王彩霞，盧 寒，周 宏，帥翰林，李玉潔

宮頸癌是全世界婦女癌癥死亡的第四大原因。盡管進(jìn)行了廣泛的宮頸癌篩查，全球?qū)m頸癌的發(fā)病率正在下降，但它仍然是婦女癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。因此，探索一個(gè)新的宮頸癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物對(duì)宮頸癌患者的個(gè)性化治療至關(guān)重要。

N6 -甲基腺苷(m6A)修飾作為真核細(xì)胞中mRNA最常見的修飾之一，在基因調(diào)控過程中，如mRNA的穩(wěn)定、剪接和翻譯等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。甲基化轉(zhuǎn)移酶3 (methyltransferase like 3, METTL3)作為主要的RNA腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶，參與了腫瘤的各種生物學(xué)過程。既往發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，METTL3在胃癌組織中明顯增加，并且METTL3的表達(dá)隨著腫瘤分期和分級(jí)的進(jìn)展而逐漸增加，可作為胃癌患者的一個(gè)不良預(yù)后因素。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中敲低METTL3后人胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到顯著的抑制。此外，Li等發(fā)現(xiàn)METTL3基因可以通過PI3K/AKT途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制肺癌的發(fā)展。Wang等發(fā)現(xiàn)，METTL3表達(dá)水平在乳腺癌組織上調(diào)，敲低METTL3可以降低mRNA甲基化水平，減少腫瘤細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤生長(zhǎng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)Bcl-2可作為 METTL3 的靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。這些結(jié)果表明，METTL3可能通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等在癌癥的進(jìn)展中起重要作用。然而，METTL3在鱗狀細(xì)胞宮頸癌中的表達(dá)情況尚未見報(bào)道，本研究旨在探討METTL3在早期鱗狀細(xì)胞宮頸癌中的表達(dá)及其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共納入2008年1-12月于武警廣東總隊(duì)醫(yī)院和暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的宮頸癌患者110例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理證實(shí)為FIGOⅠb1-Ⅱa(2018 FIGO分期)鱗狀細(xì)胞宮頸癌患者；(2)行廣泛性子宮切除術(shù)及雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)前有或無(wú)輔助治療，術(shù)后取得新鮮手術(shù)標(biāo)本及相鄰正常宮頸組織，癌旁正常組織為距腫瘤病灶5 cm以上的組織，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色證實(shí)； (3)既往無(wú)其他癌癥病史； (4)臨床資料及隨訪資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受姑息性手術(shù)； (2)手術(shù)中確認(rèn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或腹膜播散。所有患者均簽署知情同意書，本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 分析METTL3在宮頸癌標(biāo)本和相鄰非腫瘤宮頸組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，并根據(jù)METTL3的表達(dá)水平將患者分成METTL3高/低表達(dá)組。收集臨床病理資料，包括年齡、FIGO分期、腫瘤大小、淋巴血管間隙浸潤(rùn)、宮頸深部間質(zhì)浸潤(rùn)、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及隨訪時(shí)間和生存狀態(tài)，分析METTL3表達(dá)水平及其與臨床病理特征預(yù)后的關(guān)系。

1.2.1 主要試劑及儀器 鼠抗人METTL3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) ProteintechGroup公司，免疫組化檢測(cè)試劑盒及PBS緩沖液購(gòu)自武漢Servicebio生物科技有限公司，DAB試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。免疫組織化學(xué)染色方法染色步驟嚴(yán)格按 SP試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 METTL3免疫組化檢測(cè)與評(píng)定 所有石蠟包埋切片均切成厚度為 4～6 μm，在65 ℃烘箱中加熱30 min后放入二甲苯中脫蠟；而后在3%的HO中進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫，用免疫組化專用封閉液將切片封閉30 min；接著將切片用鼠抗人METTL3 單克隆抗體孵育4 ℃過夜。在孵二抗前將切片從冰箱拿出回溫30 min，接著切片用二抗室溫孵育30 min，PBS洗5 min，二氨基聯(lián)苯染色5 min。染色結(jié)果按兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：(1)腫瘤細(xì)胞染色陽(yáng)性比例，分為0(無(wú))、1(1%～10%)、2(11%～50%)、3(51%～75%)、4 (76%～100%)；(2)陽(yáng)性細(xì)胞平均強(qiáng)度，分為0(無(wú))、1(弱)、2(中等)、3(強(qiáng))。將比例分?jǐn)?shù)和強(qiáng)度分?jǐn)?shù)相乘，得到復(fù)合總分(范圍0～12)。根據(jù)總分的平均數(shù)數(shù)值，將METTL3的表達(dá)水平分為高、低兩組，高于平均值的為METTL3高表達(dá)組。

1.2.3 治療方案 34例(30.3%)術(shù)前接受2～3個(gè)周期的化療。化療方案為紫杉醇175 mg/m，順鉑60 mg/m；每3周重復(fù)1次。術(shù)后對(duì)有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、切緣陽(yáng)性、癌旁浸潤(rùn)等危險(xiǎn)因素的病例同時(shí)加放化療?；煼桨笧轫樸K40 mg/m，每周第1天，共4～5個(gè)周期?？倓┝繛?0 Gy，每日2.0 Gy，每周5次。

1.2.4 隨訪方法 總生存期 (OS) 定義為從治療到因任何原因死亡的時(shí)間?？傠S訪時(shí)間定義為從手術(shù)日期到最后一次就診的時(shí)間(以月為單位)，隨訪截至2020-06-30。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 在110例鱗狀細(xì)胞宮頸癌患者中，52例為Ib1期，20例為Ib2期，38例為IIa期。平均年齡(45.3±10.1)歲，腫瘤平均(2.8±1.4)cm，存活患者的隨訪時(shí)間平均(58.6±7.9)月。

2.2 METTL3在鱗狀細(xì)胞宮頸癌組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，鱗狀細(xì)胞宮頸癌患者腫瘤樣本METTL3 的表達(dá)水平(2.705±0.273)低于癌旁正常組織(8.574±0.421)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01，圖1)。

2.3 鱗狀細(xì)胞宮頸癌中METTL3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 METTL3的低表達(dá)與較高的FIGO分期(=0.041)和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(=0.001)有關(guān)。METTL3的表達(dá)與其他臨床病理特征之間不存在相關(guān)性(表1)。

2.4 METTL3 表達(dá)水平與鱗狀細(xì)胞宮頸癌預(yù)后的關(guān)系 與METTL3 表達(dá)水平較高的患者相比，METTL3 表達(dá)水平較低的患者的總生存期 (OS)明顯短(=3.576，95%CI：1.474～8.677，=0.0048)(圖2)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型單變量生存分析顯示，F(xiàn)IGO 分期(=5.526，95% CI: 1.315～21.791，<0.001)、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(=3.315, 95% CI: 1.115～9.189,=0.04) 和 METTL3 表達(dá)水平(=13.5，95% CI: 2.321～31.105，=0.001) 是早期宮頸癌患者OS的預(yù)測(cè)因子。多變量生存分析也顯示了類似的結(jié)果，METTL3低表達(dá)(=6.187，95% CI: 2.314～21.292，=0.004)、FIGO分期(=5.109，95% CI: 1.891～11.135，<0.01)和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(=2.395, 95% CI: 1.156～4.879,=0.017)是早期鱗狀細(xì)胞宮頸癌患者OS的獨(dú)立影響因素(表2)。

3 討 論

作為一種高度動(dòng)態(tài)的mRNA修飾，m6A甲基化是由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和結(jié)合蛋白三者共同催化的，m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶之間的相互作用在RNA剪接、蛋白質(zhì)翻譯等生物過程中起著關(guān)鍵作用。然而，m6A修飾在人類疾病，特別是癌癥中的作用和臨床意義才剛剛開始被探索。作為一種主要的m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶，METTL3以獨(dú)立于m6A或者m6A依賴的方式發(fā)揮作用。過表達(dá)的METTL3定位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，不依賴于其甲基化轉(zhuǎn)移酶活性的情況下增強(qiáng)癌基因翻譯。失調(diào)的METTL3也可通過m6A修飾影響下游靶基因，促進(jìn)癌癥進(jìn)展。例如，METTL3可以通過增加miR221表達(dá)和促進(jìn)AFF4/ MYC信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的成熟來(lái)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖。在白血病中，人類髓系白血病細(xì)胞系中的METTL3缺失可以誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，并延緩白血病進(jìn)展。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)METTL3可以在宮頸癌的進(jìn)展中發(fā)揮抑癌作用，它在宮頸腫瘤組織中下調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，METTL3在早期鱗狀細(xì)胞宮頸癌中低表達(dá)，該蛋白表達(dá)的下降與較高的FIGO分期和較多的盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(<0.05)。根據(jù)METTL3的表達(dá)水平是否超過平均水平，將患者分為METTL3的高表達(dá)和低表達(dá)組。與METTL3 高表達(dá)組相比，METTL3低表達(dá)組患者的總生存期(OS)明顯縮短。多變量Cox分析表明FIGO分期和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是早期鱗狀細(xì)胞宮頸癌預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素(<0.05)，同時(shí)，METTL3的低表達(dá)也是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素(<0.05)。

我們推測(cè)METTL3參與的機(jī)制與其他癌癥類型相似，Wu等揭示METTL3能增強(qiáng)致癌基因的翻譯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。Chen等報(bào)道，METTL3在人類肝細(xì)胞癌中明顯上調(diào)，且與預(yù)后不良有關(guān)。敲除METTL3可大幅降低肝癌細(xì)胞在體外的增殖和遷移能力，并可顯著抑制肝癌細(xì)胞的致瘤性及體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移能力。這些數(shù)據(jù)表明，METTL3可能作為一種致癌基因，參與了腫瘤的進(jìn)展。最近研究發(fā)現(xiàn)，METTL3通過調(diào)節(jié)癌基因的翻譯在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，敲低METTL3降低了胃癌細(xì)胞中的Bcl-2，并增加了Bax和Caspase-3的活性，這表明凋亡途徑被激活。Shi等發(fā)現(xiàn)，METTL3在乳腺癌中低表達(dá)，并與三陰性乳腺癌的短期無(wú)轉(zhuǎn)移生存密切相關(guān)，可通過降低三陰性乳腺癌細(xì)胞系中的m6A水平來(lái)增強(qiáng)遷移、侵襲和黏附的能力，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在結(jié)腸癌中METTL3通過抑制SOCS2促進(jìn)細(xì)胞增殖來(lái)維持癌細(xì)胞的致瘤性。Xia等發(fā)現(xiàn)，與相鄰的非惡性食管黏膜組織相比，METTL3 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中上調(diào)，并且 METTL3的較高表達(dá)水平與較低的存活率相關(guān)，METTL3 表達(dá)水平是食管鱗狀細(xì)胞癌患者無(wú)病生存和總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。這可能與METTL3通過YTHDF1/HK2修飾促進(jìn)Warburg效應(yīng)，通過加速糖酵解和YTHDF1/HK2軸發(fā)揮致癌因子的作用有關(guān)。在宮頸癌中，METTL3 表達(dá)與腫瘤組織中 CD33細(xì)胞的密度呈正相關(guān)，并且與患者 DFS 或 OS 縮短顯著相關(guān)。研究表明，METTL3的表達(dá)與RAS癌基因家族成員之一的RAB2B的表達(dá)顯著相關(guān)，RAB2B 的過表達(dá)可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，表明METTL3可以通過RAB2B的轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控宮頸癌的惡性程度。

總之，METTL3表達(dá)水平在早期鱗狀細(xì)胞宮頸癌組織中降低，F(xiàn)IGO分期、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及METTL3表達(dá)水平是早期宮頸癌患者生存不良的獨(dú)立預(yù)后因素，表明METTL3可能為新的潛在預(yù)后標(biāo)志物和宮頸癌的治療靶點(diǎn)，但仍需要進(jìn)一步研究所涉及到的分子機(jī)制及信號(hào)通路。