李理，朱珺，林國棟，陳蘇，陳麗娥，陳作國

（杭州娃哈哈集團有限公司 杭州娃哈哈科技有限公司浙江省食品生物工程重點實驗室，杭州 310018）

0 引 言

硒是人體必需的14 種微量元素之一，動物和人體內不能合成，必須通過飲食獲得。1957 年首次認識到硒對營養(yǎng)性肝壞死的保護作用后[1]，其抗氧化、抗癌、保護心臟、提高機體免疫力、防治近視以及白內障、解毒、延緩衰老、增強生殖功能等多種生物活性和藥理作用被相繼報道，被譽為“生命火種”、“心臟的守護神”和“抗癌之王”[2-3]。我國約2/3 的地區(qū)近7 億人口處于缺硒的狀態(tài)[4]。與我國硒攝取的實際狀況相結合，1988 年中國營養(yǎng)家學會將微量元素硒列入我們每日必須攝入的15 種膳食營養(yǎng)素之中。為了保證人體日均生理補硒的安全性，我國對富硒食品中硒的限量也有嚴格的要求，《食品安全國家標準-食品營養(yǎng)強化劑使用標準》GB14880-2012 中對大米、小麥粉、面包、餅干、含乳飲料中硒的使用量進行了限制，其中含乳飲料中硒的使用量為50～200 μg/kg。

大量研究表明，硒元素在人體內的吸收、代謝以及生物功效的發(fā)揮，與其形態(tài)有著緊密的聯系[5]。一般而言，無機硒的水溶性高，毒性最大，生物利用率低；有機硒毒性較無機硒小，可以與功能性大分子物質的結合，能夠在抗氧化、抗腫瘤等生物活性方面產生協(xié)同效應，且生物利用率高，能夠滿足人體多樣化的營養(yǎng)需求[6]；納米硒毒性最小，易于被人體吸收且能夠發(fā)揮無機硒和有機硒所共有的功能性質[7]。目前硒的富集方法主要有植物富集法、動物富集法和微生物富集法[4]。采用微生物轉化富集到的有機硒與天然食物的有機硒的組成相似，如硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等，既可提高硒的生理活性，又可降低其毒性，有利于機體吸收[6，8]。

近年來，許多研究報道了乳酸菌可以將無機硒轉化成有機硒[9-11]。考慮到有機硒和乳酸菌均具有一定的生物活性，對人體健康和人體營養(yǎng)需求的重要作用，在飲食中添加硒，尤其是富硒的發(fā)酵食品和含硒的膳食補充劑，已經受到廣泛重視和認可。本研究以32 株乳酸菌為材料，通過檢測對亞硒酸鈉的耐受性和轉化能力來篩選富硒性能優(yōu)良的菌株，再通過優(yōu)化菌株發(fā)酵性能、亞硒酸鈉添加量、亞硒酸鈉添加方式等，確定富硒發(fā)酵乳的最佳制備工藝，最后檢測抗氧化活性的相關指標，評價富硒發(fā)酵乳的抗氧化活性，以期為富硒發(fā)酵食品的開發(fā)提供原料和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

32 株乳酸菌，由浙江省食品生物工程重點實驗室自主分離得到，其中菌株4030、4394、4187 分離自貴州發(fā)酵蔬菜，菌株4115 分離自貴州米酒，菌株4246、4446 分離自貴州腌肉糟，菌株823 分離自內蒙古發(fā)酵酸牛奶，菌株815、918 分離自青海發(fā)酵酸牛奶，菌株1577、1602、1774、1818、1610 分離自西藏傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛奶、菌株1800 分離自西藏青稞酒曲、菌株1636、1595、3888 分離自西藏乳扇，菌株1626、1643 分離自西藏酥油，菌株3471 分離自新疆發(fā)酵酸馬奶，菌株2538、3708、2518、3816、3824 分離自新疆發(fā)酵酸牛奶，菌株3788、3828、3832 分離自新疆奶疙瘩，菌株3379分離自新疆酥油；MRS 肉湯、技術瓊脂粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；M17 肉湯，青島海博生物技術有限公司；脫脂乳粉，恒天然（中國）有限公司；細菌/細胞總DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；亞硒酸鈉，Sigma 生物試劑有限公司；1,1-二苯肼-2-三硝基苯肼（DPPH），上海麥克林生化試劑有限公司；過氧化氫、甘油、氯化鈉、硝酸、鹽酸、高氯酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉、鐵氰化鉀、亮綠、硫酸亞鐵、無水乙醇，均為國產分析純試劑。

SG604 生物安全柜，美國Baker 公司；OptimaTMXPN 超速離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；DNP-111 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海海向儀器的設備廠；DU800 紫外分光光度計，美國Beckman 公司；AFS9330 原子熒光光譜儀（配硒空心陰極燈），北京吉天儀器有限公司；分析天平、Delta320pH 計，瑞士梅特勒-托利多有限公司；MSH-R-O3P 數顯加熱型磁力攪拌器，澳大利亞KEWLAB 公司；HH-US 恒溫水浴鍋，上海赫田科學儀器有限公司；7000 PCR 擴增儀，美國Applied Bio Systems 公司；KQ-300GVDV 雙頻恒溫超聲清洗破碎儀，昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離純化、鑒定和保藏

采用平板劃線法分離純化，得到的單菌落轉接至液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，菌液進行革蘭氏染色、鏡檢和H2O2酶試驗，初步鑒定為乳酸菌后，再進行16S rDNA測序鑒定。

取適量菌株純化后的培養(yǎng)物，離心棄上清后用細菌/細胞總DNA 試劑盒提取DNA，選擇乳酸菌通用引物27F 和1492R 對菌株的16S rDNA 片段進行擴增。PCR 產物寄送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。測序結果進行BLAST 比對，確定菌株種屬。經鑒定后的菌株純培養(yǎng)物連續(xù)傳代2 次后，獲得的菌液加甘油作為保護劑，-80 ℃保存。

1.2.2 菌株活化

將甘油管中保存的菌液在無菌條件下分別接種至MRS/M17 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～24 h，活化2～3 代后即可供菌株篩選使用。

1.2.3 富硒乳酸菌的篩選

將活化的菌液按3%比例接種至含有亞硒酸鈉（15 mg/L）的MRS/M17 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至大約對數生長期（10～12 h），分光光度計測600 nm 處的吸光值，3 次平行試驗。取10 mL 培養(yǎng)至對數期的菌液，12 000 rpm 離心10 min 后，上清液過0.22 μm 針頭式水系濾膜以完全除去菌體。按《食品安全國家標準 食品中硒的測定》GB5009.93-2017 中第一法氫化物原子熒光光譜法分別檢測培養(yǎng)基中和菌上清中的總硒含量，根據檢測結果，計算各菌株的硒轉化率。

硒轉化率=（培養(yǎng)基中硒含量-上清中硒含量）/培養(yǎng)基中硒含量×100%

1.2.4 富硒乳酸菌發(fā)酵性能評價

將篩選得到的富硒性能較優(yōu)的菌株按接種量為3×106CFU/mL 分別接種至10%脫脂乳+3%蔗糖中，40 ℃培養(yǎng)12 h，每隔1 h 測定pH 值，3 次平行試驗。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以pH 值為縱坐標，繪制生產酸曲線。發(fā)酵結束后，取終點樣品測定發(fā)酵乳中乙醛、雙乙酰含量，并進行感官評價。其中乙醛和雙乙酰含量測定方法參考文獻[12]，感官評價方法參考文獻[13]。

1.2.5 適宜亞硒酸鈉濃度的確定

根據《食品安全國家標準-食品營養(yǎng)強化劑使用標準》GB14880-2012 中對乳飲料中硒含量的要求，分別配置含亞硒酸鈉質量濃度為50、75、100、125、150、200 μg/L 的發(fā)酵基料，菌株按3×106CFU/mL 接種至發(fā)酵基料中，40 ℃培養(yǎng)至pH 值接近4.6，觀察發(fā)酵乳顏色，同時測定硒轉化率，確定最適加硒量。

1.2.6 發(fā)酵乳中硒含量的測定

發(fā)酵乳中總硒含量測定采用《食品安全國家標準食品中硒的測定》GB5009.93-2017 中第一法氫化物原子熒光光譜法進行。發(fā)酵乳中無機硒含量檢測如下：準確移取試樣30.00 mL（精確到0.01 mL）于100 mL 小燒杯中，加熱濃縮值5 mL 以下，轉移至10 mL 離心管中，純水定容值10 mL，渦旋混勻，超聲10 min 后，于80～90 ℃水浴振蕩提取1 h，其間每隔20 min 取出上下顛倒，使樣品充分混勻，水浴結束后，再使用超聲提取20 min。提取完畢，冷卻至室溫，以8 000 rpm 離心15 min。取上層清液，用NaOH 溶液（5 g/L）調節(jié)pH值至4～7后，經0.22 μm 針頭式有機過濾膜過濾，濾液采用GB5009.93-2017 中第一法進行硒含量檢測。

1.2.7 富硒發(fā)酵乳的制備

準確稱取100.0 g 脫脂乳粉、30.0 g 白砂糖、870.0 g飲用水混合均勻，預熱至70 ℃、20 MPa 均質，105 ℃殺菌10 min，冷卻至40 ℃左右。優(yōu)選菌株按3×106CFU/mL的量接種至含有亞硒酸鈉的發(fā)酵基料中，40 ℃發(fā)酵至pH 值4.6 左右，破乳終止發(fā)酵，冷卻至10 ℃，無菌分裝，得到富硒發(fā)酵乳。

1.2.8 富硒發(fā)酵乳抗氧化活性的測定

按1.2.7 所述制備富硒發(fā)酵乳，同時制備原料乳中不添加亞硒酸鈉發(fā)酵的無硒發(fā)酵乳和原料乳中添加亞硒酸鈉，但不經菌株發(fā)酵的無機硒乳，參考許牡丹等人[14]方法，并作適當改進，比較3 種乳樣品的抗氧化活性。

1.2.8.1 羥自由基清除能力測定

取1.0 mL 1,10-鄰菲羅啉溶液（6 mmol/L）與2.0 mL PBS 溶液混合，再加入1.0 mL 硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L），立即混勻。準確加入1.0 mL 乳樣品后加入1.0 mL 過氧化氫溶液（0.1%）和無菌水，反應總體積為8.0 mL。混合好的溶液37 ℃孵育1 h 后，于536 nm 處測定吸光值。羥自由基清除率=（As-Ac）/（Ab-Ac）×100%，式中：As為樣品組吸光值；Ac為對照組吸光值（包括鄰菲羅啉、PBS、硫酸亞鐵和過氧化氫）；Ab為空白組吸光值（包括鄰菲羅啉、PBS 和硫酸亞鐵）。

1.2.8.2 DPPH 自由基清除能力測定

用無水乙醇配置0.2 mmol/L 的DPPH 溶液。1 mL DPPH 乙醇溶液與1 mL 乳樣品充分混勻，避光室溫反應30 min，于517 nm 處測定吸光值，記為As，以等體積無水乙醇替換DPPH 溶液測量吸光值，記為Ab，以等體積蒸餾水替換樣品測量吸光值，記為Ac。

DPPH 自由基清除率= [1-（As-Ab）/Ac] ×100%

1.2.8.3 超氧陰離子自由基清除率

取0.1 mL 乳樣品于4.5 mL 的Tris-HCl 緩沖溶液（50 mmol/L，pH=8.0）混合，25 ℃水浴20 min 后，加入0.4 mL 鄰苯三酚溶液（以HCl 為溶劑配置成25 mmol/L），25 ℃水浴反應5 min，立即用2 滴HCl 溶液（8 mmol/L）終止反應，于325 nm 處測吸光值，記為As，用無菌水調零，無菌水代替樣品測得的吸光值，記為A0。

超氧陰離子自由基清除率=（A0-As）/ A0×100%

1.2.9 統(tǒng)計分析

測定指標均表示為3 次平行試驗的平均值±標準偏差。顯著性分析采用SPSS 17.0 軟件中的Duncan’s多重比較檢驗法進行分析，顯著水平設置為0.05。

2 結果與分析

2.1 菌株的16S 鑒定結果

將分離得到的32 株菌的測序結果在GenBank 的BLAST 數據庫中比對核苷酸序列的同源性，同源性在98%以上認為是同一種屬。鑒定結果如表1 所示，32 株菌均為乳酸菌。

表1 菌株16S rDNA 鑒定結果

2.2 富硒菌株的篩選

32 株乳酸菌在亞硒酸鈉添加量為15 mg/L 的MRS/M17 液體培養(yǎng)基上菌體生長情況如圖1 所示。由圖1 可知，與未加硒培養(yǎng)的對照組相比，菌株1577、1818、1643、2518、3816、3824、3832、4030、4115、3728、1800、3471 的生長明顯受到抑制，OD 值下降顯著（P＜0.05），菌株1602、1774、981、1595、1626、3473、4187 的生長抑制更加明顯，OD 值下降極顯著（P＜0.01），其余13 株菌的OD 值變化不明顯，說明在添加15 mg/L 的亞硒酸鈉后菌株的生長沒有受到明顯的影響，具有良好的硒耐受性，本研究中菌株硒耐受性的測試結果與韋夢婷等人[11]的研究結果相似。

圖1 菌株硒耐受性篩選

對硒耐受性良好的菌株培養(yǎng)液上清中的硒含量進行測定，并計算各菌株的富硒率，結果如表2 所示。由表可知，在含15 mg/L 的亞硒酸鈉的培養(yǎng)基中菌株的富硒性能差別明顯，菌株1610 的富硒率最高為81.1%，菌株3888、815、3379 的富硒率在70.00%～80.00%，菌株823、1636、2538、3708、4246 的富硒率在60.00%～70.00%，菌 株4394、4446、3788、3828 的 富 硒 率 在50.00%以下，其中菌株3828 的富硒率最低為27.87%。韋夢婷等人[11]的研究中指出，經過優(yōu)化后部分乳酸菌菌株的富硒率提高至70%以上，且菌株的富硒率最高可達到81.80%，與本文研究篩選結果較為一致，因此我們篩選富硒率70%以上的菌株，分別為菌株1610、3888、815、3379 進行發(fā)酵性能的評價，以便獲得兼具優(yōu)良富硒性能和發(fā)酵性能的菌株。

表2 耐受菌株的硒富集情況

2.3 富硒菌株的發(fā)酵性能

菌株的產酸速率、后酸穩(wěn)定性以及產生乙醛、雙乙酰的量是評價其發(fā)酵性能的重要指標。由圖2 可知，菌株3888 和3379 的產酸速率適中，但pH 值達到4.5 左右后繼續(xù)深度發(fā)酵，至發(fā)酵終點時，pH 值分別下降至3.49 和3.70；菌株815 的產酸延遲期較長，從4.5 h 左右才開始產酸，pH 值到達4.5 之后的發(fā)酵程度也比較深，到終點時pH 值低至3.68；菌株1610 整體的產酸速率適中，發(fā)酵5 h 后pH 值達到4.52，之后緩慢產酸至發(fā)酵終點，pH 值為4.20，后酸比較平穩(wěn)。

圖2 富硒菌株發(fā)酵乳產酸曲線

由表3 結果可知，以單菌株發(fā)酵獲得發(fā)酵乳中乙醛和雙乙酰的含量各有不同，結合風味評價描述發(fā)現，當乙醛含量較高時，發(fā)酵乳呈現典型發(fā)酵乳香氣，當雙乙酰含量較高時，發(fā)酵乳的乳脂風味突出。菌株815 的乙醛產量最高，但雙乙酰含量較低，因此缺乏乳脂香氣；菌株1610 的雙乙酰產量最高，呈現出濃郁的乳脂風味。一般認為，乙醛由保加利亞乳桿菌發(fā)酵產生，雙乙酰由嗜熱鏈球菌產生，且當酸奶中乙醛含量較低時，雙乙酰占主導地位，形成具有獨特奶香味的發(fā)酵乳[15-16]，本研究中的菌株1610 為一株嗜熱鏈球菌，菌株815 為一株德氏乳桿菌保加利亞亞種，其發(fā)酵產生的特征風味物質以及呈現出的風味符合這一特點。

綜合分析各菌株產酸特性和特征風味物質含量發(fā)現，菌株3379 的產酸速率較慢，且風味欠佳，不適合酸奶發(fā)酵，其余3 株發(fā)酵性能良好，其中菌株1610的產酸速率適中，后酸化穩(wěn)定，且能夠形成較高含量的乙醛和雙乙酰，呈現出乳脂香氣濃郁的發(fā)酵乳風味，發(fā)酵性能最優(yōu)。

2.4 不同濃度亞硒酸鈉對發(fā)酵乳感官品質和硒轉化的影響

有研究指出，亞硒酸鈉的濃度會對發(fā)酵乳的品質，如顏色、味道產生影響，也會影響菌株對硒的轉化[17]。乳酸菌自身在亞硒酸鈉環(huán)境中具有解毒作用，可將富集的硒一部分轉化成有機硒，而另外一部分可以被還原成零價態(tài)的單質硒，單質硒在溶液中呈紅色[7]。本研究中，不同濃度亞硒酸鈉對發(fā)酵乳的顏色和味道影響不明顯，添加量為最高200 μg/L 時，發(fā)酵乳均呈現乳白色，顏色沒有變化，也沒有金屬味道產生，說明實驗中各濃度的亞硒酸鈉沒有對菌株形成毒性，硒的轉化為生理性富集，絕大部分以有機硒形式存在。另一方面，不同濃度的亞硒酸鈉對發(fā)酵過程硒轉化率影響較大，且各菌株的變化趨勢較為一致，如圖3 所示。當濃度為50 μg/L 時，轉化率較低，隨后逐漸升高，當濃度增加至125 μg/L 以后，轉化率趨于穩(wěn)定。其中菌株3888 整體硒轉化水平較低，原因可能是由于該菌的產酸速率較快，發(fā)酵時間比另外兩株菌少0.75 h 造成的，Alzate 等人[18]的研究中也發(fā)現了相似的結果，乳酸菌發(fā)酵12 h 時，硒轉化率為89±1%，發(fā)酵24 h 時增加至94±1%。綜合考慮法規(guī)要求、硒轉化率和有機硒生成量，確定150 μg/L 為亞硒酸鈉的最優(yōu)濃度。

圖3 不同濃度亞硒酸鈉對發(fā)酵乳中菌株硒轉化的影響

2.5 富硒發(fā)酵乳抗氧化活性的研究

2.5.1 羥自由基清除能力

羥自由基能夠降解DNA、損傷細胞膜和多糖化合物，是導致脂質過氧化和人體細胞損傷的最主要的自由基之一。在本研究中,如圖4 所示，3 種乳樣品都有一定的羥自由基清除能力，其中富硒發(fā)酵乳的清除能力最強，顯著高于無機硒乳和無硒發(fā)酵乳（P＜0.05）。3 株乳酸菌相比，菌株1610 制備的富硒發(fā)酵乳清除能力最強，清除率為45.69±3.61%，分別是無機硒乳和無機硒發(fā)酵乳的2.99 倍和2.49 倍，分析原因可能是由于菌株1610 在乳中的硒轉化率較高，發(fā)酵乳中有更多的有機硒產生。Penas 等人[19]在制作德國泡菜時，在發(fā)酵前加入0.3 mg 亞硒酸鈉，發(fā)酵后發(fā)現泡菜的抗氧化活性因為有機硒的生產而顯著提高，為對照組的1.75 倍。

圖4 富硒發(fā)酵乳羥自由基清除能力

2.5.2 DPPH 自由基清除能力

清除DPPH 自由基能力被廣泛應用于抗氧化能力評價中，本研究中如圖5 所示，經過乳酸菌富硒的發(fā)酵乳的DPPH 自由基清除能力最強，顯著高于無機硒乳和無硒發(fā)酵乳（P＜0.05），3 株乳酸菌制備的富硒發(fā)酵乳的DPPH 自由基清除率為1610（47.15±3.20%）＞815（34.64±1.44%）＞3888（30.90±2.97%）。發(fā)酵乳通常具有一定抗氧化活性，但一般活性較低，乳酸菌是有機硒的良好載體，在乳原料中添加適量無機硒，經過特定菌株發(fā)酵轉化后，使得發(fā)酵乳的抗氧化活性顯著提高，形成協(xié)同效果。

圖5 富硒發(fā)酵乳DPPH 自由基清除能力

2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基是生物體代謝過程中產生的一種自由基，多種乳酸菌被報道過其發(fā)酵液、菌上清和菌體均有超氧陰離子自由基清除的能力[20]。本研究發(fā)現，富硒后的發(fā)酵乳超氧陰離子的清除能力最強，顯著高于無機硒乳和無硒發(fā)酵乳（P＜0.05），3 株乳酸菌制備的富硒發(fā)酵乳的超氧陰離子自由基清除能力為1610（70.20±3.32%）＞3888（64.35±3.35%）＞3888（60.72±4.18%）。超氧陰離子的清除主要通過超氧化物歧化酶進行，有研究報道，采用含有機硒的飼料飼喂仔兔后，兔血清中的SOD 酶顯著升高，說明有機硒可以促進SOD 酶的生產，從而提高超氧陰離子的清除能力[21]。本研究中富硒發(fā)酵乳超氧陰離子清除能力的增強可能也是通過有機硒的生成，從而促進了SOD 酶的活性。

圖6 富硒發(fā)酵乳超氧陰離子自由基清除能力

3 結 論

本研究從32 株乳酸菌中篩選得到了3 株硒轉化能力強且發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株，分別是嗜熱鏈球菌1610、乳酸乳球菌3888 和得到乳桿菌乳亞種815。當培養(yǎng)基中添加15 mg/L 的亞硒酸鈉時，1610 的富硒率為81.11±2.07%，3888 的富硒率為78.47±3.10%，815的富硒率為71.20±3.47%。以3 種菌株為發(fā)酵菌種制備富硒發(fā)酵乳，亞硒酸鈉最適添加量為150 μg/L，富硒率最高可達到88.39±10.61%，且發(fā)酵乳顏色呈現乳白色和典型發(fā)酵乳香氣，沒有紅色和金屬味，感官品質良好。與無機硒乳和無硒發(fā)酵乳相比，3 株菌制備的富硒發(fā)酵乳的羥自由基、DPPH 自由基和超氧陰離子自由基的清除能力顯著升高，說明經過含有有機硒的發(fā)酵乳具有更好的抗氧化活性。

乳酸菌是有機硒良好的載體，利用特定乳酸菌菌株能夠將無機硒轉化成有機硒的特性，賦予發(fā)酵乳雙重的功能特性，具有良好的市場空間。本研究發(fā)現篩選獲得的富硒菌株可在發(fā)酵乳時對無機硒進行快速高效的轉化，當底物濃度合適時，絕大部分以有機硒形態(tài)存在，且顯著提高了發(fā)酵乳的抗氧化活性。后期研究將進一步分析發(fā)酵乳中有機硒的形態(tài)以及有機硒與抗氧化活性之間的聯系，為富硒功能性發(fā)酵乳制品的開發(fā)提供支撐。