葉亞蘭 孟凡亮 仰杰

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)確診后5年生存率較低，轉(zhuǎn)移是NSCLC最常見(jiàn)的死亡風(fēng)險(xiǎn)，而腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲可以由趨化因子及其受體調(diào)節(jié)[1]。其中CCR9及其天然配體CCL25主要參與免疫穩(wěn)態(tài)，CCR9-CCL25軸涉及結(jié)腸直腸癌、前列腺癌和乳腺癌，癌組織中較高的CCR25表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[2]。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β結(jié)合蛋白-2(LTBP2)是一種可溶于血的多結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。最近報(bào)道了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與LTBP2表達(dá)相關(guān)[3]。研究顯示，CCR9/CCL25對(duì)NSCLC的預(yù)后評(píng)估有一定意義[4]。NSCLC患者血清LTBP2呈高表達(dá)，可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性[5]。本研究擬探討CCL25聯(lián)合LTBP2在NSCLC患者血清中的表達(dá)及在疾病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

一、臨床資料

回顧性分析2018年9月至2021年9月被我院收治的129例NSCLC患者作為觀(guān)察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②年齡≥18歲；③首次發(fā)病、入組前未接受過(guò)化學(xué)藥物及放射治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急性感染性疾??；②入組前已接受放化療等抗腫瘤治療、既往有腫瘤病史；③臨床資料缺失。其中男性90例，女性39例，年齡46～87歲，平均年齡(67.81±10.04)歲，病理類(lèi)型：腺癌66例，鱗癌63例，TNM分期：Ⅰ期～Ⅱ期45例，Ⅲ期～Ⅳ期84例；另將同期129例健康體檢者納入對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)腫瘤病史；②無(wú)重要器官?lài)?yán)重疾病史；③無(wú)其他慢性病史及吸煙酗酒史。其中男性88例，女性41例，年齡52～84歲，平均年齡(71.11±8.46)歲。2組在性別、年齡方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2019ECPJ114)，所有患者在開(kāi)始治療之前，均簽署了書(shū)面知情同意書(shū)。

二、主要試劑與儀器

人CCL25酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒和人LTBP2酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices 公司。

三、檢測(cè)方法

分別采集2組晨起空腹外周靜脈血3～4 mL，室溫靜置30 min，離心后分離上層血清， -80℃保存待測(cè)。嚴(yán)格按照人CCL25和LTBP2酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，首先制備從0到20 ng/mL(0，0.312，0.625、1.25、2.5、5、10和20 ng/mL)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，向每個(gè)孔中加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，37 ℃下孵育2 h，棄去液體后，每孔添加100 μL工作液A，并在37 ℃下再孵育2 h，再次棄去液體后，沖洗3次，然后每孔加入100 μL工作液B，37 ℃孵育30 min，再用350 μL緩沖液洗滌5次后，向每個(gè)孔中添加90 μL基質(zhì)溶液，并在37℃下孵育15～25 min，避光，顯色，然后在405nm處檢測(cè)光密度值(OD)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各樣本濃度，所有樣品均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組血清CCL25和LTBP2水平比較

觀(guān)察組患者血清CCL25和LTBP2水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 兩組血清CCL25和LTBP2水平比較

二、血清CCL25和LTBP2水平與NSCLC患者病理特征的關(guān)系

不同年齡、性別、病理類(lèi)型的NSCLC患者血清CCL25和LTBP2水平間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但不同TNM分期、分化程度及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清CCL25和LTBP2水平間存在顯著性差異(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

三、血清CCL25和LTBP2對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值

ROC曲線(xiàn)結(jié)果顯示，CCL25和LTBP2聯(lián)合診斷NSCLC的曲線(xiàn)下面積為大于單一指標(biāo)，檢測(cè)靈敏度高于單一指標(biāo)(見(jiàn)表3，圖1)。

表3 CCL25和LTBP2對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值

圖1 NSCLC患者血清CCL25和LTBP2水平的ROC曲線(xiàn)分析(a)CCL25；(b)LTBP2；(c)CCL25+LTBP2

討 論

NSCLC是肺癌中最常見(jiàn)的組織類(lèi)型，國(guó)內(nèi)外的發(fā)病率和死亡率均位居前列[7]。近年來(lái)，盡管肺癌的臨床診治方法得到了不斷提高與更新，也開(kāi)始出現(xiàn)新的化療藥物及免疫治療藥物，但患者的整體預(yù)后仍不理想[8]。目前，有關(guān)NSCLC的早期診斷和治療仍是我國(guó)乃至世界范圍需要迫切解決的一個(gè)重要難題。

腫瘤標(biāo)志物是一種化學(xué)類(lèi)物質(zhì)，對(duì)臨床疾病診斷和評(píng)估患者的預(yù)后有著重要意義，近年來(lái)其也獲得了越來(lái)越多的關(guān)注[9]。趨化因子是一個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的小分子肝素結(jié)合蛋白家族，以往的研究已經(jīng)證實(shí)，在趨化因子受體多種癌癥類(lèi)型中，參與腫瘤細(xì)胞的凋亡、轉(zhuǎn)移信號(hào)機(jī)制[10]。研究顯示，CXCR4在NSCLC中高表達(dá)，降低CXCR4表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞向骨髓、淋巴結(jié)或胸膜腔的轉(zhuǎn)移[11]。這些發(fā)現(xiàn)提示了趨化因子/趨化因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)NSCLC轉(zhuǎn)移的潛在影響。腫瘤細(xì)胞能夠利用趨化因子及其相應(yīng)的受體進(jìn)行生存和傳播，并將它們用作尋找繼發(fā)轉(zhuǎn)移部位的導(dǎo)航工具。在所有已知參與包括NSCLC在內(nèi)的不同癌癥進(jìn)展的趨化因子受體中，CXCR4在大多數(shù)癌癥中均為高表達(dá)，并且在原發(fā)性腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。最近的研究還發(fā)現(xiàn)CCR9-CCL25相互作用介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞中PI3K/Akt通路的激活，導(dǎo)致抗凋亡蛋白的上調(diào)，以及以PI3K/Akt依賴(lài)的方式凋亡蛋白的下調(diào)[12]，此外，CCL25/CCR9信號(hào)軸能夠調(diào)節(jié)VEGF-C、VEGF-D、MMP-1和MMP-7的表達(dá)，并可能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[13]。本研究中，與對(duì)照相比，CCL25在NSCLC患者的血清中高度表達(dá)。TNM分期較高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低分化患者預(yù)后普遍較差，本研究中，上述患者的血清CCL25表達(dá)更高，表明CCR9-CCL25軸可能與NSCLC侵襲性有關(guān)，并有望被驗(yàn)證為NSCLC的預(yù)后指標(biāo)。

細(xì)胞外基質(zhì)蛋白是近年來(lái)腫瘤學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，而LTBP2是一種可溶于血的多結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[14]。LTBP2與其他LTBP不同，是唯一不與潛在TGF-β結(jié)合的成員。研究證明LTBP2對(duì)原纖維蛋白1表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力[15]。在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，LTBP2表達(dá)上調(diào)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較差的總生存期相關(guān)[16]。敲除LTBP2可抑制甲狀腺癌細(xì)胞中的磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路減弱。LTBP2在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶中普遍表達(dá)，并且在正常結(jié)腸組織和炎癥性肝病中不存在，這表明LTBP2在結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[17]。在胰腺癌、宮頸癌和漿液性卵巢癌中，也觀(guān)察到LTBP2的高表達(dá)，并且與預(yù)后不良有關(guān)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，觀(guān)察組患者血清LTBP2水平均明顯高于對(duì)照組，提示LTBP2可能在NSCLC中發(fā)揮促癌作用。進(jìn)一步分析LTBP2水平與NSCLC患者病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示不同TNM分期、分化程度及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清LTBP2水平存在顯著性差異，表明LTBP2水平升高與NSCLC轉(zhuǎn)移和惡性程度有關(guān)。

由于CCL25和LTBP2水平升高可能與NSCLC轉(zhuǎn)移和惡性程度有關(guān)，因此我們分析了血清CCL25和LTBP2對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，CCL25、LTBP2、CCL25聯(lián)合LTBP2診斷NSCLC的曲線(xiàn)下面積分別為0.80、0.78、0.85，表明二者聯(lián)合檢測(cè)具有更高的診斷效能。綜上所述，非小細(xì)胞肺癌患者血清中CCL25和LTBP2水平明顯升高，二者可能是潛在的非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)志物。