李 楠，李瑞婷，趙興文，鄧麗紅，蒲 慧，姜 燕,

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程學(xué)院，云南大理 671000）

人類的生育能力，特別是精子的質(zhì)量和數(shù)量已發(fā)生顯著的改變，男性不育和生殖系統(tǒng)發(fā)育異常明顯增加[1-2]，與人群接觸工業(yè)環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)密切相關(guān)[3-4]。二硫化碳（carbon disulfide，CS2）廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥生產(chǎn)、紡織業(yè)和玻璃紙制造業(yè)等[5-6]，長期職業(yè)條件下接觸，CS2可經(jīng)呼吸道和皮膚進入人體，對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響[7]。造成生殖損傷的主要機制為對線粒體造成氧化損傷[8-9]。當機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，活性氧生成量大于機體清除能力，導(dǎo)致機體脂質(zhì)過氧化水平升高，干擾細胞生長和細胞周期進程，并誘導(dǎo)細胞凋亡[10-12]，從而使精子數(shù)量減少、質(zhì)量下降，生育能力受損。

滇橄欖（Phyllanthus emblicaLinn），又名余甘子，云南省分布廣泛。滇橄欖葉是滇橄欖的廢棄物和副產(chǎn)物，含有多種生物活性物質(zhì)，其中羥基酪醇（hydroxytyrosol，HT）是以酯類形式存在的天然多酚化合物，具有抗炎抑菌、防止動脈粥樣硬化、抗癌、抗氧化和抑制血小板凝集等作用[13-15]。在黃酮、多酚和橄欖苦苷等多種抗氧化活性成分中，羥基酪醇具有更高的抗氧化能力，其對氧化應(yīng)激所致疾病具有防治作用[16-18]。研究表明，對比劑腎?。╟ontrast-induced nephropathy, CIN）發(fā)生時活性氧產(chǎn)生增多，存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，HT 可以減輕氧化應(yīng)激對CIN 的損傷，發(fā)揮腎臟保護作用[19]。張璐璐[20]研究發(fā)現(xiàn)，HT 通過抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸亢進、減輕海馬氧化應(yīng)激、抑制神經(jīng)炎癥、提升海馬神經(jīng)營養(yǎng)因子水平和恢復(fù)線粒體功能，緩解了輕度應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為。但其在睪丸組織氧化損傷方面的研究鮮有報道。

因此，本實驗旨在研究滇橄欖葉羥基酪醇（hydroxytyrosol fromPhyllanthus emblicaLinn leaves，PHT）對CS2誘導(dǎo)小鼠睪丸組織氧化損傷的保護作用，為其在CS2對男（雄）性生殖系統(tǒng)損傷的保護機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級昆明種小鼠40 只（體重18±2 g） 購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]；滇橄欖葉 云南樹翡翠農(nóng)林科技有限公司提供；二硫化碳 分析純，上海四試赫維化工有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；伊紅染色液、4%多聚甲醛、BCA 蛋白定量檢測試劑盒、Bax、Bcl-2、Caspase-3抗體、辣根過氧化物酶（HRP）山羊抗鼠二抗 武漢賽維爾生物科技有限公司。

MDF-382E（N）超低溫冰箱 日本SANYO 公司；CK40 光學(xué)顯微鏡 日本Olympus 公司；Multiskan酶標儀 芬蘭雷勃公司；XB120A 電子分析天平 瑞士Precisa 公司；GS-15R 低溫高速離心機 美國Beckman 公司；Agilent 1290 高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 滇橄欖葉羥基酪醇純化物的制備 滇橄欖葉采摘于云南賓川有機滇橄欖基地。40 ℃鼓風(fēng)干燥、粉碎，過60 目篩得滇橄欖葉粉末。準確稱取5 g 滇橄欖葉粉末，以1:15 g/mL 的料液比加入0.1 mol/L的NaOH 溶液，在80 ℃下，提取60 min，獲得PHT粗提物。將粗提液加入DA-201 大孔樹脂，采用靜態(tài)吸附脫附法對PHT 粗提物進行分離純化[21]，得到PHT 純化物（此后簡稱PHT）。

采用HPLC 外標法測定PHT 的含量，實驗條件：色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為25 ℃，以乙腈（0.2%冰乙酸）-水（10:90，V/V）為流動相，上樣量為5 μL，流速為0.8 mL/min，紫外吸收波長為280 nm。經(jīng)HPLC 檢測，PHT 粗提物的提取率為0.72%，純化后，PHT 純度為79.31%。

1.2.2 動物分組及給藥 將經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)的小鼠按體重隨機分為5 組，包括對照組、CS2染毒組和PHT 高（450 mg/kg）、中（150 mg/kg）、低（50 mg/kg）劑量組（給藥劑量根據(jù)提取物純度及預(yù)實驗確定），每組8 只。將從滇橄欖葉中提取的純化后的PHT 以蒸餾水分別配制成4.5、1.5、0.5 mg/mL 3 種濃度的溶液作為高、中、低劑量組的干預(yù)物質(zhì)。灌胃前稱小鼠體重，每只小鼠的灌胃容量為10 mL/kg。PHT 干預(yù)組每日9 時進行灌胃，對照組和染毒組蒸餾水灌胃。同時，染毒組和PHT 各劑量干預(yù)組采用靜式吸入式染毒，在灌胃當天14～16 時染毒2 h，每周染毒5 d，灌胃及染毒時間共持續(xù)4 周。實驗小鼠的使用嚴格遵守大理大學(xué)動物保護和使用委員會規(guī)章制度。

1.2.3 睪丸臟器系數(shù)的計算 4 周后，對小鼠體重進行稱量和記錄。隨后將其處死，并立即取出小鼠睪丸稱重，記錄睪丸重量。睪丸臟器系數(shù)的計算如式（1）所示。

1.2.4 精子質(zhì)量分析

1.2.4.1 精子計數(shù) 在1 mL 生理鹽水中剪碎附睪，混勻制成精子懸液。懸液放置于60 ℃水浴箱中孵育10 min 使精子死亡，取精子懸液充池于血細胞計數(shù)板的計數(shù)池內(nèi)，按紅細胞計數(shù)法計數(shù)中央大方格內(nèi)5 個中方格內(nèi)精子數(shù)，計算出每毫升精液中的精子數(shù)。

1.2.4.2 精子活動率 精子懸液制作方法同上，于37 ℃水浴箱中靜置10 min，待精子自由流出。在室溫條件下，取一滴精子懸液充填血細胞計數(shù)板，光學(xué)顯微鏡下鏡檢，連續(xù)計數(shù)200 個精子中活動精子數(shù)，計算精子活動率。

1.2.4.3 精子畸形率 于干凈玻片上取1 滴精子濾液推片，放置于室溫自然干燥，甲醇固定、干燥，然后用2%伊紅染色1～2 h，流水沖洗染液、室溫自然晾干玻片，高倍顯微鏡下計數(shù)1000 條精子中的畸形精子數(shù)，計算精子畸形率。

1.2.5 病理組織切片觀察 用手術(shù)刀片將經(jīng)過4%多聚甲醛固定的睪丸組織修成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm 的組織塊，經(jīng)常規(guī)組織石蠟包埋、切片、脫蠟后，采用HE 染色法制片，觀察睪丸的病理組織學(xué)變化。

1.2.6 睪丸組織氧化應(yīng)激指標檢測 取出-80 ℃凍存睪丸組織，加入9 倍預(yù)冷生理鹽水，置于冰上進行勻漿，充分研磨，制備10%組織勻漿。低溫離心機3000 r/min 離心10 min，棄沉淀，留上清液進行各項指標測定。按照試劑盒說明檢測MDA、SOD 和GSH-Px 等指標。

1.2.7 睪丸組織中凋亡相關(guān)因子蛋白的表達情況Western blot 實驗參照常規(guī)方法[22]進行，組織塊用預(yù)冷的PBS 洗滌2～3 次，加入10 倍組織體積的裂解液進行勻漿；將勻漿完成的勻漿管取出，放置冰上裂解30 min，每隔5 min 震蕩一次確保組織完全裂解；12000 r/min，4 ℃，離心10 min，收集上清，即為總蛋白溶液，采用BCA 試劑盒測蛋白濃度。進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后，加入一抗Caspase-3（1:1000 稀釋）、Bax（1:2500 稀釋）、Bcl-2（1:2500 稀釋）、內(nèi)參β-actin（1:2000 稀釋），4 ℃冰箱孵育過夜；次日用TBST 洗膜3 次，每次5 min，然后加入HRP-IgG（1:2000 稀釋），反應(yīng)1 h 后重復(fù)上述洗膜過程，凝膠成像系統(tǒng)曝光并保存圖片后定量分析，以目的蛋白與β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 睪丸臟器指數(shù)

由表1 可知，CS2染毒組睪丸臟器系數(shù)相對于對照組下降極顯著（P＜0.01），說明在CS2的毒性作用下，小鼠睪丸發(fā)生了病變性萎縮；PHT 高、中劑量組對小鼠睪丸表現(xiàn)出了保護作用，極顯著提高了小鼠睪丸臟器系數(shù)（P＜0.01）；且PHT 高劑量組小鼠睪丸質(zhì)量及睪丸臟器系數(shù)水平接近對照組，即組間已不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。說明PHT 對CS2致小鼠睪丸損傷的保護作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

表1 PHT 對CS2 染毒小鼠睪丸及其臟器系數(shù)的影響（n=8， ±S）Table 1 Effects of PHT on testis and organ coefficient of mice exposed to CS2 (n=8, ±S)

表1 PHT 對CS2 染毒小鼠睪丸及其臟器系數(shù)的影響（n=8， ±S）Table 1 Effects of PHT on testis and organ coefficient of mice exposed to CS2 (n=8, ±S)

注：*表示與對照組相比P＜0.05，**表示與對照組相比P＜0.01；#表示與CS2染毒組相比P＜0.05，##表示與CS2染毒組相比P＜0.01；表2～表4同。

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2.2 精子質(zhì)量檢測

由表2 可知，染毒組與對照組相比，精子數(shù)量減少，精子活動率降低，而精子畸形率升高，三者變化表現(xiàn)為極顯著（P＜0.01）。經(jīng)過PHT 干預(yù)后，各劑量組與染毒組相比，精子數(shù)量和精子活動率得到了極顯著的改善（P＜0.01），精子畸形率下降極為顯著（P＜0.01），即PHT 可以有效緩解CS2所致的精子損傷，提高精子質(zhì)量。而且，與對照組相比，PHT 高劑量組的精子畸形率未表現(xiàn)出差異（P＞0.05），說明在PHT高劑量的保護作用下，顯著降低了精子的致畸率。

表2 PHT 對CS2 染毒小鼠精子質(zhì)量的影響（n=8， ±S）Table 2 Effects of PHT on sperm quality of mice exposed to CS2 (n=8, ±S)

表2 PHT 對CS2 染毒小鼠精子質(zhì)量的影響（n=8， ±S）Table 2 Effects of PHT on sperm quality of mice exposed to CS2 (n=8, ±S)

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2.3 睪丸組織病理切片

通過小鼠睪丸組織HE 染色觀察PHT 對CS2造成的睪丸損傷的影響，結(jié)果如圖1。由圖1（A）可知，對照組小鼠睪丸生精上皮厚，曲細精管呈圓形或橢圓形，結(jié)構(gòu)完整飽滿，管內(nèi)支持細胞及各級生精細胞排列規(guī)則，可見各個發(fā)育階段細胞，腔內(nèi)可見成熟精子。由圖1（B）可知，在CS2的毒性作用下，睪丸曲細精管萎縮扭曲成不規(guī)則形狀，生精上皮變薄，生精細胞數(shù)量及管腔內(nèi)精子細胞數(shù)量明顯少于正常對照組。各級生精細胞排列紊亂，部分管腔可見大量生精細胞脫落，說明CS2對雄性動物表現(xiàn)出了明顯的生殖毒性。由圖1（C、D、E）可知，在PHT 保護作用下，曲細精管的變形程度減輕，管腔內(nèi)精子細胞數(shù)量明顯高于染毒組，且各級生精細胞排列較為規(guī)則，官腔內(nèi)可見成熟精子。說明該劑量下，小鼠睪丸組織形態(tài)得到了一定的保護。圖1（E）中管腔內(nèi)精子細胞數(shù)量基本正常。說明高劑量PHT 對CS2所造成的生殖毒性具有逆轉(zhuǎn)作用，使小鼠的睪丸組織形態(tài)趨近于空白對照組。在PHT 的抗氧化能力的保護下，睪丸組織的質(zhì)量得到明顯改善。

圖1 睪丸組織病理切片（200 倍）Fig.1 Pathological section of testis（200×）

2.4 PHT 對小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激指標的影響

結(jié)果如表3 所示，與對照組比，CS2組小鼠睪丸組織MDA 含量增加，SOD、GSH-Px 活性極顯著降低（P＜0.01）；與CS2染毒組比，PHT 高、中劑量組小鼠睪丸組織中MDA 含量有所下降，SOD 活性和GSHPx 活性極顯著升高（P＜0.01），低劑量組中MDA 含量和SOD 活性變化與其他兩個劑量組保持一致（P＜0.01），GSH-Px 活性差異雖不是極顯著（0.01＜P＜0.05），但各劑量組均表現(xiàn)出抑制氧化損傷的效果；當PHT 干預(yù)劑量為450 mg/kg 時，MDA 含量與對照組比，已無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），說明PHT 具有較好的抗氧化能力，對CS2所致的氧化損傷有一定的拮抗作用。

表3 PHT 對小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激指標的影響（n=8， ±S）Table 3 Effects of PHT on oxidative stress in testis of mice (n=8, ±S)

表3 PHT 對小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激指標的影響（n=8， ±S）Table 3 Effects of PHT on oxidative stress in testis of mice (n=8, ±S)

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2.5 小鼠睪丸組織中凋亡相關(guān)因子蛋白的表達情況

PHT 對CS2染毒小鼠睪丸組織中凋亡相關(guān)因子蛋白相對表達水平的影響見表4，其凝膠電泳圖見圖2。與對照組相比，CS2染毒組和PHT 中、低劑量組睪丸組織中Bax 和Caspase-3 表達極顯著升高（P＜0.01），Bcl-2 表達極顯著降低（P＜0.01），PHT 高劑量組的Bax、Bcl-2（P＜0.05）和Caspase-3（P＜0.01）的表達量與對照組也同樣存在差異，這三種蛋白相對表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；與CS2染毒組相比，中、高劑量干預(yù)組睪丸組織中Bax 和Caspase-3 表達極顯著降低，Bcl-2 表達極顯著升高（P＜0.01），且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。說明PHT 可以有效降低促細胞凋亡因子（Bax 和Caspase-3）的表達，同時可以升高抑制細胞凋亡因子（Bcl-2）的表達，即PHT 能夠?qū)ΣG丸組織表現(xiàn)出保護作用。

表4 小鼠睪丸組織中凋亡相關(guān)因子蛋白相對表達水平（n=8， ±S）Table 4 Relative expression level of apoptosis-related factor protein in mouse testis (n=8, ±S)

表4 小鼠睪丸組織中凋亡相關(guān)因子蛋白相對表達水平（n=8， ±S）Table 4 Relative expression level of apoptosis-related factor protein in mouse testis (n=8, ±S)

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圖2 小鼠睪丸組織中凋亡相關(guān)因子蛋白表達的凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of apoptosis-related factor protein expression in mouse testis

3 討論與結(jié)論

大量的人群流行病學(xué)研究和動物實驗研究表明，生產(chǎn)生活中接觸到的一些化學(xué)物質(zhì)會造成男（雄）性生殖系統(tǒng)損傷和男（雄）性生殖功能異常[23]。當機體長時間接觸到CS2時，會對睪丸組織產(chǎn)生慢性毒性，造成睪丸組織氧化損傷，降低精子質(zhì)量，增加男性不育的發(fā)生率。近年來，氧化應(yīng)激損傷逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注[24-25]。王姝婷[26]研究發(fā)現(xiàn)CS2暴露導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和DNA 損傷可能會引起孕鼠子宮和胚胎的細胞自噬水平異常，進而導(dǎo)致胚胎植入障礙。王為等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CS2作用于大鼠睪丸組織時發(fā)生氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量自由基，而體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)能力減弱無法全部清除，自由基對組織直接造成毒性作用。

羥基酪醇具有顯著的抗氧化功能[27]，其總抗氧化能力相較于黃酮[28]和其他多酚類化合物[29]表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，這為其在氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷中發(fā)揮保護作用提供了理論依據(jù)。本實驗表明，經(jīng)CS2染毒的小鼠睪丸臟器系數(shù)和精子質(zhì)量明顯降低，通過PHT 干預(yù)后，可以拮抗CS2染毒所致的小鼠精子數(shù)量和活動率降低，減少小鼠精子畸形率的增加，緩解小鼠睪丸組織的損傷程度，并且具有劑量依賴性。此外，本研究結(jié)果顯示，CS2染毒組中MDA 含量升高，SOD 和GSH-Px 活性下降，睪丸組織表現(xiàn)出氧化損傷，采用不同劑量的PHT 拮抗CS2后，睪丸組織MDA含量下降，SOD 和GSH-Px 活力升高，提示PHT 可以在體內(nèi)發(fā)揮較好的抗氧化作用。

CS2可以通過氧化損傷，導(dǎo)致睪丸清除自由基能力下降、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物大量堆積，使睪丸組織發(fā)生氧化損傷，進一步激活促細胞凋亡因子表達。Bcl-2 蛋白是Bcl-2 原癌基因的編碼產(chǎn)物，是細胞存活促進因子。Bax 是Bcl-2 基因家族中細胞凋亡促進基因，Bax 的過度表達可拮抗Bcl-2 的保護效應(yīng)而使細胞趨于死亡，而Caspase-3 是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[30]。CS2染毒后，Bax 和Caspase-3 的表達量升高，Bcl-2 的表達量降低。Bax、Bcl-2 主要在線粒體外膜附近區(qū)域發(fā)揮功效，Bax 蛋白可以使線粒體膜上形成孔道，促進細胞色素C 的釋放，當細胞受到凋亡信號的作用后，使Caspase-3 的表達升高，而Bcl-2 蛋白的高表達可以阻止這一過程[31]。在PHT 的干預(yù)下，促進細胞凋亡因子Bax 和Caspase-3 的表達量下降，促進細胞存活因子Bcl-2 的表達量升高，與CS2染毒組比，中、高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示PHT 可以顯著拮抗CS2所致的氧化應(yīng)激，抑制細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，當長期低劑量的接觸脂溶性的CS2時，會促使機體產(chǎn)生過量的MDA，減弱抗氧化酶活性，進一步加重氧化損傷，使Bcl-2 和Bax 表達失衡，最終激活Caspase-3 因子，導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡。而PHT 具有較強的體外抗氧化活性，其對自由基的清除能力和總抗氧化能力較為突出。將其作用于CS2染毒的動物實驗后，同樣表現(xiàn)出較為理想的保護作用。PHT 保護CS2所致的小鼠生殖損傷的作用機制可能與PHT 對抗CS2氧化損傷有關(guān)，該研究為緩解機體氧化損傷提供了新的選擇，也為預(yù)防慢性CS2中毒提供了一種可能。