別苗苗，唐 燚，康非吾

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，上海 200072）

低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是發(fā)育、生理及病理過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)因子[1]，作為有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白,其具有廣泛的靶基因譜，可通過(guò)不同的信號(hào)通路作用于已知的100多個(gè)靶基因[2]，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)等眾多過(guò)程。HIF-1α參與所有有核細(xì)胞響應(yīng)氧分壓水平的重要途徑，因此被稱為生理及病理過(guò)程中的“高度參與因子”[3]，在發(fā)育和穩(wěn)態(tài)所需的各種缺氧相關(guān)過(guò)程中發(fā)揮作用。

已有研究表明，低氧信號(hào)通路對(duì)骨骼發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要影響,低氧誘導(dǎo)因子在骨發(fā)育和骨重建中發(fā)揮重要作用[4-5]。HIF-1α信號(hào)通路對(duì)骨形成和骨吸收均有重要作用，該信號(hào)通路上調(diào)可影響成血管成骨功能，促進(jìn)骨形成和血管形成[6]；另一方面，其又可增加破骨細(xì)胞的數(shù)量及破骨活性[7-8]。同時(shí)，低氧條件下骨細(xì)胞內(nèi)HIF-1α信號(hào)通路通過(guò)經(jīng)典Wnt/β-catenin通路可間接通過(guò)調(diào)控成骨、成血管功能來(lái)調(diào)節(jié)骨改建過(guò)程，表明HIF-1α在骨相關(guān)細(xì)胞間的相互作用調(diào)節(jié)中有著重要作用[9]。

低氧環(huán)境亦是軟骨細(xì)胞成熟和縱向骨生長(zhǎng)的必要條件，HIF-1α已被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞存活和發(fā)揮功能的關(guān)鍵因子[10-11]。破骨細(xì)胞是骨改建過(guò)程中發(fā)揮骨吸收功能的唯一細(xì)胞。對(duì)于HIF-1α是否參與調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨下骨區(qū)內(nèi)破骨細(xì)胞的生物學(xué)行為，影響關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育，目前知之甚少。課題組前期研究[12]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α介導(dǎo)破骨細(xì)胞在小鼠髁突發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。然而，不同的長(zhǎng)骨內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的成骨方式及血供等均有較大差異，HIF-1α是否同樣影響不同長(zhǎng)骨來(lái)源的破骨細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的發(fā)育，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本文擬對(duì)此進(jìn)行對(duì)比研究，為關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨發(fā)育的理論基礎(chǔ)和相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)用鼠HIF-1αfl/fl和Ctsk-cre C57小鼠分別購(gòu)買于美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心及上海南方模式生物科技股份有限公司。對(duì)2種小鼠交配后的子代進(jìn)行基因型鑒定后，獲得破骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除HIF-1α的HIF-1αfl/fl；Ctsk+C57小鼠（cKO組），將其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。小鼠均飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，給予12 h光照和12 h無(wú)光飼養(yǎng)環(huán)境，室內(nèi)溫度保持在25℃，相對(duì)濕度為55%，給予自由飲水和飲食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)同濟(jì)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2018009）。

1.2 microCT及三維重建

取同窩對(duì)照組及cKO組每組各3只小鼠股骨用于micro-CT掃描。掃描所用設(shè)備為micro-CT機(jī)（Scanco Medical AG公司，瑞士）。將股骨長(zhǎng)軸平行于掃描管長(zhǎng)軸放入直徑48 mm的樣品管中進(jìn)行掃描，掃描參數(shù)為電壓70 kV、電流200μA、分辨率24.2μm。掃描完成后，采用設(shè)備配套軟件進(jìn)行三維重建。

1.3 組織學(xué)免疫熒光染色

將小鼠麻醉后灌流，股骨組織收樣，用4%多聚甲醛固定48 h后，用10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）脫鈣2個(gè)月，組織脫水后石蠟包埋，切成4μm切片。將石蠟切片放置在60℃恒溫箱中烘烤120 min，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，透明質(zhì)酸酶37℃抗原修復(fù)1 h，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3遍，山羊血清封閉1 h后，滴加一抗，4℃下過(guò)夜，PBS洗3遍，滴加熒光二抗IgG室溫孵育45 min，室溫下用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）孵育5 min，PBS充分沖洗，用抗熒光淬滅水溶性封片劑封片，于熒光顯微鏡（尼康公司，日本）下拍照。

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞內(nèi)HIF-1α敲除對(duì)小鼠股骨和下頜骨形態(tài)發(fā)育的影響

對(duì)10周齡的同窩鼠和cKO鼠的股骨和下頜骨進(jìn)行micro-CT掃描，結(jié)果表明cKO組的股骨、股骨頭和骺端等相較于同窩對(duì)照鼠，無(wú)形態(tài)和大小差異（圖1A、B）；cKO組的下頜骨髁突為中心凹陷的淺盤形較同窩對(duì)照組的半球形髁突，有形態(tài)和大小的差異（圖1C、D）。

圖1 同窩對(duì)照組、cKO組小鼠的股骨和下領(lǐng)骨形態(tài)對(duì)比Figure 1 Morphological comparison of femur and mandible between the control and cKO group

2.2 破骨細(xì)胞內(nèi)HIF-1α敲除對(duì)關(guān)節(jié)軟骨層和軟骨下骨層形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)對(duì)2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的股骨頭、股骨骺端、髁突軟骨和軟骨下骨進(jìn)行阿利新藍(lán)（alcian blue，AB）及甲苯胺藍(lán)（toluidine blue，TB）組織學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)cKO組小鼠股骨頭的肥大軟骨層變薄，細(xì)胞排列欠規(guī)則，軟骨下骨骨小梁數(shù)目減少、厚度增加，骨小梁交聯(lián)度降低（圖2A）；而股骨骺端無(wú)明顯差異（圖2B）；髁突形態(tài)發(fā)生明顯變化，髁突關(guān)節(jié)面失去原有凸形結(jié)構(gòu)，呈水平凹形，前后徑及近遠(yuǎn)中徑增大，髁突寬度、長(zhǎng)度明顯縮短，軟骨層結(jié)構(gòu)紊亂明顯，纖維軟骨層明顯變厚，軟骨下骨層骨小梁數(shù)目減少（圖2C）。

圖2 同窩對(duì)照組、cKO組小鼠關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨層形態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)比Figure 2 Comparison of morphological structure of articular cartilage and subchondral bone layer between the control and cKO group

2.3 HIF-1α促進(jìn)小鼠發(fā)育過(guò)程中股骨及下頜骨軟骨下骨區(qū)破骨細(xì)胞形成和破骨活性

在5周齡和8周齡2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)同窩鼠和cKO組小鼠的股骨和下頜骨進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，發(fā)現(xiàn)5周齡cKO組股骨頭和骺端軟骨下骨區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)量和大小稍小于同窩對(duì)照組，且出生后8周時(shí)，破骨細(xì)胞數(shù)量和大小的減少，更為明顯（圖3A、B）；cKO組髁突軟骨下骨區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)量和大小，在不同時(shí)間點(diǎn)均低于同窩對(duì)照組（圖3C）。

通過(guò)組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）定位軟骨下骨區(qū)的多核破骨細(xì)胞，并對(duì)HIF-1α表達(dá)進(jìn)行共定位檢測(cè)，相較cKO組，在對(duì)照組股骨頭軟骨下骨區(qū)可見(jiàn)更多HIF-1α標(biāo)記的破骨細(xì)胞（圖3D）;同時(shí)相較cKO組，對(duì)照組內(nèi)亦可見(jiàn)更多基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）陽(yáng)性的破骨細(xì)胞（圖3E）。

圖3 同窩對(duì)照組、cKO組小鼠股骨和下領(lǐng)骨軟骨下骨區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)量和破骨活性對(duì)比Figure 3 Comparison of number and activity of osteoclasts in subchondral layers of femur and mandible between the control and cKO group

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨是一種無(wú)血管、無(wú)神經(jīng)、無(wú)淋巴的結(jié)締組織，通過(guò)滑膜液和軟骨下骨的擴(kuò)散獲得營(yíng)養(yǎng)和氧供。因此，關(guān)節(jié)軟骨在整個(gè)生命周期中都維持在低氧環(huán)境中，從關(guān)節(jié)軟骨表面到深層存在約1%～6%的氧濃度梯度[13]；同時(shí)，處于血運(yùn)末端的軟骨下骨區(qū)內(nèi)的骨相關(guān)細(xì)胞亦處于相對(duì)低氧的環(huán)境中。已有研究[13]表明，低氧對(duì)于軟骨細(xì)胞存活及功能和關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育具有重要意義。同時(shí)，低氧在軟骨相關(guān)疾病中亦有較多報(bào)道，股骨頭壞死是血液供應(yīng)破壞所導(dǎo)致的股骨頭低氧性損傷，有研究[14]表明HIF-1α可能參與了低氧引起的股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制。然而軟骨下骨區(qū)的低氧環(huán)境對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的影響尚待闡明。破骨細(xì)胞作為骨改建活動(dòng)中唯一的骨吸收功能細(xì)胞，在髁突和股骨頭等關(guān)節(jié)發(fā)育過(guò)程中，負(fù)責(zé)軟骨基質(zhì)的清除和調(diào)控成骨相關(guān)細(xì)胞成骨。以往研究[15-16]及課題組前期研究[17]均表明，HIF-1α應(yīng)答低氧刺激可調(diào)控破骨細(xì)胞分化和活性，同時(shí)HIF-1α介導(dǎo)破骨細(xì)胞在髁突軟骨發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，髁突軟骨和長(zhǎng)骨關(guān)節(jié)軟骨的來(lái)源、發(fā)育方式和血供等均有不同[18-21]。因此，本文就HIF-1α是否在長(zhǎng)骨的股骨頭及骺端發(fā)育中同樣發(fā)揮重要作用進(jìn)行了探究，結(jié)果表明，在破骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除HIF-1α后，小鼠股骨頭軟骨下骨區(qū)骨小梁數(shù)量減少、厚度增加、交聯(lián)度降低；肥大軟骨層變薄，細(xì)胞排列欠規(guī)則；但骺端軟骨和軟骨下骨層沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響。上述結(jié)果提示，在長(zhǎng)骨股骨頭發(fā)育過(guò)程中，低氧亦可通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞生物學(xué)行為來(lái)參與軟骨和軟骨下骨的改建，但在改建過(guò)程中低氧對(duì)軟骨下骨區(qū)破骨細(xì)胞的調(diào)控作用效果遠(yuǎn)不如髁突軟骨下骨區(qū)明顯，其原因需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究。

本實(shí)驗(yàn)組織學(xué)層面所觀察的時(shí)間點(diǎn)僅有5周和8周2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，股骨頭和髁突形態(tài)結(jié)構(gòu)在8周齡時(shí)的差異較5周齡更為明顯，但對(duì)HIF-1α介導(dǎo)破骨細(xì)胞調(diào)控軟骨和軟骨下骨發(fā)育的探究，需要增加更多時(shí)間點(diǎn)的觀察。在2個(gè)組別的長(zhǎng)骨軟骨層厚度和軟骨下區(qū)骨小梁改建中，長(zhǎng)骨股骨頭較骺端差異明顯，可能與骺端關(guān)節(jié)軟骨下骨區(qū)血運(yùn)更為豐富有關(guān)。

本研究通過(guò)組織學(xué)染色證實(shí)，HIF-1α可響應(yīng)低氧環(huán)境調(diào)控破骨細(xì)胞的形成、大小及數(shù)量。染色結(jié)果表明，破骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除HIF-1α的模式鼠軟骨下骨區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)量和破骨活性降低，且出生后8周的差異較出生后5周時(shí)更為明顯；肥大軟骨層厚度差異也更為明顯，軟骨下骨區(qū)骨小梁內(nèi)可見(jiàn)更多未改建的殘留軟骨。同時(shí)，MMP9的組織學(xué)免疫熒光染色表明，HIF-1α可能通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞分泌MMP9等功能性產(chǎn)物，影響破骨活性。

綜上所述，在長(zhǎng)骨和頜骨的關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨發(fā)育過(guò)程中，HIF-1α可能介導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成和破骨活性影響骨改建，或通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間作用影響骨改建，其具體細(xì)胞和分子機(jī)制及對(duì)股骨和下頜骨發(fā)育調(diào)控效果存在差異的原因有待進(jìn)一步探究。