雷栓虎 郭麗 管曉鸝 許少策 岳海源 劉京升 汪玉良 張霞

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省婦幼保健醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

臨床工作中，神經(jīng)外科醫(yī)師和骨科醫(yī)師經(jīng)常發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)損傷伴骨折的患者，其骨折愈合速度明顯快于普通骨折患者，甚至在周圍軟組織中出現(xiàn)異位骨化現(xiàn)象，這種異常骨痂形成現(xiàn)象的具體機(jī)制目前并不完全清楚?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多因子與此現(xiàn)象有關(guān)，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFRs）參與了機(jī)體骨骼的生長發(fā)育過程［1］。

已經(jīng)明確的FGFRs有四種［2］，其中FGFR3的異常表達(dá)與一些骨骼遺傳病有著密切的關(guān)系，研究表明，F(xiàn)GFR3在失神經(jīng)狀態(tài)下會(huì)過度表達(dá)［3］，這與失神經(jīng)骨折生成大量低性能病理性骨痂有密切聯(lián)系。目前關(guān)于FGFR3與失神經(jīng)骨折病理性骨痂二者之間關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探索FGFR3是否參與失神經(jīng)骨折愈合過程中病理性骨痂的形成。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雌性大鼠，體重180～250g，6～8周齡，SPF級(jí)，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK甘2013-0002），動(dòng)物保護(hù)協(xié)議經(jīng)《蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用倫理委員會(huì)》批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立。將36只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組各18只。實(shí)驗(yàn)組術(shù)前大鼠腹腔注射FGFR3阻滯劑PD173074，1mg/kg·d，連用3d［4］。10%水合氯醛麻醉，俯臥位固定于木板上。逐層暴露至T10脊髓節(jié)段，咬除椎板，顯露脊髓，尖刀橫斷脊髓4mm。然后關(guān)閉切口，無菌紗布包扎。在完成T10脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后，右脛骨消毒后逐層切開至脛骨弓狀緣，于脛骨中段橫形截?cái)啵?.8mm克氏針固定，切口沖洗后關(guān)閉。術(shù)后，對(duì)大鼠后肢石膏固定。每天早晚各擠尿1次，直到大鼠恢復(fù)自主排尿功能。對(duì)照組術(shù)前注射等量生理鹽水，按照上述相同方法制備脊髓損傷合并脛骨骨折模型。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模結(jié)束后由兩位資深實(shí)驗(yàn)員對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組動(dòng)物按照TARLOR進(jìn)行雙盲評(píng)分［5］，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：下肢完全癱瘓；1級(jí)：可察覺的下肢關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)；2級(jí)：下肢可自由運(yùn)動(dòng)，但不能負(fù)重；3級(jí)：下肢可負(fù)重但無法行走；4級(jí)：可行走，僅有輕度障礙；5級(jí)：能正常行走。

1.2.3 骨痂寬度測量及評(píng)分。術(shù)后分別于第1、2、3、4周對(duì)所有大鼠麻醉后拍射脛骨正、側(cè)位X片，了解克氏針的位置和骨折部位愈合情況。同時(shí)由兩位資深放射科醫(yī)生使用游標(biāo)卡尺（精確度0.01mm）測量患側(cè)骨痂寬度并評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：沒有骨痂；1分：少量骨痂；2分：正常骨痂；3分：過量骨痂。

1.2.4 標(biāo)本取材。術(shù)后第1、2、3、4周以腹腔過量注射麻醉法處死大鼠，在骨痂周圍1cm處剪斷脛骨，脫鈣后石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

1.2.5 Masson三色法染色。骨痂纖維化定量分析，觀察骨折愈合過程骨痂成熟變化。Masson三色法染色：肌肉纖維呈現(xiàn)紅色（麗春紅和酸性品紅作用），膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)色（被苯胺藍(lán)所作用），纖維越成熟染色越深。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型狀況 造模成功后實(shí)驗(yàn)SD大鼠即表現(xiàn)為截癱癥狀，各組大鼠的后肢感覺、運(yùn)動(dòng)功能均喪失，出現(xiàn)尿潴留、大便困難等脊髓損傷表現(xiàn)。圖1A顯示造模前正常SD大鼠，圖1B顯示造模成功后SD大鼠，表現(xiàn)出后肢運(yùn)動(dòng)功能喪失截癱癥狀。圖2為克氏針固定脛骨骨折。

圖1 正常SD大鼠與SCI大鼠

圖2 克氏針固定脛骨骨折

2.2 TARLOR評(píng)分 術(shù)后兩組大鼠TARLOR評(píng)分結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組TARLOR評(píng)分0級(jí)的大鼠17只，1級(jí)的大鼠1只；對(duì)照組TARLOR評(píng)分0級(jí)的大鼠16只，1級(jí)的大鼠2只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均達(dá)到了要求。

2.3 X線攝片 術(shù)后7天X線片顯示骨折固定良好，但骨折線清晰可見，無骨痂形成（圖3-A、3-B）；術(shù)后21天，骨折斷端可見大量骨痂形成，實(shí)驗(yàn)組大鼠骨折基本愈合，骨性連接形成（圖4-A），對(duì)照組大鼠骨折也基本愈合，但骨連接尚不牢固（圖4-B）。

圖3 術(shù)后7天X線片表現(xiàn)

圖4 術(shù)后21天X線片表現(xiàn)

2.4 骨痂纖維化定量分析 使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定纖維組織和新生骨占視野面積的百分比（纖維率）。術(shù)后7天，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組可見少量成骨細(xì)胞，骨小梁纖細(xì)伴有大量膠原（圖5-A）；術(shù)后21天，兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨折斷端成骨細(xì)胞及骨小梁顯著增多，但實(shí)驗(yàn)組骨折愈合明顯快于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組骨纖維和骨細(xì)胞更加成熟，數(shù)量更多（圖6-A），兩組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 術(shù)后7天Masson三色法染色（×100）

圖6 術(shù)后21天Masson三色法染色（×100）

3 討論

在前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)脊髓損傷大鼠合并骨折時(shí)，其骨折愈合快，骨折周圍有大量骨痂形成，但其結(jié)構(gòu)紊亂、骨小梁排列松散，且實(shí)驗(yàn)證明這些大量生成的病理性骨痂生物強(qiáng)度并不與其體積成正比［6］。然而由于影響因素眾多，目前尚不清楚其發(fā)生的具體機(jī)制。為了研究該現(xiàn)象的病理機(jī)制，本次實(shí)驗(yàn)我們依然選用大鼠作為研究對(duì)象，進(jìn)一步探討影響失神經(jīng)骨折修復(fù)的相關(guān)因素。

Takahashi Y等［7］在大鼠脊髓橫斷后測量脛骨血流量，發(fā)現(xiàn)骨折區(qū)血供增加，這可能與脊髓損傷后骨折快速愈合有關(guān)，在受傷后階段，神經(jīng)系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)信號(hào)影響著成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活動(dòng)，對(duì)失神經(jīng)骨折發(fā)病機(jī)制有很大影響。

盡管我們之前的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）治療失神經(jīng)骨折取得了一定療效，對(duì)失神經(jīng)骨折病理性骨痂的愈合有積極正向作用，但是仍然有許多問題尚未解決，例如移植治療的具體機(jī)制、移植細(xì)胞的遷移歸化，細(xì)胞間的相關(guān)作用、機(jī)體免疫學(xué)改變以及后期干細(xì)胞瘤性改變等［8］。

FGFR3于1993年由國外學(xué)者Keegan等克隆。FGFR3主要參與軟骨內(nèi)成骨，對(duì)骨的修復(fù)與重建有著重要作用［9］。Deng CX［10］在FGFR3基因敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)，小鼠骨組織發(fā)育異常，骨骼過度生長，Su N［11］等在研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3主要在骨折斷端的軟骨細(xì)胞中表達(dá)。這些研究結(jié)果均表明FGFR3對(duì)小鼠的骨骼發(fā)育和重建具有重要意義，其作用可能是通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖活化及凋亡來影響骨折的愈合重建［12］。

有關(guān)FGFR3信號(hào)傳導(dǎo)通路的最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3可以激活Ras-MAPK通路而發(fā)揮作用［13］，成纖維細(xì)胞生長因子與成纖維細(xì)胞生長因子受體結(jié)合，磷酸化被激活，觸發(fā)鈣離子釋放，通過改變細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子濃度，從而影響骨質(zhì)礦化及鈣鹽沉積［14-17］。

失去正常神經(jīng)支配的骨折，其愈合過程中產(chǎn)生的骨痂結(jié)構(gòu)并不完整，骨小梁稀疏、排列紊亂，生物力學(xué)性能明顯不足［18］。

本次實(shí)驗(yàn)中，通過造模我們成功得到了脊髓損傷并脛骨骨折的大鼠模型，通過術(shù)后7天、21天的X攝片和Masson三色法染色定量分析骨痂纖維化程度，結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組骨折修復(fù)較對(duì)照組好，兩組大鼠脛骨組織纖維率有明顯差別。

此次試驗(yàn)中我們給予實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射FGFR3阻滯劑PD173074干擾FGFR3的正常表達(dá)，對(duì)照組予以等量生理鹽水注射，通過對(duì)比兩組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)X線及骨痂纖維化定量分析結(jié)果，我們認(rèn)為：實(shí)驗(yàn)組大鼠骨折部位的愈合速度相比對(duì)照組快，成熟骨痂較對(duì)照組多，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后21天基本恢復(fù)了骨組織的正常形態(tài)。

綜上所述，在大鼠脊髓損傷并骨折愈合過程中，F(xiàn)GFR3影響機(jī)體正常成骨過程，抑制FGFR3能夠促進(jìn)骨小梁和骨細(xì)胞的再生，加快骨化進(jìn)程，促使骨痂盡快成熟。