邵偉偉 鄒琳 蘭建云 劉水 王樹人 黃炎

據(jù)GLOBOCAN 2020全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1]，在世界范圍內(nèi)肺癌位居男性癌癥發(fā)病率及死亡率第一位，女性癌癥發(fā)病率第三位，死亡率第二位，其占癌癥總體死亡率為18.0%,嚴(yán)重危害人們身心健康。隨著人們生活方式的改變、大氣污染的日益嚴(yán)重以及分子檢測水平的提高，在總?cè)巳褐蟹蜗侔┑陌l(fā)病率較其他類型呈顯著上升趨勢，且腺癌更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，本實驗通過研究抑癌基因Smad4、Caveolin-1蛋白在肺腺癌及正常肺組織中的表達(dá)，分析它們與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系，為分子診斷、預(yù)后評估和治療積累臨床數(shù)據(jù)。

資料與方法

一、資料

收集2016年1月-2019年6月鹽城市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的浸潤性肺腺癌標(biāo)本130例，術(shù)式為肺段或肺葉切除，同時取癌周3CM以外正常肺組織作為對照組。所有組織均采用中性福爾馬林固定后常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。全部病例術(shù)前均未行放、化療及靶向治療，均有完整的病歷資料和隨訪記錄，隨訪截止日期為2021年8月。2位高年資病理醫(yī)師重新閱片以進(jìn)一步明確組織學(xué)分級及臨床分期。本實驗通過南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2021-K-88)。

二、方法

1 Smad4、Caveolin-1免疫組化檢測 使用LEICA BOND-MAX全自動免疫組化儀行免疫組化檢測，所用一抗分別為Smad4(兔單抗，克隆號SP306，1 ∶100，Abcam公司)及Caveolin-1(兔單抗，克隆號SP43，1 ∶100，Abcam公司)。SP試劑盒同樣購自Abcam公司。實驗步驟分別按說明書進(jìn)行，用PBS代替一抗處理的切片作為陰性對照片，已知陽性片作為陽性對照片。

2 結(jié)果判斷 Smad4陽性染色定位于細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核中，Caveolin-1陽性染色定位于細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜中，陽性著色均呈淡黃、棕黃或棕褐色。每張切片隨機計數(shù)》500個腫瘤細(xì)胞，著色細(xì)胞≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，>50%計3分；染色強度依據(jù)未著色、著淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計0～3分。將每張切片著色細(xì)胞的數(shù)量和染色強度得分相加進(jìn)行半定量評價，0～1分為(-)，2～3分為(1+)，4～6分為(2+)，>6分為(3+)。

三、統(tǒng)計方法

采用spss11.5統(tǒng)計分析軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。率得比較采用Pearson χ2檢驗和McNemar配對χ2檢驗，應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析兩指標(biāo)間的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，應(yīng)用Log-rank檢驗進(jìn)行比較。檢驗水準(zhǔn)均采用α=0.05。

結(jié) 果

一、臨床病理特征

患者年齡42～89歲，平均年齡(62.75±9.48)歲，男性61例(46.92%)，女性69例(53.08%)，吸煙43例(33.08%)，腫塊中位大小3 cm，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例(29.23%)，發(fā)生在左肺52例(40.00%)，右肺78例(60.00%)。據(jù)2017年國際抗癌聯(lián)盟發(fā)布的第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期71例(54.62%)，Ⅱ期50例(38.46%)，Ⅲ期 9例(6.92%)，根據(jù)顯微鏡下組織學(xué)形態(tài)(乳頭型、微乳頭型、實體型、腺泡型、貼壁型及篩樣型)確定分化程度，其中高分化41例(31.54%)，中分化40例(30.77%)，低分化49例(37.69%)。

二、Smad4、Caveolin-1蛋白在正常肺組織及肺腺癌組織中的表達(dá)

Smad4、Caveolin-1免疫組化陽性表達(dá)(見圖1)，兩者在正常肺組織中的表達(dá)率分別為90.77%(118/130)、96.15%(125/130)，在肺腺癌組織中的表達(dá)率分別為66.15%(86/130)、41.54%(54/130)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001)(見表1)。

三、肺腺癌組織中Smad4、Caveolin-1蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

圖1 Smad4陽性染色定位于細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核中(SP×100)，Caveolin-1陽性染色定位于細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜中(SP×100)

表1 Smad4、Caveolin-1蛋白在正常及肺腺癌組織中的表達(dá)

130例肺腺癌組織中Smad4、Caveolin-1蛋白的表達(dá)均與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度及TNM分期相關(guān)(P均<0.05)，Smad4在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、組織分化差組及高TNM分期組中的表達(dá)顯著下降，Caveolin-1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、組織分化差組及高TNM分期組中的表達(dá)顯著升高。本實驗未發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)與患者性別、年齡、腫塊發(fā)生部位、有無吸煙及腫塊大小有關(guān)(P均>0.05)(見表2)。

表2 Smad4、Caveolin-1的表達(dá)與臨床病理因素間的關(guān)系[n(%)]

四、130例肺腺癌組織中Smad4、Caveolin-1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

本實驗中，兩蛋白共陰性表達(dá)30例，共陽性表達(dá)40例，86例Smad4陽性表達(dá)組中Caveolin-1蛋白陽性表達(dá)率為46.51%(40/86)，44例Smad4陰性表達(dá)組中Caveolin-1蛋白陽性表達(dá)率為31.82%(14/44)，統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.895，P<0.001)(見表3)。

表3 130例肺腺癌組織中Smad4、Caveolin-1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

五、130例肺腺癌組織中Smad4、Caveolin-1蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

通過電話隨訪及門診復(fù)查相結(jié)合獲得130例肺腺癌患者的隨訪資料，隨訪率100%，死亡39例，總中位生存時間31.5個月。Smad4陰性表達(dá)組及陽性表達(dá)組中位生存時間分別為30、39個月，logrank檢驗發(fā)現(xiàn)兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.990，P<0.001)。Caveolin-1陰性表達(dá)組及陽性表達(dá)組中位生存時間分別為42、33個月，logrank檢驗發(fā)現(xiàn)兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.170，P=0.041)(見圖2，3)。

圖2 Smad4陽性與陰性的生存曲線

圖3 Caveolin-1陽性與陰性的生存曲線

130例患者中有128例進(jìn)行了EGFR基因檢測，其中78例檢測出有存在18/19/20/21號外顯子突變，術(shù)后有43例接受了酪氨酸激酶抑制劑治療，71例接受了化療、放療和(或)抗血管生成藥物治療，16例未接受任何治療。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Smad4、Caveolin-1陽性表達(dá)組的患者術(shù)后接受輔助治療的預(yù)后顯著優(yōu)于未治療組(P均<0.001)(見表4，5)。

表4 術(shù)后未治療組及治療組間Smad4陽性表達(dá)患者的預(yù)后[n(%)]

表5 術(shù)后未治療組及治療組間Caveolin-1陽性表達(dá)患者的預(yù)后[n(%)]

討 論

肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移涉及到復(fù)雜的分子機制，近年來靶向用藥顯著改善了患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，目前已明確EGFR/Braf/Kras/Nras/ALK/ROS1/HER-2/PIK3A等是靶向用藥的靶基因，但是這些基因的突變并沒有覆蓋整個人群，有報道[2]EGFR的突變在總?cè)巳褐袨?0%～50%，ALK為3%～7%，ROS1僅為1%～3.4%，其它位點則更為罕見，同時還有靶向藥物耐藥的問題，因此有必要研究其它癌基因或抑癌基因。

Smad4蛋白由胰腺癌位點4(deleted in pancreatic carcinoma locus 4，DPC4)編碼，于1996年被首次確認(rèn)為抑癌基因[3]，屬于Smad家族成員之一。Smad家族是一組直接將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核的蛋白，共有8種不同的Smads，其中Smad4是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中樞細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)其在多種實體腫瘤[4-6]中低表達(dá)或缺失表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在肺腺癌中，同樣發(fā)現(xiàn)Smad4缺失表達(dá)的患者預(yù)后較差，是獨立的預(yù)后因子[7]。在本組實驗中我們發(fā)現(xiàn)Smad4在癌周正常肺組織中的表達(dá)率較癌組織顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示Smad4作為抑癌基因，其表達(dá)缺失參與了腫瘤的發(fā)生。TNM分期是評估患者預(yù)后的重要指標(biāo)，涉及到癌細(xì)胞的遷徙能力、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)、促血管增生等過程，我們在分析Smad4與臨床病理因素間關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)隨著癌組織轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)、分化程度降低及TNM分期的升高，其陽性表達(dá)率顯著下降，結(jié)合隨訪結(jié)果，提示Smad4表達(dá)下調(diào)促進(jìn)了肺癌的侵襲性生物學(xué)行為，縮短了患者生存時間。Smad4在肺腺癌中的分子作用機制有以下可能： Takahashi[8]通過對一種抑制TGF-β1的抗過敏藥物(曲尼司特)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的研究發(fā)現(xiàn)，該藥物通過抑制癌細(xì)胞中Smad4的表達(dá)進(jìn)而抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，證實了TGF-β/Smad4信號通路在癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移過程中的作用。 Smad4通過形成同源或異源絡(luò)合物，轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控TGF-β的轉(zhuǎn)錄，而TGF-β可誘導(dǎo)新生血管的形成和抑制腫瘤組織內(nèi)部及周圍的細(xì)胞免疫反應(yīng)，Smad4表達(dá)的下調(diào)，減弱了對TGF-β的調(diào)控，降低了腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)，促進(jìn)了血管新生。 TGF-β/Smad4信號通路是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要信號通路之一，通過啟動和轉(zhuǎn)導(dǎo)上皮細(xì)胞表面受體結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響上皮間質(zhì)化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增和惡性進(jìn)展。

小窩蛋白(Caveolae)又稱胞膜窖，是細(xì)胞膜表面富含鞘脂和膽固醇的特異性的內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu)，廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞中，與分子運輸、細(xì)胞粘附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。小窩蛋白1(Caveolin-1)為其結(jié)構(gòu)蛋白，是形成內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu)所必不可少的，位于7號染色體上，有三個外顯子，其架構(gòu)區(qū)具有激酶抑制活性，能夠抑制內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)、Raf、G蛋白、c-Src酪氨酸激酶、MEK21和ERK22等因子活性[9]，從而參與多種細(xì)胞事件如免疫反應(yīng)、胞吞作用、膜轉(zhuǎn)運、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[10]。其在腫瘤中的表達(dá)情況文獻(xiàn)報道不一致，有報道在結(jié)直腸癌、卵巢癌中表達(dá)下調(diào)[11-12]，而在宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肝細(xì)胞肝癌、前列腺癌、胰腺癌中表達(dá)上調(diào)[13-15]。Shimizu[16]和Eleonora[17]分別通過對412例和116例肺腺癌組織及細(xì)胞標(biāo)本的研究中均發(fā)現(xiàn)Caveolin-1陽性表達(dá)的病例較陰性病例更易出現(xiàn)胸膜和血管侵犯，無進(jìn)展生存率顯著降低，提示Caveolin-1參與肺腺癌的惡性進(jìn)展。本實驗發(fā)現(xiàn)Caveolin-1在正常肺組織中的陽性表達(dá)率顯著高于腺癌組織，但是隨著腫瘤臨床進(jìn)展(低分化、高TNM分期、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)其陽性表達(dá)程度反而升高，這種現(xiàn)象有學(xué)者認(rèn)為是階段依賴的，早期Caveolin-1下調(diào)發(fā)揮抑癌功能，晚期Caveolin-1上調(diào)發(fā)揮致癌作用[18]。Caveolin-1主要通過架構(gòu)區(qū)發(fā)揮抑癌活性，當(dāng)架構(gòu)區(qū)以外的氨基酸位點發(fā)生磷酸化或突變，會導(dǎo)致架構(gòu)區(qū)激酶抑制活性丟失，激活下游細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(如EGFR/ERK/FAK/AKT等)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，其中EGFR已被證實是肺癌靶向治療的最重要的基因位點。有研究[19]說明，在高轉(zhuǎn)移能力的肺腺癌細(xì)胞系中，Caveolin-1的表達(dá)高于低轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞系，Caveolin-1的高表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞偽足的形成，從而提高腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。分析隨訪資料發(fā)現(xiàn)陽性表達(dá)者，術(shù)后生存時間及生存率均較陰性表達(dá)者顯著下降，提示其作為腫瘤抑制因子的同時，還具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的活性。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)Smad4、Caveolin-1在肺腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，說明兩者在致癌、促癌過程中既具有不同的分子機制又可能存在共同的影響因子，例如細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)。如前所述，當(dāng)Caveolin-1的架構(gòu)區(qū)激酶抑制活性丟失時，可激活細(xì)胞內(nèi)ERK信號通路，而TGF-β在影響Smad4信號分子的同時亦可活化ERK信號通路。結(jié)合兩者在肺腺癌中的缺失或者升高表達(dá)均與肺腺癌的惡性生物學(xué)進(jìn)展及較差預(yù)后密切相關(guān)，提示兩者可作為潛在的評估預(yù)后及靶向治療的靶點。