齊江華 秦三利 梁福東 劉利兵 甘雨靈 李廷棟 梁鵬

甘肅省腫瘤醫(yī)院/甘肅省醫(yī)學科學研究院，甘肅 蘭州 730050

惡性黑色素瘤是皮膚和黏膜常見的一種高度惡性腫瘤，其發(fā)病率占皮膚腫瘤第三位［1］。目前發(fā)病人數(shù)每年以3%～5%的速度增長，成為全球增速最快的惡性腫瘤［2-3］。國內(nèi)外對惡性黑色素瘤進行了深入的研究，并制定了診療規(guī)范［4-5］。近年來隨著新的治療手段及新型靶向藥物的出現(xiàn)，對治療帶來了新希望并有所突破［6］。甘肅省腫瘤醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科一直堅持實施肢體隔離熱灌注化療術(shù)治療惡性黑色素瘤，相關(guān)臨床療效及應用得到業(yè)界的認可［7］。然而經(jīng)過治療的惡性黑色素瘤患者也會出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移，臨床治療效果欠佳，被認為是對傳統(tǒng)療法最具攻擊性和極強抵抗力的腫瘤之一［8］。為了解決惡性黑色素瘤治療的難點，本研究試圖通過數(shù)據(jù)發(fā)掘手段，尋找惡性黑色素瘤相關(guān)基因，為治療惡性黑色素瘤提供思路和方向。

研究發(fā)現(xiàn)，惡性黑色素瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及抗藥性與腫瘤細胞的表型有關(guān)［9］。研究顯示ABCB5基因在腫瘤組織中的上調(diào)表達，表明其可能在癌癥的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥性方面有作用，但ABCB5基因上調(diào)表達在促進惡性黑色素瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移及耐藥性方面的作用機制尚存在爭議，并未完全闡明［10］。

通過前期文獻計量學研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)鮮有機構(gòu)對這一問題進行深入研究，未見明確報道。本研究擬通過數(shù)據(jù)挖掘方法，綜合分析ABCB5基因在惡性黑色素瘤中的表達及與腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 ABCB5基因單基因表達分析 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn）進行ABCB5基因單基因表達分析。篩選條件：①Gene：ABCB5；②Differential Methods：ANOVA；③|Log2FC|Cutoff：1；④q-value Cutoff：0.01；⑤Log Scale：No；⑥Matched Normal data：⑦Match TCGA normal and GTEx data；⑧Dataset：ALL；⑨Pl ot Width：12。

1.2 惡性黑色素瘤相關(guān)差異性基因表達 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫選擇‘Differential Expression Analysis’功能，進行惡性黑色素瘤在人類染色體中相關(guān)腫瘤基因的表達分析。篩選條件：①Dataset：SKCM；②Differential Methods：ANOVA；③Log2FC|Cutoff：1；④q-value Cutoff：0.01；⑤Chromosomal Distribution：Both（Default color：Over-Red；Under-Green）。

1.3 ABCB5基因在惡性黑色素瘤不同病理分期中的差異性表達 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫選擇‘Pathological Stage Plot’功能。篩選條件：①Gene：ABCB5；②Use major stage：Yes；③Datasets：SKCM；④Log Scale：Yes。

1.4 惡性黑色素瘤患者生存分析 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu）進行惡性黑色素瘤患者生存分析。篩選條件：①Methods：overall survival；②Group cut-off：median；③Hazards Radio：Yes；④95%Confidence Interval：Yes；⑤Axis Units：Months；⑥D(zhuǎn)ata sets Selection：SKCM。

1.5 ABCB5基因的甲基化在惡性黑色素瘤中的表達分析 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu）進行ABCB5基因的甲基化在惡性黑色素瘤中的表達及預后分析。篩選條件：①Gene：ABCB5；②cancer type：SKCM；③Split patients by：Auto select best cut off。1.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析 通過String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）預測ABCB5基因蛋白質(zhì)的上下游調(diào)控蛋白及蛋白質(zhì)間的相互調(diào)控作用。篩選條件：①Protein Name：ABCB5；②Organism：auto-detect。

2 結(jié)果

2.1 ABCB5基因單基因表達分析 在GEPIA數(shù)據(jù)庫中檢索ABCB5基因，其匯編ID：ENSG00000004846.16，表達蛋白為人類ATP結(jié)合蛋白（ABC）轉(zhuǎn)運體超家族的成員之一，為B組5號成員。編碼的跨膜P型糖蛋白，參與小離子、糖、肽及復雜有機分子等的ATP依賴性跨膜轉(zhuǎn)運。分型為ABCB5alpha、ABCB5beta及EST422562。

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫設(shè)定相關(guān)檢索條件后檢索該基因在腫瘤及正常組織中的表達，發(fā)現(xiàn)該基因在多種正常組織及腫瘤組織如惡性黑色素瘤組織、乳腺組織及腱鞘組織中均有不同程度的表達，尤其是在惡性黑色素瘤組織中呈高表達。其中條形圖的橫坐標為16種常見腫瘤及成對正常組織。這16種常見腫瘤為：腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）、乳腺癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBC）、多型性成角質(zhì)細胞瘤（GBM）、腎嫌色細胞瘤（KICH）、腎透明細胞癌（KIRC）、腦低級別膠質(zhì)瘤（LGG）、肺腺癌（LUAD）、卵巢癌（OV）、嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）、直腸腺癌（READ）、皮膚惡性黑色素瘤（SKCM）、睪丸癌（TGCT）、胸腺瘤（THYM）和子宮癌肉瘤（UCS）。條形圖的縱坐標高度代表這些腫瘤類型或正常組織中基因表達量的中位數(shù)。惡性黑色素瘤中基因表達中位數(shù)為：9.970，皮膚正常組織中基因表達中位數(shù)為0.290。乳腺組織中基因表達中位數(shù)為1.570，乳腺癌組織中基因表達中位數(shù)為0.070。睪丸癌中基因表達中位數(shù)為0.150，正常睪丸組織中基因表達中位數(shù)為0.56。見圖1A。

針對惡性黑色素瘤及正常組織，單獨進行單一腫瘤類型分析發(fā)現(xiàn)，該數(shù)據(jù)庫中共有腫瘤標本數(shù)據(jù)461例，正常組織標本數(shù)據(jù)558例。經(jīng)分析在惡性黑色素瘤中該基因為高表達，與正常皮膚組織中有顯著統(tǒng)計學差異。見圖1B。

圖1 ABCB5基因在不同腫瘤及惡性黑色素瘤相關(guān)組織中的表達

2.2 惡性黑色素瘤相關(guān)差異性基因表達 人類染色體中目前發(fā)現(xiàn)與惡性黑色素瘤相關(guān)的基因共有6457條。其中過表達基因為2456條，低表達基因為3911條。依據(jù)GRCh38.p2（NCBI）中的基因位點信息，進行分布標記。見圖2。

圖2 人類染色體中惡性黑色素瘤相關(guān)基因及定位

2.3 ABCB5基因在惡性黑色素瘤不同病理分期中的差異性表達 依據(jù)惡性黑色素瘤不同的病理分期，相關(guān)檢索結(jié)果顯示，0期標本中ABCB5基因的表達明顯低于其他各期標本，但是腫瘤標本的各個病理分期之間沒有明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。但從標本分布的小提琴圖上可以看出一些特殊的分布趨勢。見圖3。

圖3 ABCB5基因在惡性黑色素瘤不同病理分期中的表達

2.4 惡性黑色素瘤患者生存分析 惡性黑色素患者中，高表達ABCB5基因患者（n=117）的總生存期與低表達ABCB5基因患者（n=342）之間沒有統(tǒng)計性差異（P=0.19），但從圖表中看出這種生存期存在差異的趨勢（見圖4A）。將數(shù)據(jù)庫中的患者資料按照性別、體重等因素進行分解比較，不同基因表達組之間無統(tǒng)計學差異（見圖4B-4C）。不同種族之間，亞洲地區(qū)高表達標本僅有4例，低表達標本僅有8例，由于數(shù)據(jù)標本量太少，其P值無法進行統(tǒng)計分析（圖4D）。

圖4 ABCB5基因表達水平對惡性黑色素瘤患者中生存期的影響

2.5 ABCB5基因甲基化在惡性黑色素瘤中的表達分析 基因的甲基化水平與基因的功能活性呈負相關(guān)，基因甲基化水平的β值范圍為0～1，0表示沒有甲基化，1表示完全甲基化。一般認為，高甲基化水平β值為0.7～0.5，而低甲基化水平為0.3～0.25。

無論是基于腫瘤臨床分期還是轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)數(shù)量，在正常組織、原發(fā)腫瘤組織、轉(zhuǎn)移性腫瘤組織、不同臨床分期腫瘤組織、不同程度轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織、不同性別、體重及種族之間，β值平均在0.8附近，ABCB5基因的甲基化平均水平?jīng)]有統(tǒng)計學差別（P＞0.05）。然而在正常組織中，雖然標本數(shù)量只有2例，但是基因甲基化的水平卻集中為0.82，而對于腫瘤組織來說，甲基化水平卻差異較大，數(shù)值范圍廣。在原發(fā)病灶中，甲基化水平范圍為0.55～0.95，轉(zhuǎn)移性病灶中甲基化水平范圍為0.45～0.96（圖5A）。Ⅰ期患者甲基化水平為0.35～0.95，二期患者甲基化水平為0.48～0.96，三期患者甲基化為0.47～0.95，Ⅳ期患者甲基化水平為0.5～0.87（圖5B）。不同性別患者之間腫瘤細胞ABCB5基因甲基化水平無明顯差異，也僅僅表現(xiàn)為數(shù)值范圍廣，與腫瘤分期相似（圖5C）。同時我們分析不同轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織腫瘤甲基化水平、不同體重及與不同TP53突變基因之間的關(guān)系時，同樣發(fā)現(xiàn)了甲基化水平具有相似性，這些數(shù)據(jù)之間的關(guān)系時相互印證的（圖5D、E、F）。

圖5 ABCB5基因甲基化在惡性黑色素瘤中的表達

2.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析 設(shè)置相關(guān)參數(shù)后檢索結(jié)果顯示共有10個蛋白與ABCB5基因蛋白形成上下游關(guān)系，且這些蛋白之間也存在復雜的相關(guān)作用關(guān)系。檢測數(shù)據(jù)顯示與ABCB5基因關(guān)系最為密切的SLC22C14、KDM5B及CD44。SLC22C14屬于溶質(zhì)轉(zhuǎn)運家族，主要表達在肝臟和腎臟細胞中，與物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)運相關(guān)。KDM5B是一種組蛋白去甲基化酶，是KDM5基因4種亞型中的一種，參與表觀遺傳調(diào)控過程，與腫瘤等疾病有密切關(guān)系。CD44主要參與淋巴細胞的激活，與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。已在人類各種惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)CD44普遍存在，CD44在惡性腫瘤組織中陽性表達率高低不一，但陽性表達者較易發(fā)生脈管浸潤和遠處轉(zhuǎn)移，陽性表達者無瘤生存期短，生存率低，預后差。這些基因不但與ABCB5基因之間存在復雜的相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，而且這三個基因與其他基因之間也存在復雜的相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，這使得這些基因之間的關(guān)系變得非常復雜（圖6）。這也暗示ABCB5基因在惡性黑色素瘤中參與了多個細胞信號通路，提示ABCB5在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸等方面的作用。這可以作為未來我們進一步研究此基因的方向。

圖6 ABCB5基因蛋白質(zhì)的上下游調(diào)控蛋白及蛋白質(zhì)間的相互調(diào)控作用

3 討論

惡性黑色素瘤是一種惡性度高、治療難度大的腫瘤，臨床治療效果欠佳，易出現(xiàn)復發(fā)及轉(zhuǎn)移［11］。治療方法包括局部手術(shù)、肢體隔離熱灌注化療術(shù)、全身化療、分子靶向治療及免疫治療等，療效及毒副反應得到深入研究［12］。ABCB5基因在腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥性等方面起到非常重要的作用［13］。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘的方法，揭示ABCB5基因是惡性黑色素瘤細胞中高度特異性表達的基因之一，在惡性黑色素瘤細胞中參與多條細胞信號通路，所起的作用非常復雜。

目前針對惡性黑色素瘤基因開發(fā)的相關(guān)藥物也很多，在臨床上也取得了一定的療效［14］。針對惡性黑色素瘤的靶向藥物也已應用于臨床，但臨床療效有待進一步提高。因此，選擇合適的基因開發(fā)新的靶向藥物成為惡性黑色素瘤治療的一個方向。本研究結(jié)果顯示，ABCB5基因與惡性黑色素瘤組織的相關(guān)性非常高，因此推斷該基因在惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中有重要的生物學作用，其可作為惡性黑色素瘤研究的重要切入點與突破口，成為特異性基因的選擇對象。同時惡性黑色素瘤細胞相關(guān)基因數(shù)量非常龐大，惡性黑色素瘤的發(fā)病機制非常復雜，可能涉及多個相關(guān)基因的相互作用，因此可以再找出一些其他相關(guān)性及特異性較高的基因，作為靶點，開發(fā)出更有效的新型藥品。

本研究結(jié)果中，盡管在各腫瘤病理分期之間，ABCB5基因的表達中位數(shù)在統(tǒng)計學上沒有顯著性差異，然而從標本分布的小提琴圖上可以看出一些特殊的分布趨勢。0期標本中基因表達呈現(xiàn)錐形，隨著病理分期的增大，逐漸呈現(xiàn)出葫蘆狀分布，低表達標本數(shù)量存在，同時高表達標本數(shù)量也較多，出現(xiàn)向兩極分化的趨勢。并且這一結(jié)果與基因甲基化水平在不同病理分期及轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中的結(jié)果相一致，提示我們ABCB5基因的表達與惡性黑色素瘤分期的關(guān)系是非線性的，它們之間存在復雜的關(guān)系。這種特殊關(guān)系成為我們研究的重點方向，對這種現(xiàn)象的解讀，成為理解和分析惡性黑色素瘤與ABCB5基因關(guān)系的突破口。這也成為我們下一步研究的任務。

在腫瘤的治療中，ABCB5基因與化療的耐藥性關(guān)系緊密。研究表明，ABCB5基因是惡性黑色素瘤化療耐藥的一個關(guān)鍵因素［15］。本研究顯示，惡性黑色素瘤患者的生存期與ABCB5基因表達沒有相關(guān)性。但是針對這一并不滿意的結(jié)果，我們猜測是否存在一種可能，即經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)ABCB5基因高表達的患者，在接受治療時并未使用化療藥物，而是直接采用生物治療或者靶向藥物治療，導致在臨床療效中無論ABCB5基因是否高表達，都能取得較好療效，使其總生存期并沒有統(tǒng)計學差異，相關(guān)臨床數(shù)據(jù)目前較少。肢體隔離熱灌注化療術(shù)在治療惡性黑色素瘤時，是否能影響此基因的表達變化，還不得而知。本研究計劃在下一步，通過肢體隔離熱灌注化療術(shù)治療惡性黑色素瘤對腫瘤相關(guān)ABCB5基因的調(diào)節(jié)，再次仔細挖掘并分析其中的可能原因，這也為將來的研究提供一個研究方向。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個復雜的過程，涉及多個基因和因素［16］。ABCB5是轉(zhuǎn)錄因子MITF的直接靶標，并且它的表達可由MITF的關(guān)鍵激活劑和輔助因子β-catenin誘導［17］。同時ABCB5也可控制IL1β分泌，通過IL1β/IL8/CXCR1細胞因子信號傳導回路維持慢速循環(huán)的化學耐藥細胞［18］。由于其可能涉及多個相關(guān)基因信號通路，這也可能是造成惡性黑色素瘤治療效果不佳，個體差異較大并且容易出現(xiàn)耐藥等現(xiàn)象的原因之一。本研究通過蛋白質(zhì)相互網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)SLC22C14、KDM5B及CD44與ABCB5基因關(guān)系最為密切，且還與其他基因之間存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，說明這些基因之間的關(guān)系非常復雜。SLC22C14、KDM5B及CD44分別與腫瘤細胞的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸相關(guān)。這些相關(guān)基因及蛋白，也可以成為我們進一步研究的目標。并且隨著對ABCB5基因研究的深入，有助于進一步了解惡性黑色素瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移及耐藥的機制，為惡性黑色素瘤的診療提供新的方向。

鑒于我們采取的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，僅僅是通過統(tǒng)計主要數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的數(shù)據(jù)資料，然而這些資料數(shù)量有限，并且沒有進行更為細致的分層分析處理，因此目前難以看到其之間的相互關(guān)系。此外，應該注意的是，此次數(shù)據(jù)挖掘選擇的相關(guān)數(shù)據(jù)庫都是以TCGA標本為基礎(chǔ)，采用數(shù)據(jù)庫中的工具分析數(shù)據(jù)，具有簡單、方便容易操作等優(yōu)勢，但是其分析工具較為單一，難以發(fā)現(xiàn)更深層的問題。我們計劃在下一步的研究中，運用神經(jīng)網(wǎng)絡、大數(shù)據(jù)及人工智能等新的技術(shù)，可能能更準確科學地揭示ABCB5基因與惡性黑色素瘤間的內(nèi)在關(guān)系，為今后研究提供思路和方向。