范嬌，謝學(xué)輝，秦艷，陳小光，方英榮，楊珊珊，趙江貴，莫浩楠，鄭航蜜，劉娜，張慶云，宋新山

（1 東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，國家環(huán)境保護(hù)紡織工業(yè)污染防治工程技術(shù)中心,中國紡織工業(yè)聯(lián)合會紡織行業(yè)污染治理與減排技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620；2 上海污染控制與生態(tài)安全研究院，上海 200092；3 宿州學(xué)院環(huán)境與測繪工程學(xué)院，安徽宿州 234000；4 安徽工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000）

隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展，人們生活水平的提高，染料廣泛應(yīng)用于紡織工業(yè)中，由于染料極易溶于水，在紡織印染過程中，有10%～30%的染料殘留在工業(yè)廢水中，這些染料及其中間體對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成了嚴(yán)重破壞。染料根據(jù)其結(jié)構(gòu)可以劃分為偶氮類染料、蒽醌類染料以及三苯甲烷類染料，其中偶氮類染料依據(jù)其偶氮鍵的個數(shù)可分為單偶氮類染料、雙偶氮類染料和三偶氮類染料。偶氮類染料是含有偶氮鍵數(shù)目最多的一類染料，因其數(shù)量大、色彩種類豐富、易染色、穩(wěn)定等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于紡織行業(yè)。蒽醌類染料是僅次于偶氮類染料的第二大合成類染料，由于其包含蒽醌發(fā)色團(tuán)體，故而使得其比偶氮類染料更難降解。三苯甲烷類染料廣泛應(yīng)用于紡織印染工業(yè)和海鮮產(chǎn)品的防腐工業(yè)中，由于其穩(wěn)定的苯環(huán)結(jié)構(gòu)而在廢水中長期穩(wěn)定存在，生物脫色率普遍較低。

微生物在其他可利用碳源存在的條件下能夠分解不能作為其生長基質(zhì)物質(zhì)的過程稱為共代謝。微生物的共代謝作用廣泛地應(yīng)用于印染廢水處理過程中，向微生物系統(tǒng)中施加一定的共基質(zhì)成分（尤其是碳源和氮源）可以增強(qiáng)微生物處理能力。例如，F(xiàn)ernando 等在研究微生物燃料電池中的酸性橙7 與14063 菌共代謝的脫色動力學(xué)時，發(fā)現(xiàn)共基質(zhì)使用組（如菜籽餅、玉米漿和糖蜜）會獲得更高的動力學(xué)常數(shù)，這表明共基質(zhì)成分在微生物的共代謝中發(fā)揮著十分重要的作用。同時微生物在脫色降解染料的過程中，共代謝基質(zhì)的種類和不同結(jié)構(gòu)的染料都會引起染料脫色降解效能的差異。目前，微生物利用不同共基質(zhì)去共代謝降解同一種染料以尋求最佳共基質(zhì)的研究較多，如Chen 等從印染廢水的污泥中分離到一株對活性黑5 具有良好脫色效能的菌株GY-1，使用該菌株在葡萄糖、淀粉、蔗糖、半乳糖等共基質(zhì)條件下脫色活性黑5，發(fā)現(xiàn)葡萄糖共基質(zhì)的脫色效果最佳。Saba 等使用生物反應(yīng)器處理偶氮類染料廢水，不同共基質(zhì)的組合中尤以酵母提取物的添加能夠有效地提高印染廢水的處理效率。然而，微生物在相同共基質(zhì)條件下共代謝降解多種不同結(jié)構(gòu)染料方面的比較性研究卻較少。并且染料種類繁多，結(jié)構(gòu)差異巨大，不同的結(jié)構(gòu)也決定了染料本身生物降解的難易程度。因此，深入探究微生物共代謝降解染料過程中染料結(jié)構(gòu)所引起的差異效應(yīng)，對于處理同時含有多種不同結(jié)構(gòu)染料的復(fù)雜廢水具有重要的指導(dǎo)意義。

微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)以及優(yōu)勢菌種在染料降解過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時不同的染料條件下優(yōu)勢菌群的富集作用不同。Xie 等研究不同染料條件下水解酸化反應(yīng)器中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌屬（）在水解酸化條件下是降解染料活性黑5的優(yōu)勢菌屬，而在染料活性艷藍(lán)樣品以普雷沃氏菌（sp.）是最主要的菌屬，這說明在不同結(jié)構(gòu)的染料中群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌屬不同，脫色性能也會有相應(yīng)的差異。因此研究微生物在相同共基質(zhì)條件下降解多種不同結(jié)構(gòu)染料的菌落組成和動態(tài)變化具有十分重要的意義。

在本研究中，首先測定了功能菌群DDMZ1 在YE共基質(zhì)條件下對五類不同結(jié)構(gòu)共12種染料的脫色率，然后從中選出5種典型的不同結(jié)構(gòu)染料（單偶氮染料酸性橙7、雙偶氮染料活性黑5、三偶氮染料氯唑黑E、蒽醌染料活性艷藍(lán)KN-R、三苯甲烷染料孔雀石綠）作為目標(biāo)染料，進(jìn)一步研究YE共基質(zhì)條件下功能菌群DDMZ1 脫色降解不同結(jié)構(gòu)染料的效能差異機(jī)制。其次LC-TOF-MS 技術(shù)進(jìn)一步鑒定了5 種典型的不同結(jié)構(gòu)染料在YE 共基質(zhì)體系中的降解產(chǎn)物，推導(dǎo)了各自的降解途徑，最后采用Illumina Miseq高通量測序評估了YE共基質(zhì)條件下5種典型的不同結(jié)構(gòu)染料引起的微生物群落結(jié)構(gòu)差異以及優(yōu)勢功能菌屬的富集情況，進(jìn)而揭示了YE 共基質(zhì)條件下染料結(jié)構(gòu)、群落結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢菌屬與染料脫色性能之間的相互作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 染料

實(shí)驗(yàn)所用的單偶氮染料有酸性橙7 （Acid Orange 7，AO7）、α-萘酸橙（α-naphthyl orange，α-NO）； 雙偶氮染料有活性黑5（Reactive Black 5，RB5）、酸性紅112（Acid Red 112，AR112）、酸性黑1（Acid Black 1，AB1）、臺盼藍(lán)（Typan Blue，TB）；三偶氮染料有氯唑黑E （Chorazol Black E， CBE）、 直接藍(lán)71 （Direct Blue 71，DB71）；蒽醌染料有活性艷藍(lán)KN-R （Remozal Brilliant Blue KN-R，RBBR）和活性藍(lán)4（Reactive Blue 4，RB4）；三苯甲烷染料有孔雀石綠（Malachite Green，MG）和結(jié)晶紫（Crystal Violet，CV），均購于SIGMA-ALORICH公司。12種不同結(jié)構(gòu)的染料的化學(xué)式、結(jié)構(gòu)式、分子量、最大吸收波長、染料結(jié)構(gòu)類型信息見表1。

表1 十二種不同結(jié)構(gòu)的染料化學(xué)式、結(jié)構(gòu)式、相對分子質(zhì)量、最大吸收波長和結(jié)構(gòu)類型

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基及菌源

氯化銨、無水硫酸鈉和磷酸二氫鉀，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母提取物，生工生物工程（上海）股份有限公司。

無機(jī)物培養(yǎng)基（mineralnutirents，MN）：氯化銨0.20g/L，硫酸鈉0.50g/L，磷酸二氫鉀2.66g/L；酵母提取物共基質(zhì)培養(yǎng)基（yeast extract，YE）：氯化銨0.20g/L，無水硫酸鈉0.50g/L，磷酸二氫鉀2.66g/L，酵母提取物3.00g/L，所有培養(yǎng)基均需要在高壓滅菌鍋內(nèi)115℃，滅菌30min冷卻后備用。

功能菌群DDMZ1 篩選于運(yùn)行良好的印染廢水水解酸化反應(yīng)器，具體篩選馴化過程為：從反應(yīng)器中取10mL 新鮮污泥加入到250mL 錐形瓶中（含有90mL YE 共基質(zhì)培養(yǎng)基），于37℃下恒溫靜置培養(yǎng)24h；然后以10%（體積比）的接種量轉(zhuǎn)入YE共基質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)立初始染料（RB5）濃度為50mg/L，37℃恒溫靜置培養(yǎng)24h 后測定脫色率；待脫色率達(dá)到80%以后，逐步提高染料濃度（50～300mg/L），繼續(xù)傳代馴化，最終獲得對雙偶氮染料RB5具有良好脫色性能的混合菌群DDMZ1。

續(xù)表1

1.3 主要儀器設(shè)備

微量紫外可見分光光度計(jì)（德國Implen GmbH，儀器型號IMPLEN）；離心機(jī)（美國Thermo，儀器型號Thermo Legend Micro 17）；壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊，儀器型號YXQ-LS-30SⅡ型）；電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司，儀器型號FA1104）；液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司，儀器型號Agilent QTOF6520）。

1.4 功能菌群DDMZ1的脫色實(shí)驗(yàn)

按10%的接種量將混合菌群DDMZ1 接種于100mL 錐形瓶中（即10mL 菌液加入到90mL 的MN培養(yǎng)基和YE 共基質(zhì)培養(yǎng)基中，然后分別添加相同濃度的AO7、α-NO、RB5、AR112、AB1、TB、CBE、DB71、RBBR、RB4、MG 和CV 染料使其終濃度為100mg/L，最后在恒溫培養(yǎng)箱中（37℃）靜置培養(yǎng)并測定6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h脫色液的脫色率，每類培養(yǎng)基的每種染料條件做3組平行試驗(yàn)。

1.5 脫色率的測定

由于12 種不同結(jié)構(gòu)的染料都有明顯的特征波長，因此根據(jù)特征波長處特征峰的變化計(jì)算脫色率。脫色率測定時，以YE 共基質(zhì)培養(yǎng)基作為空白，取反應(yīng)時刻的染料溶液，經(jīng)8000r/min 離心10min后取出上清液，置于紫外可見分光光度計(jì)中測定特征波長處的特征峰值。脫色率計(jì)算如式(1)。

式中，為反應(yīng)0 時刻燃料溶液的特征峰值；A為反應(yīng)時刻染料溶液的特征峰值。

1.6 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析

為了深度解析功能菌群DDMZ1 的染料降解產(chǎn)物，從12 種不同結(jié)構(gòu)的染料中，進(jìn)一步選取脫色效果好的5種典型的不同結(jié)構(gòu)染料，分別是單偶氮染料AO7、雙偶氮染料RB5、三偶氮染料CBE、蒽醌染料RBBR 和三苯甲烷類的MG，取48h降解液，作為接下來實(shí)驗(yàn)的研究對象，使用LC-TOF-MS（Agilent QTOF6520，USA）進(jìn)一步研究。

1.7 群落結(jié)構(gòu)分析

配制MN 培養(yǎng)基和YE 共基質(zhì)培養(yǎng)基作為共代謝基質(zhì)，以相同濃度的AO7、RB5、CBE、RBBR、MG染料為各自目標(biāo)污染物，進(jìn)行傳代馴化。同時根據(jù)前期脫色實(shí)驗(yàn)可知，功能菌群DDMZ1 與染料反應(yīng)48h后即可以達(dá)到反應(yīng)平衡狀態(tài)（脫色效率達(dá)到80%以上），因此以2 天為一傳代周期，連續(xù)馴化兩個月，取最后一代樣品監(jiān)測染料的脫色情況，同時收集初始菌群菌體以及YE 共代謝基質(zhì)下最后一個傳代周期5種典型的不同結(jié)構(gòu)染料樣品的剩余菌體，保存，然后交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測序，深度解析群落結(jié)構(gòu)。本次測序得到的原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫，序列登錄號為SRP347372。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色實(shí)驗(yàn)分析

12 種不同結(jié)構(gòu)且初始濃度為100mg/L 染料在MN 培養(yǎng)基和YE 共基質(zhì)培養(yǎng)基中于37℃下恒溫培養(yǎng)72h，設(shè)立對照，脫色效果見圖1。

從圖1(a)中可以明顯看出，無機(jī)物組的樣品（MN）對多種染料的脫色效果都較差，脫色率均在20%以下，表明功能菌群DDMZ1 在沒有其他易降解有機(jī)物存在的條件下，不能有效地降解各種染料。 Sandhiya 等在研究金黃色葡萄球菌（）對三苯甲烷類染料堿性紫3和堿性綠4的脫色影響時發(fā)現(xiàn)，在僅有染料存在的情況下（無其他易降解有機(jī)物），無法對染料堿性紫3和堿性綠4實(shí)現(xiàn)脫色，這與本研究中功能菌群DDMZ1在MN培養(yǎng)基條件下無法有效降解各種染料的研究現(xiàn)象相類似。而在YE培養(yǎng)基條件下，功能菌群DDMZ1 對多種不同結(jié)構(gòu)的染料均表現(xiàn)出優(yōu)異的脫色效果[圖1(b)]。如偶氮類染料反應(yīng)48h后均可以達(dá)到80%以上的脫色率，特別是α-NO、AR112、DB71 的脫色率分別達(dá)到了92.4%、92.2%、99.3%；對三苯甲烷類染料而言，脫色效率均有提升，尤其是MG的脫色率發(fā)生了質(zhì)的飛躍，由幾乎不脫色提升到了98.3%；對蒽醌染料RBBR 和RB4 而言，脫色率也均提升了20%左右。張慶云等研究了果糖、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、碳酸鈉等不同共代謝基質(zhì)對染料RB5脫色效果的影響，發(fā)現(xiàn)果糖對脫色具有顯著的促進(jìn)作用，蔗糖和葡萄糖對脫色具有一定的抑制作用。Merino等在研究白腐真菌、花色曲霉菌及其菌群對二元有色染料（亮藍(lán)和亮紅）的生物脫色處理中發(fā)現(xiàn)，YE作用下微生物的多樣性呈現(xiàn)最大化，歸因于YE中包含的蛋白質(zhì)水解物和水溶性維生素在促進(jìn)微生物發(fā)展的同時提升了脫色率。有研究表明偶氮鍵的還原斷裂是染料降解的第一步，NADH 是還原染料偶氮鍵的電子供體，并且YE 的代謝對NADH 的恢復(fù)至關(guān)重要。因此有機(jī)氮源YE是促進(jìn)功能菌群DDMZ1生長代謝的重要營養(yǎng)物質(zhì)，對于提升多種不同結(jié)構(gòu)的染料的脫色效果具有顯著作用。

圖1 兩種培養(yǎng)基條件下功能菌群DDMZ1對12種不同結(jié)構(gòu)的染料（100mg/L）的脫色情況

2.2 LC-MS分析

為了深度分析5種典型的不同結(jié)構(gòu)染料的代謝產(chǎn)物，使用LC-TOF-MS 技術(shù)鑒定降解產(chǎn)物，然后根據(jù)相對分子質(zhì)量推測出降解產(chǎn)物最可能的結(jié)構(gòu)見表2，隨后根據(jù)表2 中的降解產(chǎn)物推導(dǎo)5 種典型的不同結(jié)構(gòu)染料可能的降解路徑，結(jié)果見圖2。

表2 五種典型的不同結(jié)構(gòu)染料在YE培養(yǎng)基中微生物降解產(chǎn)物的LC-TOF-MS物質(zhì)鑒定結(jié)果

續(xù)表2

如圖2(a)所示，AO7分子中的偶氮鍵對稱斷裂成兩個部分，分別是4-氨基苯磺酸和1-氨基2-萘酚。其中4-氨基苯磺酸通過自氧化作用生成4-氨基苯酚，Plum等在對RB5厭氧降解中間體的檢測中也發(fā)現(xiàn)了4-氨基苯酚。然后4-氨基苯酚通過開環(huán)作用裂解成最終產(chǎn)物(E)-6-氨基-6-氧代己-3-烯酸。此外，斷裂的另外一部分1-氨基2-萘酚經(jīng)過羥基化反應(yīng)生成1,2-二羥基萘，然后再被氧化為1,2-萘醌，隨后通過開環(huán)作用生成(Z)-2-(2-羧基乙烯基)-6-羥基苯甲酸，(Z)-2-(2-羧基乙烯基)-6-羥基苯甲酸通過苯酚中間體開環(huán)裂解成最終的降解產(chǎn)物(E)-6-氧代己基-3-烯酸。Eslami等采用聲光活化法使用過氧化氫降解AO7，發(fā)現(xiàn)AO7 的降解先是由氫氧自由基攻擊偶氮鍵開始，然后裂解成兩個中間體，分別是磺胺酸和1-氨基-2-萘酚，然后1-氨基-2-萘酚通過羥基化作用生成1,2-二羥基萘，1,2-二羥基萘再通過與超氧陰離子的氧化反應(yīng)生成1,2-萘醌，與本研究降解路徑推導(dǎo)一致。

RB5分子經(jīng)過對稱的偶氮鍵還原裂解和脫磺酸作用形成三種中間體，即甲基2-[(4-氨基苯基)磺?；鵠乙烷-1-磺酸鹽中間體、3,4,6-三氨基-5-羥基萘-2,7-二磺酸中間體和2,7,8-三氨基苯酚中間體，如圖2(b)。Shah 等在研究RB5 的光催化還原過程中，發(fā)現(xiàn)脫色后RB5的降解終產(chǎn)物包括2-[(4-氨基苯基)磺基]乙基硫酸氫和3,4,6-三氨基-5-羥基萘-2,7-二磺酸，并且偶氮鍵的裂解是脫色的主要機(jī)理。首先3,4,6-三氨基-5-羥基萘-2,7-二磺酸中間體通過脫磺酸、脫氨基作用，依次生成3，5-二氨基-4-羥基萘-2-磺酸鹽和3,4,5-三羥基萘-2-磺酸酯，最后被氧化成最終的降解產(chǎn)物5-羥基-3-亞甲基-4-氧代-3,4,4A，8A-四氫萘-2-磺酸酯。另外一個中間體2,7,8-三氨基苯酚通過脫氨基作用生成了最終的降解產(chǎn)物8-甲基萘烷-1-胺。最后一個中間體甲基2-[(4-氨基苯基)磺酰基]乙烷-1-磺酸鹽通過自氧化和脫羥基作用依次生成了2-(4-氨基苯磺?；?乙醇（p-Base）和4-(乙烯基磺?；?苯胺(vinyl-p-Base)，vinyl-p-Base 再經(jīng)過甲基化和脫磺酸的作用生成p-甲苯胺，最后通過開環(huán)作用生成終產(chǎn)物6-甲基庚-6-烯酰胺。Méndez-Martínez 等從電化學(xué)還原和氧化途徑對RB5 染料分子的降解副產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測和鑒定，發(fā)現(xiàn)降解路徑中也有p-Base 中間體的產(chǎn)生。p-Base 通過脫羥基和脫氫作用生成vinyl-p-Base，Plum 等在RB5 的厭氧和好氧生物降解過程中也檢測到了vinyl-p-Base 的存在。Zhang等研究RB5在YE復(fù)合多種糖源條件下的降解路徑時，發(fā)現(xiàn)多種糖源條件下均有終產(chǎn)物6-甲基庚-6-烯酰胺的產(chǎn)生。

圖2 5種典型的不同結(jié)構(gòu)染料在酵母提取共基質(zhì)培養(yǎng)基中的降解路徑

圖2 5種典型的不同結(jié)構(gòu)染料在酵母提取共基質(zhì)培養(yǎng)基中的降解路徑（續(xù)）

如圖2(c)所示，CBE 分子中的偶氮鍵對稱還原裂解成三種物質(zhì)，分別為4-氨基-5-羥基萘-2,7-二磺酸、聯(lián)苯胺、苯-1,2,4-三胺。首先4-氨基-5-羥基萘-2,7-二磺酸通過脫羥基作用生成4-羥基萘-2,7-二磺酸，隨后通過脫磺酸作用生成終產(chǎn)物甲萘胺。其次聯(lián)苯胺通過單鍵的斷裂和自氧化作用生成4-氨基苯酚，然后通過開環(huán)作用生成最終的降解產(chǎn)物6-氨基-6-氧己酸。Wang等在紡織染料廢水的處理過程中發(fā)現(xiàn)，偶氮染料中的芳香胺是厭氧還原的產(chǎn)物，并且好氧條件的施加可以使4-氨基苯酚等芳香胺通過礦化作用生成6-氨基-6-氧己酸。最后苯-1,2,4-三胺通過脫氨基作用形成p-甲苯胺中間體，然后通過開環(huán)作用生成最終降解產(chǎn)物6-甲基庚-6-烯酰胺。

RBBR 分子通過碳?xì)鋯捂I的斷裂生成兩個部分，分別是1，4-二氨基-9,10-二氧-4a，9，9a，10-四氫蒽-2-磺酸中間體和2-[(4-氨基苯基)磺?；鵠乙烷-1-磺酸[圖2(d)]。首先斷裂的第一部分1，4-二氨基-9,10-二氧-4a，9，9a，10-四氫蒽-2-磺酸中間體通過酮環(huán)的開環(huán)和脫磺酸作用生成2,5-二氨基苯酚，隨后2,5-二氨基苯酚通過脫羥基和甲基化作用生成最終降解產(chǎn)物6-甲基庚-6-烯酰胺。斷裂的另外一部分2-[(4-氨基苯基)磺?；鵠乙烷-1-磺酸通過脫磺酸作用生成3-氨基苯磺酸，再通過開環(huán)作用和脫磺酸作用生成最終的降解產(chǎn)物6-氨基-6-氧己酸。Zhuo等在推導(dǎo)RBBR的降解路徑中發(fā)現(xiàn)，RBBR分子通過碳?xì)鋯捂I的斷裂，可能先斷裂成1-氨基-9,10-二氧-4a,9,9a,10-四氫蒽-2-磺酸，然后再通過羥基化作用生成1-氨基-4-羥基-9,10-二氧-4a,9,9a,10-四氫蒽-2-磺酸。

如圖2(e)所示，MG 分子通過碳氮雙鍵的斷裂和去甲基化作用生成了兩個部分，分別是-氯-，4-二甲基苯胺中間體和，-二甲基-[1，1'-聯(lián)苯]-4-胺。一方面，-氯-，4-二甲基苯胺中間體通過自氧化作用生成4-[氯(甲基)氨基]苯酚，隨后通過去甲基化作用生成4-氯酚，最后通過開環(huán)作用生成最終的降解產(chǎn)物(E)-6-氧代己基-3-烯酸。另外一方面，,-二甲基-[1，1'-聯(lián)苯]-4-胺通過苯環(huán)間單鍵的斷裂生成,-二甲基苯胺中間體，隨后通過脫甲基和自氧化作用生成終產(chǎn)物苯基羥胺。據(jù)報(bào)道，MG降解過程中的去甲基化作用不會破壞脫色基團(tuán)，而脫甲基產(chǎn)物的進(jìn)一步聚合和開環(huán)作用是導(dǎo)致MG脫色的重要原因。

通過對上述五個實(shí)驗(yàn)組中AO7、RB5、CBE、RBBR、MG 的降解產(chǎn)物和路徑分析可以發(fā)現(xiàn)，不同結(jié)構(gòu)的大分子染料在YE 共基質(zhì)條件下被功能菌群DDMZ1降解成分子量小且結(jié)構(gòu)簡單的代謝產(chǎn)物，并且大部分檢測出的降解產(chǎn)物是無色的，說明染料發(fā)色基團(tuán)基本上都被破壞，才實(shí)現(xiàn)了染料的降解脫色。到目前為止，這是首次系統(tǒng)全面地研究5種典型的不同結(jié)構(gòu)染料在YE 共代謝基質(zhì)下的降解路徑，以上結(jié)果可以加深對微生物共代謝降解難降解染料的認(rèn)識。

2.3 高通量測序

2.3.1 不同分類學(xué)水平的微生物多樣性

使用RDP 分類器將11 個樣品的序列劃分到不同的分類學(xué)水平，以此來得知各個樣品在各分類水平上的物種組成的比例情況，以此反映各個樣品在不同分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖3。

在微生物門分類水平上[圖3(a)]，樣品DDMZ1中，變形菌門（，81.01%）和厚壁菌門（，18.71%）占據(jù)絕對優(yōu)勢，而在MN培養(yǎng)基條件下，所有樣品MNAO7、MNRB5、MNCBE、MNRBBR 和MNMG 都是幾乎只有變形菌門（，占比均在99.96%以上）存在。添加YE 后，可以看到樣品YEAO7、YERB5、YECBE和YERBBR 的菌群結(jié)構(gòu)與樣品DDMZ1 中的菌群結(jié)構(gòu)類似，也是以變形菌門（，占比依次為96.32%、84.56%、86.01%、94.56%）和厚壁菌門（,占比分別為3.64%、15.15%、13.85%、5.39%）為主，除了樣品YEMG 例外，它一直以變形菌門（，100%）存在。諸多研究表明在染料降解體系中變形菌門（）和厚壁菌門（）是常見菌門。祁燕云等研究了微生物修復(fù)石油污染土壤過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過生物強(qiáng)化的土壤中，變形菌門（）是主要的優(yōu)勢菌門（87.44%），其他菌門的相對豐度均較低。同時從多樣性數(shù)據(jù)可以看出，YE 組的樣品比MN組樣品具有更高的Shannon指數(shù)，說明YE的加入使得樣品中的微生物多樣性顯著增加。Guo等在研究城市污水處理廠厭氧消化污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，變形菌門（）是厭氧消化處理系統(tǒng)中的重要微生物。

圖3 不同分類學(xué)水平下的11個樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)

在微生物綱分類水平上[圖3(b)]，樣品DDMZ1主要由γ - 變形菌綱（，81.01%）組成，厚壁菌綱（，9.83%）和桿菌綱（，8.10%）次之，而在MN培養(yǎng)基條件下，所有樣品MNAO7、MNRB5、MNCBE、MNRBBR 和MNMG 幾乎都是由γ-變形菌綱（）組成（占比均達(dá)到99.96%以上）。添加YE 后，樣品YEAO7、YERB5、YECBE和YERBBR 中的菌群結(jié)構(gòu)與樣品DDMZ1 中的菌群結(jié) 構(gòu) 類 似 ， 也 是 由 γ - 變 形 菌 綱（，占比均在84.56%～96.32%）、桿菌綱（，占比均在3.36%～9.17%）和厚壁菌綱（,占比在0.06%～1.03%）組成，除了樣品YEMG 例外，它幾乎一直以γ-變形菌綱（，100%）存在。Dai 等研究了微生物燃料電池中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱（，48.1%）是陽極生物膜上的優(yōu)勢群落。

在微生物科分類水平上共檢測到16 類菌（其中幾個被包括在其他類別中），且這11個樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異[圖3(c)]。樣品DDMZ1 主要由腸球菌科（，41.59%）、 黃單胞菌科 （，30.58%）、鼠孢菌科（，9.83%）、產(chǎn)堿桿菌科（，6.06%） 和鏈球菌科（，3.89%） 等組成，菌科組成豐富，為降解多種污染物提供了可能。而在MN培養(yǎng)基條件下，樣品MNAO7、MNRB5、MNCBE 和MNRBBR 都是以伯克氏菌科（，占比分別為70.91%、75.74%、72.80%和29.10%）和腸球菌科（，占比依次為28.99%、24.25%、27.18%和70.89%）為主要優(yōu)勢菌科， 而在樣品MNMG 中伯克氏菌科（，99.92%）占據(jù)絕對優(yōu)勢地位。添加YE 后，可以看到樣品YEAO7、YERB5、YECBE和YERBBR 中的菌群結(jié)構(gòu)與樣品DDMZ1中的菌群結(jié)構(gòu)類似， 也是由黃單胞菌科（,占比均為26.75%～47.40%）、腸球菌科（, 占比均在23.58%～45.81%）和產(chǎn)堿桿菌科（，占比均在2.41%～11.15%）等多個菌科組成，而樣品YEMG由假單胞菌科（，92.79%）和腸球菌科（，7.21%）占據(jù)優(yōu)勢地位。Hussain 等從紡織工業(yè)廢水中分離出有效的染料降解菌株——假單胞菌株（sp.RA20），該菌株在YE 共代謝基質(zhì)下不僅可以脫色RB5、活性橙16、活性紅2 等多種染料，還對鋅、鎘等重金屬表現(xiàn)出中等耐受能力。

2.3.2 群落Heatmap圖

為進(jìn)一步深度解析群落結(jié)構(gòu)，在微生物屬分類水平上探討功能菌群DDMZ1 的群落結(jié)構(gòu)與5 種典型的不同結(jié)構(gòu)染料的脫色響應(yīng)情況，見圖4。

圖4 五種不同結(jié)構(gòu)的典型染料作用下11個樣品中屬的Heatmap圖

在微生物屬分類水平上，微生物群落組成差異很大?？v觀大體趨勢，MN培養(yǎng)基樣品聚集在一部分，YE培養(yǎng)基樣品和DDMZ1樣品聚集在另外一部分。樣品DDMZ1 由多種菌屬組成，主要包括志賀氏菌（-，32.33%）、寡氧單胞菌（， 30.58%） 、（9.83%）、克雷伯氏菌（，9.26%）、鮑特菌（，6.06%） 等。在MN 培養(yǎng)基條件下，樣品MNAO7、MNRB5、MNCBE 和MNRBBR都 是 由 伯 克 霍 爾 德 菌 （-，占比依次為70.91%、75.74%、72.80%、29.10%）和克雷伯氏菌（，占比分別為28.96%、24.23%、27.16%、70.86%）組成，而樣品MNMG 以伯克霍爾德菌（-，99.92%）為主要菌屬。據(jù)報(bào)道，革蘭氏陰性菌伯克霍爾德菌（-）具有染料降解的能力。添加YE后，樣品YEAO7、YERB5、YECBE和YERBBR的菌群結(jié)構(gòu)與樣品DDMZ1 聚集在一起，偶氮類染料樣品YEAO7、YERB5、YECBE 主要富集了志賀氏菌屬（-，占比依次為32.33%、38.41%、 33.96%） 、 寡 氧 單 胞 菌 屬（，占比依次為30.58%、26.75%、35.54%） 和假單胞菌屬（，2.79%、21.50%、6.43%），蒽醌類染料樣品YERBBR 中由寡氧單胞菌屬（，47.40%）、志賀氏菌屬（-，18.14%）和假單胞菌屬（，12.44%）占據(jù)優(yōu)勢統(tǒng)治地位，而三苯甲烷類染料樣品YEMG 以假單胞菌屬（， 92.79%） 和克雷伯氏菌屬（，7.20%）為主。由上可見，結(jié)構(gòu)類似的染料可能富集相似的優(yōu)勢功能菌屬，而結(jié)構(gòu)不同的染料則明顯富集不同的優(yōu)勢功能菌屬。Chaudhari等使用細(xì)菌好氧顆粒修復(fù)蒽醌類高有機(jī)負(fù)荷廢水時發(fā)現(xiàn)，假單胞菌（）在懸浮培養(yǎng)基中的豐度顯著增加并成為優(yōu)勢菌屬。Shang等從濕地植物堿蓬葉片中分離到一株內(nèi)生細(xì)菌，該菌在30℃和pH=7.0的條件下可在8h內(nèi)將100mg/L的MG完全去除，經(jīng)鑒定為克雷伯氏菌屬。

3 結(jié)論

本文深入探究了功能菌群DDMZ1 在相同共基質(zhì)條件下脫色降解多種不同結(jié)構(gòu)染料的效能差異情況及微觀生物學(xué)機(jī)制。首先根據(jù)功能菌群DDMZ1在YE共基質(zhì)條件下對12種不同結(jié)構(gòu)染料的脫色率進(jìn)一步篩選出5種典型的不同結(jié)構(gòu)染料作為研究目標(biāo)，然后采用LC-TOF-MS 方法首次系統(tǒng)全面地研究了這5 種典型的不同結(jié)構(gòu)染料在YE 培養(yǎng)基條件下的微生物降解產(chǎn)物，并推導(dǎo)了染料降解路徑。最后采用高通量測序技術(shù)研究了不同結(jié)構(gòu)染料條件下微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于MN培養(yǎng)基，共基質(zhì)YE 的添加能顯著增加各種不同結(jié)構(gòu)染料樣品中菌群群落結(jié)構(gòu)的多樣性，而在相同共基質(zhì)YE 條件下，不同結(jié)構(gòu)染料樣品中的優(yōu)勢功能菌屬明顯不同。以上結(jié)果說明易降解共基質(zhì)的加入會帶來微生物多樣性普適性的增加，而不同結(jié)構(gòu)的染料則會顯著影響不同優(yōu)勢功能菌屬的富集情況。研究結(jié)果對于采用功能微生物處理含多種染料的復(fù)雜廢水具有重要的理論指導(dǎo)意義。