趙彥遠，溫敏輝，黃正華

（廣州金至檢測技術(shù)有限公司，廣東廣州 510330）

0 引 言

目前第三方檢測機構(gòu)檢測奶粉中的維生素K含量，主要參考《國家衛(wèi)生健康委員會公告〔2016年第8 號〕》附錄3（三）。該方法利用異丙醇直接對試樣進行超聲提取30 min，過0.45 μm 濾膜后，定容并上高效液相色譜儀測試，利用反相色譜分離法測定試樣中維生素K的含量。鄧夢雅等人針對食品中維生素K（MK_4、MK_7）的檢測，采用柱后衍生反應使非熒光化合物維生素K產(chǎn)生熒光，并結(jié)合熒光檢測器進行檢測，從而建立了食物中維生素K（MK-4、MK-7）高效、準確、快速、靈敏的同時分離檢測技術(shù)。劉光蘭等人針對鈣維生素D 維生素K 軟膠囊內(nèi)容物中維生素D和維生素K的含量測定方法，采用高效液相色譜法能同時快速檢測試樣中的維生素D和維生素K，不會因為其他雜質(zhì)干擾目標物質(zhì)等因素而影響檢測。采用95%甲醇水溶液：異丙醇=（98：2 V：V），梯度洗脫，53 min 就能把樣品中維生素D、維生素K流出，流動相的比例也能讓維生素D、維生素K2 不受其他雜質(zhì)峰的影響，達到準確的分離和定量。劉強等人采用正向高效液相色譜法測定軟膠囊中維生素K（35）的含量。張艷海等人采用在線二維液相色譜法同時測定嬰幼兒和成人配方營養(yǎng)品中的維生素A、D和E 含量，取得了比較理想的結(jié)果。但是在實際應用中發(fā)現(xiàn)，利用這些方法對復雜樣品基質(zhì)中維生素K進行測定時并不完全適用，因為奶粉中含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，特別是目標物含量低且干擾因素多的奶粉試樣，存在著提取效率低、定性困難、定量不準、干擾大、分析時間長等問題。

為了解決目前方法存在的不足，本文通過采用特定的樣品前處理步驟，即通過加入脂肪酶和蛋白酶有效避免奶粉中脂肪和蛋白對維生素K的包裹作用，使維生素K從奶粉中充分游離出來，并通過預先加入醇溶劑，可以有效克服酶解液和正己烷混合后出現(xiàn)的乳化現(xiàn)象并實現(xiàn)良好的分層，最終顯著提高了奶粉中維生素K的提取效率。在此基礎(chǔ)上，本文采用特定二維切割色譜條件對待測樣品溶液進行測定，實現(xiàn)了維生素K很好的定性和定量，具有檢測限低、精密度和準確度好的優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

脂肪酶：BR 級；酶活力，＞30 000 U/g；生產(chǎn)商，SIGMA ALDRICH；

木瓜蛋白酶：BR 級；酶活力，＞6 000 U/g；國藥集團化學試劑有限公司；

無水乙醇：分析純；純度，99.7% ；廣東光華科技股份有限公司；

正己烷：分析純；純度，97.0%；廣東光華科技股份有限公司；

異丙醇：分析純；純度，99.7%；廣東光華科技股份有限公司；

乙腈：色譜純，4 升/瓶，德國默克；

甲醇：色譜純，4 升/瓶，德國默克；

叔丁基甲醚：色譜純（GC），純度，≥99.9%，上海麥克林生化科技有限公司；

維生素K標準物質(zhì)：維生素K（MK7），CAS：2124-57-4；純度：99.8%；生產(chǎn)商：USP。

高效液相色譜儀：型號Agilent 1260 infility 中心切割二維液相色譜；生產(chǎn)商：安捷倫科技有限公司；

色譜柱：Agilent Extend-C18 柱（1.8 μm，4.6 mm×50 mm）、Inertsil ODS-SP 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；

檢測器：二極管陣列檢測器。

1.2 檢測方法

1.2.1 標準曲線溶液的配置

準確稱取10 mg 維生素K標準物質(zhì)于20 mL 棕色容量瓶中，用異丙醇溶解并定容至刻度，配成濃度為500 μg/mL維生素K標準儲備液（4 ℃，保存3 個月）。

準確吸取1 mL 維生素K標準儲備液至10 mL 棕色容量瓶中，用異丙醇定容，配成濃度為50 μg/mL 維生素K標準中間溶液。

分別準確吸取適量的維生素K標準中間溶液，配制成濃度系列為0.1 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL 標準工作溶液。

1.2.2 儀器及其條件

本方法通過使用二維切割色譜分離法代替?zhèn)鹘y(tǒng)色譜分離，選擇一維色譜使用Agilent Extend-C18 柱（1.8 μm，4.6 mm×50 mm），二維色譜使用Inertsil ODS-SP 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），一維流動相為乙腈-異丙醇體系，二維流動相為甲醇-叔丁基甲醚，利用兩根不同的色譜柱進行分離，在第一維色譜中將目標物從大部分的干擾物質(zhì)中切割到第二維色譜中繼續(xù)分離，分析時間由原來30 min 以上，縮短為15 min 內(nèi)，分析時間短。最終實現(xiàn)了在較短時間內(nèi)使目標物與大部分雜質(zhì)干擾得到分離，實現(xiàn)了非常好的分離效果。

本方法使用的高效液相色譜儀及其具體的參數(shù)如表1所示。

表1 儀器設(shè)備及其參數(shù)表

1.2.3 樣品前處理

準確稱取兩個5 g 含維生素K奶粉樣品（精確至0.1 mg）于兩支50 mL 離心管中，記為（1）號和（2）號，同時再準確稱取六個5 g 奶粉樣品（精確至0.1 mg）于6 支50 mL 離心管，記為（3）號、（4）號、（5）號、（6）號、（7）號和（8）號，向（3）號和（4）號兩支離心管中加入2.5 μg 維生素K標準物質(zhì)，向（5）號和（6）號兩支離心管中加入5.0 μg 維生素K標準物質(zhì)，向（7）號和（8）號兩支離心管中加入10.0 μg 維生素K標準物質(zhì)；再取一支50 mL 離心管作為空白，記為（9）號，分別向這九支離心管中加入1 g 脂肪酶和0.2 g 木瓜蛋白酶，再加入10 mL 水，混合均勻后，于（37±2） ℃水浴中振蕩2h，酶解后于（37±2）℃的溫度下超聲15 min，再加入10 mL 無水乙醇，混合均勻后，于（37±2） ℃的溫度下超聲15 min；最后加入10 mL 正己烷，渦旋振蕩5 min。于冷凍離心機中4 000 rpm，離心5 min，吸取上層正己烷于100 mL 圓底燒瓶中。提取液再次加入10 mL 正己烷，渦旋振蕩5 min，于冷凍離心機中4 000 rpm，離心5 min，合并兩次提取正己烷溶液于100 mL 圓底燒瓶中。100 mL 圓底燒瓶中的正己烷溶液用氮氣在（40±5） ℃的水浴中吹至近干，用異丙醇沖洗瓶壁，并準確轉(zhuǎn)移至10 mL 棕色容量瓶中，定容至刻度，混勻后過0.45 μm 有機濾膜于2.0 mL 棕色進樣瓶中，獲得九支待測溶液。

采用同樣的前處理方法，獲得六個平行樣品，作為精密度測定溶液。

2 結(jié)果

2.1 測定

將儀器設(shè)備按照表1中的參數(shù)進行設(shè)置和優(yōu)化，使儀器設(shè)備處于最佳狀態(tài)。先測定標準工作曲線溶液，獲得每個標準工作曲線溶液點的峰面積；以標準工作曲線溶液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，如圖1所示。

圖1 標準工作曲線圖

標準工作曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999 84，曲線方程為y=78.622 40x+4.789 04。標準工作曲線測試完成后，依次測試空白溶液，奶粉樣品溶液和低中高加標溶液，以及精密試驗溶液；獲得相應試驗的結(jié)果，如表2和表3所示。

表2 樣品及樣品加標回收率結(jié)果統(tǒng)計表

表3 方法精密度試驗結(jié)果統(tǒng)計表

2.2 結(jié)果統(tǒng)計與分析

采用本文方法測定奶粉中的維生素K，能夠獲得很好的準確度。如表2所示，在加標回收試驗中，在奶粉樣品中加標2.5 μg、5.0 μg 和10.0 μg 三個水平，三個加標水平的回收率分別為92.0%、91.8%和92.0%，不同加標濃度回收率均在90%～100%之間，加標回收率都很好。如表3所示，從精密度試驗獲得的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用本文方法測定奶粉中維生素K的精密度為3.9%，小于5%，方法穩(wěn)定性比較好，適合日常檢測工作。

通過對試劑空白溶液的測試，獲得試劑空白溶液的譜圖，如圖2所示。

圖2 試劑空白溶液測試色譜圖

通過對維生素K標準溶液的測試，獲得其標準溶液的譜圖，如圖3所示。

通過對奶粉樣品溶液的測試，獲得奶粉樣品中維生素K2 含量的譜圖，如圖4所示。

通過對比試劑空白溶液測試色譜圖（如圖2所示）、維生素K標準溶液測試色譜圖（如圖3所示）和奶粉樣品中維生素K色譜圖（如圖4所示），樣品中目標測試物維生素K的出峰處，沒有其他干擾峰存在，分離效果好，出峰時間短，準確度高。

圖3 維生素K2 標準溶液測試色譜圖

圖4 奶粉樣品中維生素K2 測試色譜圖

根據(jù)本文方法，標準工作曲線的最低點濃度為0.1 μg/mL，按照奶粉樣品稱取5 g，最后定容到10 mL 計算，檢出限至少可達到0.2 μg/g，能夠滿足日常奶粉樣品檢測限值的需求。

3 結(jié) 論

本文通過加入脂肪酶和木瓜蛋白酶對奶粉樣品進行酶解，酶解奶粉中的脂肪和蛋白質(zhì)，能夠很好地將維生素K釋放出來，提取更加徹底，并結(jié)合二維液相色譜儀檢測，能達到更好的分離效果，檢測結(jié)果更加準確可靠。通過三個濃度水平的加標試驗，其回收率均在90%～100%之間，準確度較高。檢測線性范圍能達到0.1 μg/mL ～5 μg/mL，相關(guān)系數(shù)為R ＞0.999，檢出限達到0.2 μg/g，檢測限低，靈敏度高；本方法檢測奶粉中維生素K的精密度小于5%，方法穩(wěn)定性好。