溫曉麗

（鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧鞍山 114000）

棗是一種典型的藥食兼用水果，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞等保健作用[1]。棗亦富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，相較于一般水果，糖含量較高，還包含維生素C、脂肪、膳食纖維、氨基酸、蛋白質(zhì)、環(huán)磷酸鳥苷、環(huán)磷酸腺苷、酚、類黃酮以及礦物質(zhì)等[2]。三星棗是我國(guó)御寒能力很強(qiáng)的棗品種之一，肉質(zhì)嫩脆、產(chǎn)量穩(wěn)定、成熟快、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均衡，被稱為“北方瑪瑙”[3]。棗果實(shí)采收正值高溫季節(jié)，采后呼吸速率較大，易導(dǎo)致果實(shí)失水萎蔫、軟化、酒軟等而失去食用價(jià)值[4]。因此，延長(zhǎng)鮮棗的保鮮期和提高其品質(zhì)已成為棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展及其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題[5-6]。

磷酸鈉為白色或無色晶體，可通過增加pH 和增強(qiáng)離子強(qiáng)度來提高食品的保水能力，從而作為一種品質(zhì)改良劑在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用[7]。磷酸鈉在果蔬采后防腐保鮮中也有一些報(bào)道。王修俊等[8]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合磷酸鹽處理可以有效防止鮮切青蘋果的酶促褐變。已有研究證明，采后磷酸鈉處理可誘導(dǎo)蘋果果實(shí)對(duì)黑斑病的抗性，并且促進(jìn)了苯丙烷和活性氧代謝關(guān)鍵酶活性和次生代謝產(chǎn)物的積累[9-10]。此外，采后磷酸鈉處理可降低棗果實(shí)的還原糖含量，抑制棗果實(shí)蔗糖代謝中的酸性轉(zhuǎn)化酶、中性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合酶裂解、蔗糖合酶合成和蔗糖磷酸合酶活性從而抑制果實(shí)呼吸速率，達(dá)到保鮮效果[11]。棗果實(shí)的研究還證明，采后精氨酸、1-MCP 等處理可以增強(qiáng)果實(shí)抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性，激活苯丙烷代謝來降低棗皮細(xì)胞膜通透性并增加果實(shí)的抗病性[12-13]。由此說明，活性氧代謝和苯丙烷代謝在果實(shí)抗病中具有重要作用。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）和4-香豆酰CoA 連接酶（4-coumarate/coenzyme A ligase，4CL）是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，其活性高低與酚類、黃酮類和木質(zhì)素等產(chǎn)物的積累密切相關(guān)[14]。此外，采后誘抗劑處理還可以誘導(dǎo)果實(shí)胞內(nèi)H2O2積累，從而作為信號(hào)分子激活苯丙烷代謝途徑，提高了PAL 和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，促進(jìn)木質(zhì)素、酚類物質(zhì)等的積累，以抵抗病原菌的侵染并提高貯藏性能[14-16]。綜上所述，活性氧代謝、苯丙烷代謝途徑與果蔬抗性密切相關(guān)。然而，尚未見采后磷酸鈉處理對(duì)棗果實(shí)活性氧和苯丙烷代謝影響的報(bào)道。

本研究以三星棗為對(duì)象，分析磷酸鈉處理后果實(shí)H2O2含量及其清除相關(guān)酶GR 和APX 活性，苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL、4CL 和POD 活性及酚類物質(zhì)含量的變化，為揭示磷酸鈉提高棗果實(shí)保鮮效果的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三星棗 采自遼寧省朝陽市，選取無損傷、質(zhì)地優(yōu)良、大小均一的果實(shí)，成熟度為半紅果，紙箱包裝后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理；磷酸鈉 北京索萊寶生物科技有限公司；鹽酸（36%～38%）、硫酸（95%～98%）、四氯化鈦 錦州古城化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉天津博迪化工股份有限公司；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

UV-2550 型分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；湘儀H1650R 離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；L6S 紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外源磷酸鈉處理?xiàng)椆麑?shí) 挑選成熟度一致，大小和顏色均勻，無機(jī)械損傷和病蟲害的三星棗果實(shí)。用預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選的0.5 mg/mL 磷酸鈉溶液（含0.01%Tween 20）浸泡果實(shí)5 min，以蒸餾水處理為對(duì)照。將果實(shí)風(fēng)干后放入聚乙烯（PE）托盤中，在室溫下（20±2 ℃，相對(duì)濕度75%±5%）保存待用。每組處理用果實(shí)210 個(gè)。參考葛永紅等[17]的方法，分別于處理后第0、2、4、6、8、10 和12 d 果實(shí)去核，帶皮切碎組織并在液氮中冷凍，然后放入-80 ℃冰箱中保存待用。每組處理每次用果實(shí)30 個(gè)。

1.2.2 過氧化氫（H2O2）含量測(cè)定 參考Liu 等[18]的方法并修改。精確稱取1.0 g 冷凍組織，加入3.0 mL冷丙酮在冰浴條件下研磨成勻漿，然后低溫（4 ℃）離心20 min（12000×g）。取2.0 mL 上清液，加入40 μL，20 mol/L 四氯化鈦溶液和50 μL 濃氨水反應(yīng)5 min，在相同條件下離心10 min。沉淀物用冷丙酮洗滌3 次后溶于3.0 mL，1.0 mol/L H2SO4溶液中，并在410 nm 下測(cè)定吸光度值。按照同樣的方法，以吸光度為縱坐標(biāo)，H2O2物質(zhì)的量（μmol）為橫坐標(biāo)，制作H2O2標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線（y=0.0063x+0.0208，R2=0.9952）。H2O2含量以μmol/g FW（鮮重）表示。

1.2.3 APX 活性測(cè)定 APX 粗酶液提取和活性測(cè)定參照Ge 等[14]的方法。取1.5 g 冷凍組織，液氮研磨成粉末，然后加入3.0 mL 磷酸緩沖液（pH7.5，0.1 mol/L）繼續(xù)研磨成勻漿后在4 ℃、12000×g 條件下離心25 min 收集上清液。APX 反應(yīng)體系包括2.0 mL 100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.5），0.8 mL 3.0 mmol/L抗壞血酸，200 μL 粗酶液和0.5 mL 0.5 mmol/L H2O2。反應(yīng)啟動(dòng)15 s 后測(cè)量混合液在290 nm 處的吸光度值，并連續(xù)測(cè)量2 min。以吸光度值每分鐘變化0.01 為1 個(gè)酶活性單位（U），APX 活性以U/g FW表示。

1.2.4 GR 活性測(cè)定 GR 粗酶液提取和活性測(cè)定參照Ge 等[14]的方法。稱取1.0 g 冷凍組織，液氮研磨成粉末，然后加入3.0 mL 磷酸緩沖液（pH7.5，0.1 mol/L）繼續(xù)研磨成勻漿后在12000×g 條件下（4 ℃）離心25 min 收集上清液。GR 反應(yīng)體系包括3.0 mL 磷酸鈉緩沖液（100 mmol/L、pH7.5）、90 μL NADPH（3.0 mmol/L）、0.1 mL 氧化型谷胱甘肽（5.0 mmol/L）和0.6 mL 粗酶液。反應(yīng)完成后測(cè)定混合液在340 nm處的吸光度。以340 nm 處吸光度值每分鐘變化0.01 為1 個(gè)酶活性單位（U），GR 活性表示為U/g FW。

1.2.5 PAL 活性測(cè)定 PAL 粗酶液提取和活性測(cè)定參照Liu 等[19]的方法。稱取冷凍組織1.5 g，液氮研磨成粉末后加入4.0 mL 硼酸緩沖液（100 mmol/L，pH8.8），繼續(xù)磨成勻漿后靜置提取20 min，最后在12000×g 條件下（4℃）離心20 min 收集上清液。PAL 反應(yīng)體系包括0.5 mL 粗酶液、0.5 mL 苯丙氨酸溶液（0.02 mol/L）和3.0 mL 蒸餾水。混勻后于290 nm 處分別測(cè)定反應(yīng)0 min 和反應(yīng)40 min 的吸光度。以290 nm 處吸光值每分鐘變化0.01 定義為1 個(gè)酶活性單位（U），PAL 活性以U/g FW 表示。

1.2.6 4CL 活性測(cè)定 4CL 粗酶液提取和活性測(cè)定參照Ren 等[20]的方法。稱取冷凍組織2.0 g，加入4.0 mL 預(yù)冷的Tris-HCl 緩沖液（0.2 mol/L）磨成勻漿后暗處反應(yīng)20 min，低溫離心（12000×g）30 min 后收集上清液待測(cè)定。4CL 反應(yīng)體系由0.15 mL 香豆酸（2.0 mmol/L）、0.15 mL 乙酰輔酶A（1.0 μmol/L）、0.15 mL 三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）（0.8 mmol/L）、0.45 mL 氯化鎂（75 mmol/L）和1.5 mL粗酶液組成。酶活性以U/g FW 表示，將333 nm 處吸光值每分鐘變化0.01 定義為1 個(gè)酶活性單位（U）。

1.2.7 POD 活性測(cè)定 參考葛永紅等[17]的方法提取粗酶液和測(cè)定POD 活性。稱取果肉組織1.5 g，加入4.0 mL 預(yù)冷的0.05 mol/L 磷酸鈉提取液（pH7.5，內(nèi)含1.0 mmol/L 聚乙二醇、2.0% 聚乙烯吡咯烷酮和0.01% Triton X-100），磨成勻漿后低溫離心（12000×g）30 min 后收集上清液。反應(yīng)體系包括2.5 mL、0.025 mol/L 的愈創(chuàng)木酚，0.2 mL、0.25 mol/L 的H2O2和0.2 mL 粗酶液。以470 nm 處吸光度值每分鐘變化0.01 定義為1 個(gè)酶活性單位（U），POD 活性以U/g FW 表示。

1.2.8 總酚和類黃酮含量測(cè)定 參考Liu 等[18]的方法。稱取1.0 g 磷酸鈉處理和對(duì)照果肉組織，分別加入3.0 mL 預(yù)冷的1%鹽酸-甲醇溶液，冰浴條件下充分研磨后在4 ℃、12000×g 離心10 min。取上清液分別測(cè)定280 nm 和325 nm 處吸光度值。用ΔOD280/g FW和ΔOD325/g FW 分別表示總酚和類黃酮含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)的測(cè)定均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010 計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差并作圖，采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行最小極差分析，以P＜0.05 表示對(duì)照和處理差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗果實(shí)H2O2 含量的變化

活性氧爆發(fā)是果蔬遭受脅迫后作出的早期反應(yīng)之一，果實(shí)體內(nèi)積累的H2O2可以作為信號(hào)分子啟動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)，也可以參與木質(zhì)素的合成過程，然而過量的H2O2又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜質(zhì)過氧化，從而加速果實(shí)的衰老[21]。由圖1 可知，對(duì)照果實(shí)H2O2含量在整個(gè)貯藏期間呈單峰變化趨勢(shì)，在第8 d 達(dá)到最大，而磷酸鈉處理果實(shí)H2O2含量呈雙峰變化趨勢(shì)，分別在貯藏第4 d 和10 d 出現(xiàn)峰值，分別比對(duì)照組高16.9%和18.7%。此外，磷酸鈉處理顯著（P＜0.05）促進(jìn)了貯藏第2、4、8、10 和12 d 棗果實(shí)中H2O2含量的增加。蘋果果實(shí)的研究也表明，采后磷酸鈉處理誘導(dǎo)了果實(shí)中H2O2的積累，并且出現(xiàn)兩個(gè)高峰[10]。因此，推測(cè)磷酸鈉處理誘導(dǎo)果實(shí)中H2O2含量的升高可能是因?yàn)槠湔T抗作用促進(jìn)H2O2的積累從而作為信號(hào)分子啟動(dòng)其它防衛(wèi)反應(yīng)的表達(dá)，而在后期明顯上升可能是由于其參與了木質(zhì)素的合成。

圖1 采后磷酸鈉處理對(duì)棗果實(shí)H2O2 含量的影響Fig.1 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on H2O2 content in jujube fruit

2.2 棗果實(shí)APX 活性的變化

APX 是抗壞血酸-還原型谷胱甘肽循環(huán)的關(guān)鍵酶，將電子從抗壞血酸轉(zhuǎn)移到H2O2，并產(chǎn)生周期短的脫氫抗壞血酸和H2O，從而達(dá)到清除過量H2O2的目的[22]。由圖2 可知，在整個(gè)貯藏期內(nèi)，磷酸鈉處理和對(duì)照果實(shí)的APX 活性均呈先升高后降低趨勢(shì)，且磷酸鈉處理果實(shí)均高于對(duì)照果實(shí)，同時(shí)在貯藏第4～12 d具有差異顯著性（P＜0.05），分別是對(duì)照組APX 活性的1.17、1.21、1.15、1.26 和1.20 倍。Ge 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采后磷酸鈉處理提高了蘋果果實(shí)中APX 活性，有助于清除大量積累的H2O2，從而提高蘋果果實(shí)的采后抗性。由此表明，磷酸鈉處理?xiàng)椆麑?shí)能有效提高抗氧化酶活性并減輕膜脂過氧化反應(yīng)，從而提高棗果實(shí)的抗病能力。

圖2 采后磷酸鈉處理對(duì)棗果實(shí)APX 活性的影響Fig.2 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on APX activity in jujube fruit

2.3 棗果實(shí)GR 活性的變化

GR 是抗壞血酸-還原型谷胱甘肽循環(huán)中的另外一個(gè)關(guān)鍵酶，依賴NADPH 催化谷胱甘肽，從而保持氧化性和還原性谷胱甘肽的穩(wěn)定[22]。磷酸鈉處理果實(shí)中GR 活性在貯藏第0～2 d 和6～8 d 上升，在第2～6 d 和8～12 d 下降；而對(duì)照果實(shí)GR 活性在貯藏第0～8 d 呈上升趨勢(shì)，隨后下降（圖3）。磷酸鈉處理顯著提高了貯藏第2～8 d 棗果實(shí)中GR 活性，分別是對(duì)照果實(shí)的1.46、1.24、1.18 和1.28 倍（P＜0.05）。Ge等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采后磷酸鈉處理提高了蘋果果實(shí)中GR 活性，并且出現(xiàn)了一個(gè)高峰，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷酸鈉誘導(dǎo)棗果實(shí)中出現(xiàn)兩個(gè)GR 活性高峰。分析其原因可能是由于貯藏后期H2O2含量增加，為了保證抗壞血酸-還原型谷胱甘肽循環(huán)對(duì)H2O2的清除效率和谷胱甘肽平衡，GR 活性再次被誘導(dǎo)升高。由此說明，外源磷酸鈉處理能夠提高棗果實(shí)常溫貯藏期間的GR 活性，從而保持氧化性和還原性谷胱甘肽的平衡，但在不同的果蔬中磷酸鈉誘導(dǎo)的抗性反應(yīng)有差異。

圖3 采后磷酸鈉處理對(duì)棗果實(shí)GR 活性的影響Fig.3 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on GR activity in jujube fruit

2.4 棗果實(shí)PAL 活性的變化

PAL 是苯丙烷代謝的限速酶，調(diào)控下游次生代謝產(chǎn)物酚類、木質(zhì)素、生物堿等的合成，與果實(shí)抗病性密切相關(guān)[23]。由圖4 可知，對(duì)照和磷酸鈉處理果實(shí)中PAL 活性在貯藏第0～12 d 呈先升高后降低趨勢(shì)，并且在第6 d 達(dá)到高峰值。磷酸鈉處理顯著提高了貯藏第4、6 和8 d 棗果實(shí)PAL 活性，分別是對(duì)照的1.08、1.18 和1.11 倍（P＜0.05）。已有研究表明，采后磷酸鈉能夠誘導(dǎo)蘋果果實(shí)中PAL 活性的升高，同時(shí)提高其對(duì)黑斑病的抗性[10]。由此可見，磷酸鈉處理能夠提高果實(shí)中PAL 活性并激活苯丙烷代謝途徑。

圖4 采后磷酸鈉處理對(duì)棗果實(shí)PAL 活性的影響Fig.4 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on PAL activity in jujube fruit

2.5 棗果實(shí)4CL 活性的變化

4CL 是苯丙烷代謝下游分支的關(guān)鍵酶之一，催化阿魏酸、對(duì)香豆酸、肉桂酸和咖啡酸轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酰-輔酶A[24]。由圖5 可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸鈉處理與對(duì)照果實(shí)4CL 活性均呈先上升后下降趨勢(shì)，二者均在第8 d 達(dá)到高峰值。與對(duì)照相比，磷酸鈉處理果實(shí)的4CL 活性均保持較高水平，并且在貯藏第4～12 d 差異顯著，分別是對(duì)照果實(shí)的1.10、1.06、1.16、1.25 和1.16 倍（P＜0.05）。冬棗果實(shí)中的研究表明，誘抗劑處理激活了4CL 活性，并且促進(jìn)了下游產(chǎn)物的積累，從而提高果實(shí)的抗性[25]。這些結(jié)果表明，促進(jìn)4CL 活性的升高是磷酸鈉誘導(dǎo)棗果實(shí)產(chǎn)生抗性的機(jī)理之一。

圖5 采后磷酸鈉處理對(duì)棗果實(shí)4CL 活性的影響Fig.5 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on 4CL activity in jujube fruit

2.6 棗果實(shí)POD 活性的變化

POD 具有多種同工酶，可以清除寄主體內(nèi)過量積累的H2O2，也是木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶[24]。由圖6 可知，磷酸鈉處理?xiàng)椆麑?shí)POD 活性始終高于對(duì)照果實(shí)，在貯藏第4～10 d 差異顯著，對(duì)照果實(shí)POD活性為磷酸鈉處理果實(shí)的83.8%、80.4%、71.2%和93.1%（P＜0.05）。蘋果中的研究證明，采后磷酸鈉浸泡處理誘導(dǎo)了果實(shí)中POD 活性的升高，并且呈單峰變化趨勢(shì)[10]。冬棗果實(shí)的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[25]。由此說明，磷酸鈉處理能夠提高棗果實(shí)貯藏期間POD 活性。

圖6 采后磷酸鈉處理對(duì)棗果實(shí)POD 活性的影響Fig.6 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on POD activity in jujube fruit

2.7 棗果實(shí)總酚和類黃酮含量的變化

酚類和類黃酮是苯丙烷代謝的主要產(chǎn)物，在果實(shí)抗病過程中具有重要作用，二者不僅能夠直接抑制病原真菌的生長(zhǎng)，還能強(qiáng)化寄主細(xì)胞壁提高對(duì)病原真菌侵染的抵抗能力[26]。在整個(gè)貯藏期間，磷酸鈉處理?xiàng)椆麑?shí)總酚含量始終高于對(duì)照果實(shí)，且在貯藏第8 d達(dá)到峰值（圖7A），其中，6～12 d 磷酸鈉處理果實(shí)總酚含量顯著高于對(duì)照果實(shí)，分別為對(duì)照果實(shí)的1.19、1.38、1.26 和1.24 倍（P＜0.05）。磷酸鈉處理與對(duì)照棗果實(shí)中類黃酮含量在貯藏期內(nèi)緩慢上升，且均在貯藏第10 d 達(dá)到峰值（圖7B）。相較于對(duì)照組果實(shí)，磷酸鈉處理在貯藏第6～12 d 顯著促進(jìn)了類黃酮的積累，分別為對(duì)照組的1.14、1.15、1.29 和1.25 倍（P＜0.05）。Ge 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采后磷酸鈉處理提高了蘋果果實(shí)中總酚和類黃酮含量，并且呈單峰變化趨勢(shì)。此外，冬棗果實(shí)中的研究也證明，采后誘抗劑處理能夠促進(jìn)總酚和類黃酮的積累[25]。由此可知，磷酸鈉處理能夠提高棗果實(shí)常溫貯藏期間次生代謝產(chǎn)物總酚與類黃酮的積累。

圖7 采后磷酸鈉處理對(duì)棗果實(shí)總酚（A）和類黃酮（B）含量的影響Fig.7 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on the contents of total phenolic compounds (A) and flavonoids (B)in jujube fruit

3 結(jié)論

采后0.5 mg/mL 磷酸鈉浸泡能誘導(dǎo)棗果實(shí)中H2O2的積累，并且呈雙峰變化趨勢(shì)，同時(shí)顯著提高了果實(shí)APX 和GR 活性（P＜0.05）。磷酸鈉提高了果實(shí)PAL、POD和4CL 活性，分別在貯藏第6、8 和8 d出現(xiàn)高峰，這些酶活性的升高顯著促進(jìn)了總酚和類黃酮的積累（P＜0.05）。由此說明，采后外源磷酸鈉處理能夠激活棗果實(shí)活性氧清除酶的活性，促進(jìn)苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性和酚類物質(zhì)的積累。