導。AtCHX16/17/18/19 主要在擬南芥根、花及花粉中表達，對生殖生長和種子發(fā)育起十分重要的作用[11-13]。野生大豆CHX19.3 基因可促進過表達擬南芥對鉀離子的吸收，并正向調節(jié)過表達擬南芥對高鹽和碳酸鹽脅迫的耐性，GsCHX19.3 過表達可增加正常條件下鉀離子的吸收，減少鈉離子的吸收或增加鈉離子的外排，從而緩解鹽堿脅迫引起的離子中毒[14-15]。鹽芥CHX18 在玉米中的過量表達可顯著提高玉米的耐鹽性[16]。迄今為止發(fā)現(xiàn)有報道的CHX都可調控鉀離子轉運，并且可以在不同pH 發(fā)揮功能，這表明它們在調控堿性陽離子和pH 平衡中扮演著不同于其他CPA 超家族成員的作用[13]。

目前，CHX 基因家族已在多個植物中有報道，如擬南芥、葡萄、大豆、水稻和藻類等[10，17-19]。但是，關于玉米CHX 基因家族的研究尚未見報道。因此，研究從玉米CHX 基因入手，通過構建隱馬爾科夫模型，對玉米CHX 基因家族進行了全基因組鑒定，篩選獲得了16 個ZmCHXs 基因，并全面分析了其基因家族的理化性質、基因結構、基因序列、染色體定位、進化關系、保守結構域、組織表達特性和非生物脅迫表達模式，為后續(xù)更深一步解析ZmCHXs 基因耐逆功能提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 玉米CHX 基因家族成員的篩選與分析

基于已發(fā)表的擬南芥CPA 家族基因蛋白序列[17]通過HMMER 分析，構建隱馬爾科夫模型，從Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）[20]數(shù)據(jù)庫獲得玉米全基因組和蛋白組序列信息。進一步利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）[21]和Pfam（http://pfam.xfam.org）[22]軟件篩選候選蛋白，最終獲得含有完整Na+/H+exchanger 結構域（PFAM 號：PF00999）的ZmCHX 家族基因。采用ExPASy（https://web.expasy.org）預測玉米CHX 蛋白的基本理化性質。利用CBS（http://www.cbs.dtu.dk）預測蛋白亞細胞定位。SMART 軟件預測跨膜結構域。MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）[23]分析玉米CHX 家族基因保守Motif。

1.2 玉米CHX 基因家族系統(tǒng)進化分析

采用MEGA-X 軟件中的鄰接法（NJ，Neighbor-Joining）構建ZmCHX、OsCHX[19]和AtCHX[17]家族系統(tǒng)進化樹。其中，自展值（Bootstrap）設置為1000，數(shù)據(jù)處理選擇Partial deletion，并設置為95%[24]。

1.3 玉米CHX 基因家族染色體定位及同源性分析

應用玉米基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome 獲取基因所在染色體位置信息?；贠rtho Venn2（https://orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home）[25]分析玉米、水稻以及擬南芥CHX 基因同源性。最終利用TBtools[26]軟件繪制基因染色體分布和同源關系圖。

1.4 玉米CHX 基因家族組織表達模式分析

從ePlant（http://bar.utoronto.ca/eplant/）[27]數(shù) 據(jù) 庫中下載玉米CHX 家族基因組織表達數(shù)據(jù)，玉米在鹽脅迫（150 mM NaCl）和冷脅迫（5 ℃）處理下的轉錄組數(shù)據(jù)來自黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術與作物種質改良重點實驗室（NCBI 登錄號：SRP307694）[28]。進一步利用TBtools 軟件繪制玉米CHX 基因家族的表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 玉米CHX 基因全基因組鑒定

利用已發(fā)表的擬南芥CPA 超家族蛋白序列信息[1]構建隱馬爾科夫模型，以此來搜索玉米數(shù)據(jù)庫，整合SMART、Pfam 和基于NCBI 的CDD 進行結構域分析，最終獲得了31 個含有完整Na+/H+exchanger 結構域（Pfam 號：PF00999）的玉米CPA 基因。通過與擬南芥CPA 超家族構建系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)，其中16 個基因與CHX 家族聚合在一起，8 個基因分配到了KEA家族，剩下的7 個基因屬于NHX 家族（圖1）。

圖1 玉米和擬南芥CPA 家族進化關系分析Fig.1 Evolutionary relationship analysis of CPA family from maize and Arabidopsis thaliana

進一步對玉米ZmCHXs 基因家族進行理化性質分析，結果如表1 所示，16 個玉米CHX 基因編碼氨基酸序列從743~1141 不等，蛋白序列N 端都包含有一個Na+/H+exchanger 結構域，并且含有8~12 個跨膜結構域（表1）。等電點范圍從5.95~9.03，其中6 個ZmCHXs 蛋白的等電點均大于7，偏堿性。然而，余下的10 個ZmCHXs 蛋白的等電點均小于7，偏酸性。此外，它們的親疏水性均值在0.117~0.5 之間，表明ZmCHXs 基因都編碼疏水蛋白。進一步預測蛋白亞細胞定位，結果表明16 個ZmCHXs 均定位在質膜或內質網(wǎng)膜上，這是轉運蛋白發(fā)揮功能的結構基礎。

表1 玉米CHX 家族基因的基本信息Table 1 Basic information of CHX genes from maize

2.2 玉米CHX 基因染色體定位及同源基因分析

ZmCHXs 基因染色體定位分析結果表明16 個ZmCHXs 基因分布在8 條不同的染色體上。其中8 號染色體上的基因數(shù)目高達4 個，4 號染色體上有3個，而其它染色體上只含有1~2 個（圖2）。進一步基于OrthoVenn2 對玉米、水稻及擬南芥CHX 基因家族同源性分析（圖2），結果表明玉米和水稻CHX 家族有16 對直系同源基因，而玉米和擬南芥CHX 家族僅有5 對直系同源基因，水稻和擬南芥直系同源基因只有4 對。這是由于玉米和水稻都是單子葉禾本科植物，具有較近的親緣關系，基因功能也可能相似，而與雙子葉植物擬南芥親緣關系遠，導致同源基因少。此外，圖2 結果顯示，玉米和水稻均具有2 對旁系同源基因，雙子葉植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)了54 對旁系同源基因，這些基因的擴張可能來自于基因復制。

續(xù)表1 玉米和擬南芥CPA 家族進化關系分析Continued table 1 Basic information of CHX genes from maize

圖2 玉米、水稻和擬南芥CHXs 基因同源關系分析Fig.2 Homology analysis of CHXs in maize，Oryza sativa and A.thaliana

2.3 玉米CHX 基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為進一步了解ZmCHXs 進化關系，利用玉米（16個）、擬南芥（28 個）、水稻（17 個）共61 個CHX 蛋白序列構建系統(tǒng)進化樹。結果如圖3 所示，與擬南芥CHX 家族分類一樣[17]，61 個CHX 成員可分為5 組（GroupⅠ~Ⅴ），而研究發(fā)現(xiàn)玉米與水稻CHX 只分成了3 組（GroupⅠ、Ⅲ和Ⅳ），缺少GroupⅡ和GroupⅤ成員[19]。其中GroupⅢ包含的成員最少，只有3 個基因，而GroupⅣ包含的成員最多，有8 個基因。這與Sze 等和才曉溪等[17-18]研究結果一致，GroupⅡ和GroupⅤ可能是擬南芥和大豆等雙子葉植物特有的基因，擬南芥的GroupⅡ和GroupⅤ中缺乏玉米和水稻同源基因（圖3），造成了單子葉植物玉米和水稻缺少這兩個亞家族的基因。

圖3 玉米、水稻和擬南芥CHXs 進化關系分析Fig.3 Evolutionary relationship analysis of CHXs from maize（Zm），O.sativa（Os）and A.thaliana（At）

2.4 玉米CHX 基因家族的序列和結構域分析

為深入解析玉米CHX 功能，對玉米其基因結構進行分析，結果發(fā)現(xiàn)除了ZmCHX13.2 和ZmCHX28不含有內含子之外，其他14 個ZmCHX 基因都含有1~6 個內含子不等（圖4）。其中，GroupⅢ的成員最少，并且與其他兩組相比UTR（Untranslated Region）結構較短。GroupⅠ和GroupⅢ基因成員中含有非編碼區(qū)均在N 端，而GroupⅣ的非編碼區(qū)在N 端或C端。總的來說，非編碼區(qū)占比較少，且都分布在兩端。

圖4 玉米CHXs 家族基因結構分析Fig.4 Gene structure analysis of maize CHXs

利用NCBI 對保守結構域分析，結果表明N 端都含有保守的Na+/H+exchanger 結構域，調控Na+轉運，從而維持細胞質Na+濃度保持在較低水平[29]。進一步利用MEME 軟件分析16 個ZmCHX 保守基序（motif），結果如圖5 顯示N 端的motif 4、5、6、8、9、11 和12 共同構成了Na+/H+exchanger 結構域。并且，在此結構域的C 端緊鄰一個AANH-like 結構域（由motif 2、3 和7 構成）。除此之外，在C 端還有2 保守結構域（motif 1 和10），但這些結構域的功能仍是未知的。綜上能夠看出這些ZmCHX 基因成員有共同的結構域，并且保守性很高。由此說明玉米CHX 家族在進化上是保守的，特別是基因結構和保守結構域的分布上。

圖5 玉米CHXs 保守結構域和基序分析Fig.5 Conserved domain and motif analysis of maize CHXs

2.5 玉米CHX 基因表達模式分析

基于ePlant 數(shù)據(jù)庫，對ZmCHX 家族進行組織特異性分析。結果如圖6 所示，玉米的CHX 基因的表達模式和已發(fā)表的大豆CHX 表達模式相似[18]，都是在生殖器官中高表達，表明CHX 家族成員在生殖生長過程扮演重要角色。而在Croup IV 中，ZMCHX19.1、ZMCHX19.2、ZMCHX19.3 和ZMCHX20 在花中表達量不高，卻在種子、莖、葉和根上有不同程度的表達。大部分ZmCHXs 在花藥中表達量高，ZMCHX15.2 和 ZMCHX15.3、ZMCHX15.1 和 ZMCHX15.2、ZMCHX15.1 和ZMCHX15.3 這三對同源基因在各組織中表達模式相似，都是在花粉中表達量最高（圖6）。據(jù)已有報道，ZmCHX15.2 的同源基因AtCHX15 在花藥中高表達，而ZmCHX15.2 表現(xiàn)出了相似的組織表達模式，在花藥中高表達。同樣地，ZmCHX20 與同源基因AtCHX20 具有相似的組織表達模式，在花藥中高表達[10]。

圖6 玉米CHXs 基因組織表達模式分析Fig.6 Tissue expression patterns of maize CHXs

為揭示ZmCHX 在脅迫應答中的作用，基于玉米根部轉錄組數(shù)據(jù)分析ZmCHX 脅迫表達模式。結果如圖7 所示，在冷脅迫中，ZmCHX13.3 表達量最高，GroupⅣ中ZmCHX20 表達量上調，表明這些基因能夠響應玉米冷脅迫。鹽脅迫下，ZmCHX19.2 和GroupⅣ中ZmCHX15.1 的表達量明顯上升，表明這2 個基因可能參與鹽脅迫應答。ZmCHX2.1、ZmCHX13.3、ZmCHX13.1、ZmCHX15.2、ZmCHX15.1、ZmCHX19.2在鹽脅迫第三天表達量最高。在逆境脅迫下，GroupⅣ中表達量升高的成員最多，可能在脅迫應答中發(fā)揮重要的作用。

圖7 玉米CHXs 基因冷和鹽脅迫表達模式Fig.7 Expression profiles of maize CHXs under cold and salt stresses

3 討論

由于植物是固著不可移動的，易受外界環(huán)境不利因素的影響。據(jù)統(tǒng)計，目前鹽和冷脅迫對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失逐年增加。鹽脅迫導致細胞質鈉離子濃度增加，破壞離子體內平衡。因此，過量的鈉離子會抑制酶的活性[30]。因此，植物一旦受到鹽脅迫，需要啟動一系列信號途徑來維持體內低鈉離子和高鉀離子含量。冷脅迫導致構成膜的脂質由液相轉變?yōu)楣滔?，即膜脂變相，引起與膜相結合的酶失活。隨著基因工程和基因組測序工作的不斷更新和完成，許多玉米基因組密碼陸續(xù)被破解，利用生物信息學手段分析基因功能和基因家族是現(xiàn)代基因功能研究的一個熱點。與玉米相關的基因家族研究已經(jīng)有很多報道，例如玉米SPP 基因家族[31]、玉米GATA 基因家族[32]、玉米XYLPs 基因家族[33]等，這些研究為了后續(xù)深入研究功能機制奠定基礎。

目前，CHX 基因家族已經(jīng)在擬南芥[17]、大豆[18]、水稻[19]、以及藻類等多種植物中被報道[10]。但是關于玉米CHX 基因的研究尚未見報道。因此，研究利用生物信息學手段對玉米CHX 基因進行了系統(tǒng)全面的分析，共鑒定篩選出16 個玉米ZmCHX 基因家族成員。值得注意的是，玉米和水稻CHX 基因數(shù)目相近，但二者基因數(shù)目約是擬南芥的一半。家族進化和同源關系結果表明，玉米和水稻同是單子葉植物，同源基因較多。而玉米和擬南芥不同科不同屬，所以同源基因較少。擬南芥多余的CHX 基因存在功能冗余[17]。利用玉米CHX 基因家族與水稻和擬南芥在一起構建物種進化樹，從系統(tǒng)進化樹和基因結構可以看出，親緣關系相近的基因之間在保守基序和基因結構上有高度的保守性和相似性。玉米CHX 基因家族成員不均勻的分布在8 條染色體上，亞細胞定位分析表明，與擬南芥、大豆以及葡萄定位結果相似，大多數(shù)是定位在細胞膜上[34]?；蚣易宓臄U大主要是由基因復制引起的，在植物進化過程中，復制的基因可以獲得新的功能或分割現(xiàn)有的功能，以提高植物的適應性。不同物種在進化中都存在基因復制關系[35]，根據(jù)同源性分析結果表明，玉米CHX 有2 對旁系同源基因，這說明基因復制對玉米基因家族的擴增有一定意義。

通過對玉米CHX 基因家族成員的保守基序分析發(fā)現(xiàn)，蛋白N 端緊鄰Na+/H+exchanger 結構域和蛋白C 末端緊鄰AANH-like 結構域。目前，所有已被研究的植物CHX 成員中都有植物CHX 轉運體的C 末端AANH-like 保守結構域存在[17，34]。據(jù)前人報道，CHX 基因家族可以增強植物在生長發(fā)育過程中抵抗外界不利環(huán)境的能力。水稻的OsCHX14 基因主要在花中表達[7]。擬南芥的AtCHX16/17/18/19 基因在其根、花粉以及花中有較高的表達量，當擬南芥同時缺少這四個基因時，種子數(shù)量顯著減少[13]。研究中玉米CHX 基因家族成員同樣在花中表達量較高，表明CHX 家族基因成員可能參與開花結實等相關生物學過程。冷脅迫表達分析中，ZmCHX13.3、ZmCHX20 在冷脅迫過程中表達量上調，表明這些基因的過表達參與了低溫脅迫響應。鹽堿脅迫下ZmCHX15.1、ZmCHX19.2 上調表達，表明這些基因可能參與調控鹽堿脅迫應答。

通過對玉米ZmCHX 基因的研究分析，為了解和分析ZmCHX 基因家族成員的功能以及在玉米成花器官生長發(fā)育的調控機制及維持細胞內離子平衡等方面奠定了一定的理論基礎。后續(xù)將進一步對玉米CHX 家族基因進行功能驗證。

4 結論

通過全基因組鑒定共獲得16 個ZmCHXs 基因家族成員，分布在8 條不同的染色體上；系統(tǒng)進化將其分為3 組，且各組內蛋白序列和基因結構保守；進一步組織表達特性和非生物脅迫表達特性分析表明ZmCHXs 主要表達在花藥中，且僅有Group Ⅳ基因的表達受冷及鹽脅迫誘導。