李明煒，王云霞，王 靜

（1.鄭州人民醫(yī)院口腔科，河南 鄭州 450053；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院牙體牙髓科，河南 鄭州 450052）

牙髓干細(xì)胞（DPSCs）是一類(lèi)源于牙髓的間充質(zhì)干細(xì)胞，除了具有高增殖潛能和易于冷凍保存之外，其多向分化的潛能和調(diào)節(jié)其他細(xì)胞功能的能力使它們適用于多種組織類(lèi)型的再生研究[1-2]。目前，DPSCs已可被誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等[3-4]。然而，目前DPSCs的詳細(xì)分化機(jī)制尚不清楚，也限制了DPSCs在組織工程中的應(yīng)用。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22 nt的單鏈非編碼RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后機(jī)制對(duì)其靶點(diǎn)進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，從而在不同生物信號(hào)途徑中發(fā)揮作用[5]。有報(bào)道顯示，miR-143-3p可抑制人牙周膜細(xì)胞的成骨分化，也能夠抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力[6-7]。因此，本研究假設(shè)miR-143-3p可能對(duì)人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）的生物學(xué)功能具有一定影響，通過(guò)抑制miR-143-3p的表達(dá)觀察其對(duì)hDPSCs凋亡及分化能力的影響，并探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

收集本院口腔門(mén)診因正畸治療而拔除的健康、完整的前磨牙和智齒（拔牙前已征得患者知情同意），在超凈工作臺(tái)內(nèi)分離牙髓組織，經(jīng)消化、離心后，將其培養(yǎng)在含10%血清的DMEM培養(yǎng)液中，取第3～7代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)鑒定，本研究分離、培養(yǎng)的細(xì)胞為hDPSCs。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)）；miR-143-3p inhibitor及其陰性對(duì)照、RANK-siRNA、雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pmirGLO（上海吉瑪公司，中國(guó)）；膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、茜素紅S染色液、青鏈霉素混合液（100×）（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)）；骨保護(hù)素（OPG）、核因子κB受體活化因子（RANK）、核因子κB受體活化因子配體（RANKL）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗人的單克隆抗體（CST公司，美國(guó)）；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒（Thermo Scientific公司，美國(guó)）。

1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司，美國(guó)）；凝膠成像儀（Bio-rad公司，美國(guó)）；倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）；PCR儀（Applied Biosystems公司，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（Thermo Scientific公司，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)）；電泳儀（北京六一儀器廠，中國(guó)）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hDPSCs，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)，參照LipofectaminTM2000試劑盒（Thermo Scientific公司，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)對(duì)hDPSCs進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分為NC組、miR-143-3p inhibitor組、RANK-siRNA組及miR-143-3p inhibitor+RANK-siRNA組，另取正常hDPSCs作為對(duì)照組（control），使用無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染5 h后將各組hDPSCs更換為完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用RT-qPCR法檢測(cè)hDPSCs中miR-143-3p和RANK mRNA表達(dá)水平。

1.4.2 RT-qPCR 提取hDPSCs細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過(guò)熒光定量PCR儀檢測(cè)各基因mRNA表達(dá)水平。以U6為miR-143-3p的內(nèi)參，其他基因均以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hDPSCs凋亡情況 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的hDPSCs，細(xì)胞分組同1.4.1，用磷酸鹽緩沖 液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，加 入binding buffer重懸，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×106個(gè)/mL，再依次加入AnnexinⅤ-FITC和PI孵育，通過(guò)上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4.4 茜素紅染色 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的hDPSCs，以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（DMEM完全培養(yǎng)液+10 ng/mL地塞米松+50 mg/mL維生素C+10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉），每2 d更換1次成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，培養(yǎng)21 d后棄培養(yǎng)上清液，用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，雙蒸水洗滌3次，吸干水分后加入茜素紅染液染色20～30 min，雙蒸水洗滌5次，然后將其置于顯微鏡下觀察拍照。在細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入2 mL 10%氯化十六烷基吡啶，于室溫下靜置30 min后，應(yīng)用酶標(biāo)儀在562 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.4.5 Western blotting 提取細(xì)胞蛋白樣品并測(cè)定其濃度，蛋白變性后，按照30μg/孔的上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，封閉，加入對(duì)應(yīng)的一抗稀釋液（1∶1 000）于4℃下孵育過(guò)夜，于37℃下孵育二抗（1∶1 000）2 h，洗滌后滴加適量的發(fā)光試劑于膜上，放入凝膠成像儀中顯影蛋白條帶。

1.4.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mi R-143-3p與RANK的靶向關(guān)系 根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/）的預(yù)測(cè)結(jié)果得到miR-143-3p是RANK的調(diào)控miRNA，為檢測(cè)miR-143-3p與RANK的靶向關(guān)系，設(shè)計(jì)與miR-143-3p相結(jié)合的RANK 3′-UTR序列及突變序列，并插入到pmirGLO載體上（此項(xiàng)工作委托上海吉瑪公司完成）。將hDPSCs接種到24孔板中，密度為5×104個(gè)/孔，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，轉(zhuǎn)染RANK-3′-UTR-NC/RANK-3′-UTR-WT/RANK-3′-UTR-MUT報(bào)告質(zhì)粒、miR-143-3p及對(duì)照NC質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-143-3p表達(dá)變化對(duì)hDPSCs中RANK表達(dá)水平的影響

結(jié)果顯示，miR-143-3p在hDPSCs中的表達(dá)水平與RANK的表達(dá)水平成反向調(diào)控關(guān)系。轉(zhuǎn)染后，與control組比較，NC組miR-143-3p的表達(dá)水平無(wú)顯著改變（P＞0.05）；與control組和NC組比較，miR-143-3p inhibitor組miR-143-3p的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。相反的是，與control組和NC組比較，miR-143-3p inhibitor組RANK的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1。

圖1 miR-143-3p表達(dá)變化對(duì)RANK mRNA表達(dá)水平的影響Figure 1 The effect of miR-143-3p expression level changes on the RANK mRNA expression level

2.2 miR-143-3p對(duì)hDPSCs凋亡的影響

與control組和NC組比較，miR-143-3p inhibitor組細(xì)胞凋亡率增加，而RANK-siRNA組凋亡率降低（P＜0.05）。miR-143-3p inhibitor+RANK-siRNA組細(xì)胞凋亡率高于RANK-siRNA組，而低于miR-143-3p inhibitor組（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2～3。

圖2 各組細(xì)胞凋亡率比較Figure 2 Comparison of cell apoptosis rate in each group

2.3 miR-143-3p對(duì)hDPSCs成骨分化的影響

茜素紅染色顯示，與control組和NC組比較，miR-143-3p inhibitor組細(xì)胞染色顯著加深，礦化結(jié)節(jié)增多，相應(yīng)吸光度值增加（P＜0.05），而RANKsiRNA組則出現(xiàn)相反的結(jié)果，即礦化結(jié)節(jié)減少，染色程度減輕，吸光度值降低（P＜0.05）。miR-143-3p inhibitor+RANK-siRNA組茜素紅染色程度、礦化結(jié)節(jié)和吸光度值較RANK-siRNA組增加，而較miR-143-3p inhibitor組減少（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖4～5。

圖3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果Figure 3 Results of cell apoptosis detection

圖4 茜素紅染色結(jié)果（×200）Figure 4 Alizarin red staining results(×200)

圖5 茜素紅染色吸光度值比較Figure 5 Comparison of absorbance values of alizarin red staining

2.4 miR-143-3p對(duì)hDPSCs中OPG、RANK、RANKL、Runx2、OCN、ALP、BMP2 mRNA表達(dá)的影響

與control組和NC組比較，miR-143-3p inhibitor組細(xì)胞的OPG mRNA表達(dá)水平降低，RANK、RANKL及細(xì)胞骨向分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平上調(diào)；RANK-siRNA組相反，其OPG mRNA表達(dá)水平增加，RANK、RANKL及細(xì)胞骨向分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。miR-143-3p inhibitor+RANK-siRNA組的OPG mRNA表達(dá)水平低于RANK-siRNA組而高于miR-143-3p inhibitor組，RANK、RANKL及細(xì)胞骨向分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平高于RANK-siRNA組而低于miR-143-3p inhibitor組（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖6。

圖6 miR-143-3p對(duì)hDPSCs中各基因表達(dá)的影響Figure 6 The effect of miR-143-3p on the expression of genes in hDPSCs

2.5 miR-143-3p對(duì)hDPSCs中OPG、RANK、RANKL、Runx2、OCN、ALP、BMP2蛋白表達(dá)的影響

與control組和NC組比較，miR-143-3p inhibitor組細(xì)胞的OPG蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），RANK、RANKL及細(xì)胞骨向分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，RANK-siRNA組則出現(xiàn)相反的結(jié)果（P＜0.05）。MiR-143-3p inhibitor+RANK-siRNA組的OPG蛋白表達(dá)水平低于RANK-siRNA組而高于miR-143-3p inhibitor組，而其RANK、RANKL及細(xì)胞骨向分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平高于RANK-siRNA組而低于miR-143-3p inhibitor組（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖7。

圖7 miR-143-3p對(duì)hDPSCs中各蛋白表達(dá)的影響Figure 7 The effect of miR-143-3p on the expression of proteins in hDPSCs

2.6 miR-143-3p對(duì)RANK的靶向調(diào)控作用

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan對(duì)miR-143-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和鑒定，RANK被預(yù)測(cè)為miR-143-3p的潛在靶基因。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，miR-143-3p顯著降低了RANK-3′-UTR-WT的細(xì)胞中熒光素酶活性（P＜0.05），而在RANK-3′-UTR-MUT和RANK-3′-UTR-NC的細(xì)胞中，熒光素酶活性無(wú)顯著變化（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖8。

圖8 miR-143-3p與RANK 3′UTR潛在結(jié)合點(diǎn)（A）及熒光素酶活性（B）Figure 8 Potential binding sites(A)and luciferase activity(B)of miR-143-3p and RANK 3′UTR

3 討論

隨著對(duì)非編碼RNA（non-coding RNA）的深入研究，miRNAs在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物活動(dòng)中的重要作用逐漸被揭示。如Tao等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-142a-3p通過(guò)靶向腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白2（tumor necrosis factorα-induced protein 2，TNFAIP2）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（glucose transporter 3，GLUT3）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和巨噬細(xì)胞極化。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)miR-543通過(guò)靶向絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和Wnt/β-catenin通路抑制TGF-β處理的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，也有研究表明，下調(diào)的miR-143-5p可通過(guò)OPG/RANKL信號(hào)通路增強(qiáng)Runx2的表達(dá)以促進(jìn)DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化[10]。作為腫瘤壞死因子受體超家族的成員，RANK可以被RANKL激活，并在牙周炎和血管鈣化導(dǎo)致的牙髓組織損傷中發(fā)揮重要作用[11]。在本研究中，我們假設(shè)miR-143-3p可能對(duì)hDPSCs的生物學(xué)功能具有一定影響，對(duì)hDPSCs中miR-143-3p的表達(dá)進(jìn)行了下調(diào)處理，結(jié)果顯示，miR-143-3p在hDPSCs中的表達(dá)與RANK的表達(dá)成反向調(diào)控關(guān)系，miR-143-3p的下調(diào)使RANK的表達(dá)顯著升高，而抑制miR-143-3p的表達(dá)誘導(dǎo)了hDPSCs凋亡；相反的是，沉默RANK則使hDPSCs的凋亡率降低。

目前，hDPSCs已被證明在牙本質(zhì)、牙髓修復(fù)和再生中發(fā)揮重要作用，是用于再生治療的牙科干細(xì)胞之一，這與其較強(qiáng)的骨向分化潛能密切相關(guān)[12]。

OPG/RANKL/RANK途徑與機(jī)體維持骨代謝生理平衡密不可分，是正常骨重建過(guò)程所必須的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，影響著破骨細(xì)胞的活性及存活情況[13]。破骨細(xì)胞的形成、分化和激活需要RANK和RANKL之間的相互作用，另一方面，OPG特異性結(jié)合RANKL并抑制RANK與RANKL相互作用，破骨細(xì)胞生成被OPG中斷，隨后破骨細(xì)胞的活性及骨吸收均減少[14]。研究表明，OPG/RANKL/RANK途徑亦與牙周炎、牙源性腫瘤等頜面部骨缺損疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[15]。Runx2是調(diào)控成骨分化的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，與BMP2一樣均是較強(qiáng)的成骨激動(dòng)劑，ALP為早期成骨細(xì)胞分化的代表性標(biāo)志物，其活性反映了細(xì)胞成骨分化趨勢(shì)，OCN是骨基質(zhì)中特異性非膠原蛋白，其表達(dá)反映成骨細(xì)胞活性和骨轉(zhuǎn)換情況，上述指標(biāo)均在成骨細(xì)胞的形成、分化、活性和功能中具有重要作用[16-18]。本研究中，相比control組和NC組，抑制miR-143-3p可見(jiàn)hDPSCs細(xì)胞有更多的礦化結(jié)節(jié)和染色加深，同時(shí)，OPG mRNA和蛋白表達(dá)降低，RANK、RANKL、Runx2、OCN、ALP、BMP2 mRNA和蛋白表達(dá)增加，提示下調(diào)的miR-143-3p可通過(guò)激活OPG-RANKL-RANK軸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并促進(jìn)hDPSCs的骨向分化。當(dāng)RANK被沉默后，hDPSCs礦化結(jié)節(jié)減少，染色變淺，OPG mRNA和蛋白表達(dá)增 加，RANK、RANKL、Runx2、OCN、ALP、BMP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，提示RANK-siRNA可逆轉(zhuǎn)抑制miR-143-3p誘導(dǎo)的hDPSCs的成骨分化。為了驗(yàn)證miR-143-3p對(duì)RANK的靶向調(diào)控作用，本研究通過(guò)TargetScan對(duì)miR-143-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和鑒定，結(jié)果顯示，RANK可能為miR-143-3p的靶基因，這一結(jié)果得到了雙熒光素酶報(bào)告的驗(yàn)證，miR-143-3p顯著降低了RANK-3′-UTR-WT的細(xì)胞中的熒光素酶活性，而在RANK-3′-UTR-MUT和RANK-3′-UTR-NC的細(xì)胞中，熒光素酶活性無(wú)顯著變化，提示miR-143-3p可能通過(guò)靶向RANK發(fā)揮其對(duì)hDPSCs的凋亡和成骨分化的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，miR-143-3p的下調(diào)可通過(guò)上調(diào)其靶基因RANK的表達(dá)激活OPG/RANKL軸，從而調(diào)節(jié)hDPSCs的凋亡和分化。本研究?jī)H在細(xì)胞水平進(jìn)行了初步研究，hDPSCs通過(guò)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，與hDPSCs在體內(nèi)環(huán)境的生物學(xué)活動(dòng)仍有一定差距，需要結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步探索。