陳汀，成旭東，胡芳，陳婷，朱慧，唐樑

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，蘇州 215009）

扶正膠囊是蘇州市中醫(yī)醫(yī)院自行研發(fā)的醫(yī)院制劑，依據(jù)中醫(yī)“扶正培本”“扶正驅(qū)邪”“正氣存內(nèi)，邪不可干”的治療理論，由本院名老中醫(yī)何煥榮主任開發(fā)，采用生黃芪、西洋參粉和冬蟲夏草菌絲粉3味飲片組方而成。方中黃芪味甘、性溫，具有補(bǔ)氣升陽，固表止汗的功效，中國近代著名中西匯通派醫(yī)家張錫純認(rèn)為黃芪“補(bǔ)氣之功最優(yōu)，故推之為補(bǔ)藥之長”。[1]西洋參味甘、性涼，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津的功效?！皩τ萌藚ⅲ皇苋藚⒅疁匮a(bǔ)者，皆可用其代之?！币虼?，其與黃芪配伍可以中和黃芪的溫補(bǔ)之性，并增強(qiáng)補(bǔ)氣的功效。冬蟲夏草味甘、性平，具有補(bǔ)腎益肺，止血化痰的功效，3味藥共用可以共同增強(qiáng)該方益氣補(bǔ)腎的功效。

扶正膠囊作為本院自制制劑在臨床應(yīng)用已十余年，2020年臨床應(yīng)用55 000余盒，具有益氣補(bǔ)腎的功效，主要適用于免疫功能低下、疲勞綜合征及慢性疾病恢復(fù)期等疾病和證候。本院臨床研究表明扶正膠囊在用于治療肺癌癌因病疲乏和配合穴位敷貼治療穩(wěn)定期肺腎兩虛型慢性阻塞性肺病方面均具有較好的臨床療效[2-3]。

本實驗采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)建立小鼠免疫功能低下模型[4-6]，通過測定扶正膠囊提取物對小鼠單核細(xì)胞吞噬能力、胸腺和脾臟指數(shù)、血清中細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）含量及脾T淋巴細(xì)胞亞群CD3+T淋巴細(xì)胞（CD3+）、CD4+T 淋巴細(xì)胞（CD4+）與 CD8+T淋巴細(xì)胞（CD8+）的分布及比例等多個免疫學(xué)評價指標(biāo)，來考察扶正膠囊提取物對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，旨在探討扶正膠囊提取物的免疫調(diào)節(jié)活性，為該制劑的深入研究開發(fā)和免疫機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF清潔級的KM小鼠60只，雄性，體質(zhì)量（18±2）g，購自上海靈暢生物科技有限公司，質(zhì)量檢測單位為蘇州西山生物科技有限公司，動物許可證號SCK（滬）2018-0003。分籠飼養(yǎng)，每組10只，實驗前正常進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。

1.2 藥物與試劑 生黃芪（批號：210130，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）、西洋參粉（批號：200422，產(chǎn)地：加拿大）、蟲草被孢菌粉（批號：210324，產(chǎn)地：江蘇）均購置蘇州市天靈中藥飲片有限公司。

環(huán)磷酰胺（批號：0E385A），德國 Baxter Oncology Gmbh公司；香菇多糖（批號：B24117，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），由上海源葉生物科技有限公司提供；小鼠 IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α 和 IFN-γ ELISA 試劑盒，購于江蘇晶美生物科技有限公司；印度墨汁（批號：0326A21），江蘇艾迪生生物科技有限公司；PBS（批號：8120015），ANTI-MO CD3e PE（批號：2172537），ANTI-MO CD4 FITC （批號：2007709），ANTI-MO CD8A APC（批號：2087760），均購置于賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 主要儀器 ME55型分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；紫外-可見分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司；KDC-140HR高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；流式細(xì)胞儀，美國BD公司；MQT-60R臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；Thermo Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀，北京昊諾斯科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 扶正膠囊提取物的制備 按扶正膠囊處方取適量飲片，按處方生產(chǎn)工藝制備扶正膠囊內(nèi)容物細(xì)粉；根據(jù)內(nèi)容物質(zhì)量，取10倍量純化水，煎煮2次，每次1 h，合并2次煎液，濃縮至一定體積，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 實驗動物的分組及干預(yù)方法 將60只SPF級的小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組10只（組別為空白組、模型組、扶正膠囊提取物低、中、高劑量組以及陽性對照組）。

除了空白組外，模型組、扶正膠囊提取物低、中、高劑量組以及陽性對照組各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，每日1次，連續(xù)兩天；空白組小鼠按重量腹腔注射相同量0.9%生理鹽水。

實驗開始的第3天，扶正膠囊提取物低、中、高劑量組小鼠分別灌胃0.75、1.5、3 g（按生藥量計算）/kg濃度的扶正膠囊提取物溶液（相當(dāng)于臨床單日用藥量的1、2、4倍），陽性對照組灌胃60 mg/kg的香菇多糖溶液，模型組和空白組小鼠灌胃等體積的蒸餾水，每日一次，連續(xù)給藥7 d；于末次給藥隔日，取血，處死，分離肝臟、胸腺和脾臟。

1.4.3 碳粒廓清實驗 預(yù)先準(zhǔn)備好比色管，加入0.1%碳酸鈉溶液2 mL，備用；小鼠末次給藥24 h后，經(jīng)尾靜脈注射已按1∶5比例稀釋的印度墨汁，注射劑量為0.1 mL/10 g；尾靜脈注射完成后，分別在注射后的2 min和12 min從眼內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL；分別加入含2 mL濃度為0.1%的碳酸鈉溶液的比色管中；通過紫外-可見分光光度計，于650 nm波長下測定吸光度（OD）值。

先計算碳粒廓清指數(shù) K，K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1），其中OD1值和OD2值分別為2min和12min時取出的血液樣本所測得的OD值；然后再計算吞噬指數(shù) α，α=K1/3×（體質(zhì)量/肝臟和脾臟質(zhì)量）[3]。

1.4.4 臟器指數(shù)測定 脫頸椎處死小鼠后，解剖取小鼠脾臟和胸腺，用濾紙吸盡表面血漬，分別稱量臟器質(zhì)量，計算脾臟（胸腺）指數(shù)。脾臟（胸腺）指數(shù)=脾臟（胸腺）質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（mg）。

1.4.5 血清中 IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α 和 IFN-γ水平檢測 各組小鼠血液樣本經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心處理（轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10 min），分離血清。取血清樣本，采用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書中的操作步驟逐步操作，測定血清中 IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α 和 IFN-γ 的含量。

1.4.6 脾臟淋巴細(xì)胞及其亞群分布檢測 無菌條件下分離小鼠脾臟，取無菌培養(yǎng)皿，采用組織研磨法分離小鼠脾臟，制備小鼠脾細(xì)胞懸液；采用細(xì)胞計數(shù)板，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/mL。每組樣品分別取細(xì)胞懸液 100 μL，分別加入單克隆抗體CD3+-PE、CD4+-FITC、CD8+-APC 2.5 μL 標(biāo)記細(xì)胞，避光保存 30 min，在 250×g、4℃條件下離心5 min，離心后棄去上清液，加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS），吹打混勻細(xì)胞后按上述條件離心，離心后再次棄去上清液，加入2 mL PBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測樣本，根據(jù)檢測結(jié)果計算各樣本中T細(xì)胞中CD3+CD4+與CD3+CD8+細(xì)胞亞群比例。

1.4.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件統(tǒng)計，數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多個組間的數(shù)據(jù)比較將采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)間的比較將采用LSD-t檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 扶正膠囊提取物對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響 與空白組結(jié)果相比，模型組的小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低（P<0.01）；與模型組結(jié)果相比，香菇多糖陽性對照組的小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著升高（P<0.01），扶正膠囊提取物低劑量組的脾臟指數(shù)明顯升高（P<0.05），中劑量組的脾臟指數(shù)呈顯著升高（P<0.01），高劑量組的脾臟指數(shù)呈顯著升高（P<0.01）胸腺指數(shù)呈明顯升高（P<0.05），表明扶正膠囊提取物可以逆轉(zhuǎn)由環(huán)磷酰胺所致的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低。見表1。

表1 扶正膠囊提取物對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響（±s）

表1 扶正膠囊提取物對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組動物數(shù)1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0胸腺指數(shù)（m g/g）- 3.9 6 3±0.1 9 6 2.4 7 1±0.1 4 6- 2.9 1 9±0.1 9 2** 1.8 1 1±0.1 5 2**6 0.0 m g/k g 3.2 1 7±0.2 3 9## 2.2 8 0±0.1 8 1##0.7 5 g/k g 3.1 7 8±0.2 6 0# 1.8 7 9±0.1 1 7 1.5 g/k g 3.3 1 4±0.2 8 5## 1.9 0 6±0.1 0 3 3.0 g/k g 3.5 2 4±0.2 4 8## 1.9 4 6±0.1 1 0#劑量 脾臟指數(shù)（m g/g）

2.2 扶正膠囊提取物對小鼠單核細(xì)胞吞噬能力的影響 與空白組結(jié)果相比，模型組小鼠的廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α均呈顯著性降低（P<0.01）；與模型組結(jié)果相比，香菇多糖陽性對照組小鼠的廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α均呈明顯升高（P<0.05），扶正膠囊提取物中、高劑量組小鼠的廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α均呈明顯升高（P<0.05），且與扶正膠囊提取物的劑量呈正相關(guān)，說明扶正膠囊提取物可以明顯提高小鼠的單核細(xì)胞吞噬功能。見表2。

表2 扶正膠囊提取物對小鼠單核細(xì)胞吞噬能力的影響（±s）

表2 扶正膠囊提取物對小鼠單核細(xì)胞吞噬能力的影響（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組動物數(shù)1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0廓清指數(shù)K 吞噬指數(shù)α 0.0 3 5 3±0.0 0 4 7 6.6 8 9±0.3 1 5 0.0 2 4 8±0.0 0 2 1** 6.0 8 2±0.1 7 3**0.0 2 7 6±0.0 0 2 8# 6.2 5 8±0.2 0 0#0.0 2 7 1±0.0 0 1 7# 6.2 2 9±0.1 4 8 0.0 2 7 5±0.0 0 1 4# 6.2 4 7±0.1 0 9#0.0 2 8 3±0.0 0 3 7# 6.2 8 9±0.2 5 8#

2.3 扶正膠囊提取物對血清中IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α和IFN-γ水平的影響 與空白組結(jié)果相比，模型組血清中的IL-4和IFN-γ水平顯著降低（P<0.05，P<0.01）、IL-17和 TNF-α 水平顯著增高（P<0.01）。與模型組結(jié)果相比，香菇多糖陽性對照組血清中的IL-4與IFN-γ水平明顯增高（P<0.05），IL-17和TNF-α水平明顯降低（P<0.05）；與模型組結(jié)果相比，扶正膠囊提取物低、中、高劑量組均能顯著提升小鼠血清中的IL-4、IL-10和IFN-γ水平（P<0.01），并顯著降低小鼠血清中的IL-17和TNF-α水平（P<0.01），以上數(shù)據(jù)分析說明扶正膠囊提取物可以促進(jìn)免疫抑制小鼠體內(nèi)的IL-4、IL-10和IFN-γ表達(dá)，抑制IL-17和TNF-α表達(dá)，見表3。

表 3 扶正膠囊提取物對小鼠血清 IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影響（±s）pg/mL

表 3 扶正膠囊提取物對小鼠血清 IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影響（±s）pg/mL

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組動物數(shù)6 6 6 6 6 6 I L-4 I L-1 0 I L-1 7 T N F-α I F N-γ 1 6 4.4 7±2 1.8 2 3 8 6.4 1±1 2.4 1 2 3.4 9±0.8 0 1 0 7 2.4 1±4 5.2 1 2 0 9 1.7 8±3 9.8 9 1 5 2.2 0± 2.9 4* 3 8 1.4 2± 4.4 2 3 1.1 2±1.4 5** 1 7 6 0.4 4±1 6.4 9** 1 9 3 5.4 9±1 8.4 1**1 7 5.7 4±2 2.5 2# 3 9 4.5 5±1 0.3 9 1 7.6 2±2.1 1# 1 1 5 9.4 7±3 2.8 1# 2 0 0 1.0 4±1 8.9 1##1 7 1.4 7±1 5.3 5## 5 7 5.4 5± 8.4 9## 2 2.8 7±1.6 6## 1 2 6 1.3 1±3 7.4 7## 2 0 8 6.4 1± 9.8 9##1 7 2.3±1 1.4 4## 4 0 2.4 4± 3.3 6## 2 1.9 1±0.9 9## 1 4 0 1.4 1±3 8.8 8## 2 2 6 5.1 8±1 0.1 3##1 8 8.1 3±1 2.3 2## 4 4 4.8 2± 6.6 4## 1 8.9 1±2.0 1## 1 4 3 5.1 9±1 7.4 1## 2 2 0 6.2 9±4 0.1 1##

2.4 扶正膠囊提取物對脾淋巴細(xì)胞CD3+CD4+與CD3+CD8+比值的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，與空白組相比，模型組的CD3+CD4+細(xì)胞表達(dá)程度和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值均呈顯著性降低（P<0.01）；與模型組結(jié)果相比，陽性對照組的CD3+CD4+細(xì)胞表達(dá)程度呈顯著性升高（P<0.01），扶正膠囊提取物中劑量組的CD3+CD4+細(xì)胞表達(dá)程度和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值均呈明顯升高（P<0.05），扶正膠囊提取物高劑量組的CD3+CD4+細(xì)胞表達(dá)程度和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值均呈顯著性升高（P<0.01），CD3+CD8+細(xì)胞表達(dá)程度呈明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見表 4、圖 1。

表4 扶正膠囊提取物對脾淋巴細(xì)胞CD3+CD4+與CD3+CD8+表達(dá)的影響（±s）

表4 扶正膠囊提取物對脾淋巴細(xì)胞CD3+CD4+與CD3+CD8+表達(dá)的影響（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

C D 3+C D 4+/C D 3+C D 8+空白組 3 3 3.5 3±0.9 6 7.0 7±0.2 8 4.7 4±0.0 5模型組 3 1 6.8 1±2.5 8** 1 0.4 9±2.5 5 1.7 3±0.7 6**陽性對照組 3 2 4.4 0±1.1 1## 8.7 8±3.1 8 3.0 2±1.0 1低劑量組 3 2 0.7 8±0.5 8 8.6 7±1.2 8 2.4 4±0.4 4中劑量組 3 2 1.8 5±1.5 9# 7.3 3±0.4 5 2.9 8±0.1 9#高劑量組 3 2 4.5 8±0.8 6## 6.2 1±0.2 3# 3.9 6±0.0 9##組別 動物數(shù) C D 3+C D 4+（%）C D 3+C D 8+（%）

圖1 小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群CD3+CD4+與CD3+CD8+分布結(jié)果

3 討論

在保障機(jī)體正常運行的過程中，人體免疫系統(tǒng)有重要地位。人體免疫系統(tǒng)無時無刻在保護(hù)著機(jī)體，抵御著真菌病毒等微生物侵入機(jī)體。當(dāng)機(jī)體的免疫功能處于正常狀態(tài)時，可以抵御外界病原的入侵，預(yù)防疾病的發(fā)生，而當(dāng)人體的免疫功能降低到不足以阻止病原入侵時，就容易患上各種疾病[7]。隨著人們對免疫相關(guān)的研究成果愈加重視，免疫功能相關(guān)的補(bǔ)益產(chǎn)品在改善人們生活質(zhì)量方面就發(fā)揮著越來越重要的角色。中醫(yī)藥在調(diào)動內(nèi)在抗病能力與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力方面有著色彩分明的特色，蘇州中醫(yī)醫(yī)院自行研發(fā)的中成藥扶正膠囊，由名老中醫(yī)何煥榮主任開發(fā)，采用黃芪、西洋參和冬蟲夏草菌絲體共同組方而成，具有益氣補(bǔ)腎的作用，適用與免疫功能低下、疲勞綜合癥及慢性疾病恢復(fù)期等疾病的治療，是一款很好的免疫調(diào)節(jié)類醫(yī)院中藥制劑。

環(huán)磷酰胺作為一種常見的免疫抑制劑，它可以通過殺傷免疫細(xì)胞，從而影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的各個階段而起到免疫抑制作用[8]；可通過腹腔注射或肌肉注射環(huán)磷酰胺，來建立動物免疫抑制模型。本實驗采用環(huán)磷酰胺建立小鼠模型后，與空白組相比，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯降低，小鼠單核細(xì)胞的吞噬功能顯著降低，血清中IL-17和TNF-α水平升高、IL-4和IFN-γ水平顯著降低，脾淋巴細(xì)胞亞群CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值顯著降低，實驗結(jié)果與相關(guān)研究報道一致[9-12]，說明本實驗造模成功。T淋巴細(xì)胞亞群是評價抗腫瘤免疫的重要指標(biāo)。T淋巴細(xì)胞（CD3+）主要分為CD3+CD4+和CD3+CD8+亞群。CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的增加和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比例增加表明T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫水平增強(qiáng)[13]。

扶正膠囊由生黃芪、西洋參、蟲草菌絲粉3味飲片組成，實驗研究表明這三味飲片中的多種成分具均具有免疫調(diào)節(jié)作用，如黃芪中的黃芪甲苷[14]和黃芪多糖[15]，西洋參中的皂苷類成分[16]和西洋參多糖[17]，蟲草菌絲中的蟲草素[18]和蟲草多糖[19]，同時該類飲片聯(lián)合使用較單獨使用具有更好的免疫調(diào)節(jié)作用[20]。本研究結(jié)果表明：扶正膠囊提取物可以逆轉(zhuǎn)由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)降低，提高免疫抑制小鼠的單核細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)免疫抑制小鼠血清中IL-4、IL-10和IFN-γ因子表達(dá)水平，抑制IL-17和TNF-α的表達(dá)水平，提升免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群CD3+CD4+細(xì)胞的表達(dá)程度和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值。說明扶正膠囊提取物可以促進(jìn)機(jī)體免疫器官的恢復(fù)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫相關(guān)功能和指標(biāo)，從而實現(xiàn)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。與陽性對照組對照，扶正膠囊提取物的免疫調(diào)節(jié)作用較好，具有良好的開發(fā)價值，通過本研究為該制劑的深入開發(fā)提供了一定的實驗依據(jù)。