趙麗霞 任成波 趙峻峰

肺癌是世界范圍內(nèi)與死亡率相關(guān)的主要腫瘤類型，包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，NSCLC占所有肺癌患者的80%以上[1]。NSCLC不容易診斷，大多數(shù)患者確診即為中晚期，不適合手術(shù)治療[2]。因此研究其發(fā)病機(jī)制已成為早期發(fā)現(xiàn)和早期治療的重要問題。微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)是在物種間高度保守的非編碼RNA[3]。人類基因組中有許多miRNAs參與腫瘤的增殖、分化等多種細(xì)胞過程[4]。近幾年，miRNAs與肺癌，尤其是與NSCLC之間的關(guān)聯(lián)已經(jīng)成為多項(xiàng)研究的焦點(diǎn)，如miR-512-5p可通過下調(diào)其靶基因抑制NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5-6]。有研究表明，miR-27b-3p在NSCLC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著降低，調(diào)控其表達(dá)可影響NSCLC生長(zhǎng)和侵襲，是NSCLC的潛在治療靶點(diǎn)[7]。然而，miR-27b-3p在NSCLC中的作用尚未完全了解。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種不具備編碼能力的RNA分子，在細(xì)胞內(nèi)可通過多種分子機(jī)制調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)過程。有研究表明，lncRNA ST7-AS1是胃癌、宮頸癌等多種癌癥的致癌lncRNA[8-9]。據(jù)報(bào)道，lncRNA ST7-AS1在肺腺癌組織和細(xì)胞中上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的多種惡性表型[10]，但其在NSCLC腫瘤發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探究miR-27b-3p對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的作用，并初步探究lncRNA ST7-AS1在此過程中發(fā)揮的作用，以期為NSCLC的靶向治療提供新的思路。

資料與方法

一、 細(xì)胞、主要試劑與儀器

人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞(HT-X2075C)和人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549(HT-X1707)、H358(HT-X1703)、H1299(HT-X1713)、NCL-H2073(HT-X2743C)均購(gòu)自深圳華拓細(xì)胞庫(kù)；miR-27b-3p模擬物(miR-27b-3p mimic)和miR-27b-3p模擬物陰性對(duì)照(NC mimic)、lncRNA ST7-AS1過表達(dá)載體(lncRNA ST7-AS1-pcDNA3.1)和lncRNA ST7-AS1過表達(dá)空載(pcDNA3.1)、miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1定量引物均由上海GenePharma公司設(shè)計(jì)并合成。miRNeasy Mini試劑盒(217004)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN；TRIzol總RNA提取試劑(15596026)、LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑(1668019)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(RR420A)購(gòu)自日本Takara；細(xì)胞總蛋白提取試劑盒(BC3790)、MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(M1020)購(gòu)自北京Solarbio；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(DD1205-01)、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(A211-01)購(gòu)自南京Vazyme；Transwell小室(3422)、Matrigel(356255)購(gòu)自美國(guó)Corning。

NanoDrop2000微量紫外分光光度計(jì)、Multiskan FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific；PRISM 7500 qRT-PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI；GelDoc EZ全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad；GX53倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus；CytoFLEX流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Backman。

二、 方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞和人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H358、H1299、NCL-H2073均在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有10%滅活的FBS，在5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37℃。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使用傳代3次以上的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將A549細(xì)胞分為5組：Control組(正常培養(yǎng))、NC組(轉(zhuǎn)染NC mimic)、miR-27b-3p組(轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimic)、miR-27b-3p+VC組(共同轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimic和pcDNA3.1)、miR-27b-3p+lncRNA ST7-AS1組(共同轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimic和lncRNA ST7-AS1-pcDNA3.1)，根據(jù)Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1表達(dá)水平 根據(jù)miRNeasy Mini試劑盒說明書，通過TRIzol提取按照上述方法培養(yǎng)的BEAS-2B、A549、H358、H1299及NCL-H2073細(xì)胞和各組處理的A549細(xì)胞總RNA，通過NanoDrop2000微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，提取RNA的濃度和純度。通過qRT-PCR系統(tǒng)和SYBR Green熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別以U6、β-actin為內(nèi)參基因，通過溶解度曲線，評(píng)價(jià)PCR結(jié)果的可靠性，得到循環(huán)闕值(Threshold Cycle，Ct)，通過2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)。

miR-27b-3p引物序列：上游：5′-TTATGCCCAGCGATGACC-3′，下游：5′-GGCTCCAACTTAACTGTCCC-3′；lncRNA ST7-AS1引物序列：上游：5′-TGGGGTAACTCAAAAAGCCTG-3′，下游：5′-GGTTCATACCAGCCCTGTCC-3′；U6引物序列：上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin引物序列：上游：5′-TTCGACAGTCAGCCGCATCTT-3′，下游：5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCA-3′。

3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1靶向關(guān)系 Starbase網(wǎng)站用于預(yù)測(cè)miR-27b-3p在lncRNA ST7-AS1的結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建了含有miR-27b-3p結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA ST7-AS1野生型(lncRNA ST7-AS1-WT)和突變型(lncRNA ST7-AS1-MUT)熒光素酶報(bào)告載體。使用LipofectamineTM 2000將miR-27b-3p mimic或NC mimic(miR-27b-3p mimic組、NC mimic組)和lncRNA ST7-AS1-WT或lncRNA ST7-AS1-MUT轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書方法，檢測(cè)熒光素酶活性。

4 MTT法檢測(cè)各組A549細(xì)胞增殖活力 將按照上述方法培養(yǎng)的各組A549細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度平鋪于96孔板中，48 h后向每孔中添加20 mL MTT試劑后孵育4 h。使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔在490 nm處的光密度值(OD值)。

5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組A549細(xì)胞凋亡率 收集按照上述方法培養(yǎng)的各組A549細(xì)胞，使用PBS洗滌后制備單細(xì)胞懸浮液(1×106個(gè)/mL)，吸取100 mL細(xì)胞懸浮液于96孔板中，加入5 mL Annexin V-FITC，4℃避光孵育30 min。然后，加入5 mL碘化丙啶(PI)，輕輕混合并在室溫下孵育5 min。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

6 Transwell測(cè)定各組A549細(xì)胞侵襲情況 Transwell小室使用Matrigel包被后在37℃下孵育30 min，直到Magtrigel固化。將按照上述方法培養(yǎng)的各組A549細(xì)胞使用無血清的培養(yǎng)基懸浮，制備形成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液，吸取500 mL添加Transwell小室上室中，同時(shí)在下室添加700 mL正常培養(yǎng)基，在37℃孵育24 h，去除Transwell小室上表面細(xì)胞，使用PBS清洗小室后在預(yù)冷的甲醇中浸泡30 min，將細(xì)胞固定在Transwell小室底部，添加0.1%結(jié)晶紫染色10 min。使用倒置顯微鏡拍攝圖像，并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)移至底部室的細(xì)胞(侵襲細(xì)胞數(shù)量)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理記錄的數(shù)據(jù)。測(cè)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)方法。P<0.05，表明存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、 miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)情況

通過分析qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B比較，miR-27b-3p在人NSCLC細(xì)胞系(A549、H358、H1299、NCL-H2073)中表達(dá)顯著降低，且在A549中表達(dá)明顯低于其他NSCLC細(xì)胞系(圖1A，P均<0.05)；lncRNA ST7-AS1的表達(dá)呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，lncRNA ST7-AS1表達(dá)水平在正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中表達(dá)最低，且在A549中表達(dá)明顯高于其他NSCLC細(xì)胞系(圖1B，P均<0.05)。綜上，后續(xù)選擇A549進(jìn)行研究。

圖1 miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)

二、 miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1靶向關(guān)系驗(yàn)證

Starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，lncRNA ST7-AS1與miR-27b-3p存在靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染lncRNA ST7-AS1-WT的NC mimic組比較，轉(zhuǎn)染lncRNA ST7-AS1-WT的miR-27b-3p mimic組A549細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低(圖2B，P<0.05)；而轉(zhuǎn)染lncRNA ST7-AS1-MUT的NC mimic組和miR-27b-3p mimic組A549細(xì)胞中熒光素酶活性變化無顯著差異(圖2B，P>0.05)。

圖2 miR-27b和lncRNA ST7-AS1靶向關(guān)系驗(yàn)證

三、 各組A549細(xì)胞中miR-27b-3p、lncRNA ST7-AS1表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活力變化情況

與NC組比較，miR-27b-3p組A549細(xì)胞中miR-27b-3p表達(dá)水平增高，lncRNA ST7-AS1表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖活力降低(P均<0.05)；與miR-27b-3p+VC組比較，miR-27b-3p+lncRNA ST7-AS1組A549細(xì)胞中miR-27b-3p表達(dá)水平降低，lncRNA ST7-AS1表達(dá)水平增高，細(xì)胞增殖活力增高(P均<0.05)；而NC組和Control組、miR-27b-3p+VC組和miR-27b-3p組細(xì)胞中，miR-27b-3p、lncRNA ST7-AS1表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活力變化無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見圖3)。

圖3 各組A549細(xì)胞中miR-27b、lncRNA ST7-AS1表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活力變化情況

四、 各組A549細(xì)胞凋亡率變化情況

(見圖4)所示：與NC組比較，miR-27b-3p組細(xì)胞凋亡率增高(P<0.05)；與miR-27b-3p+VC組比較，miR-27b-3p+lncRNA ST7-AS1組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；而NC組和Control組、miR-27b-3p+VC組和miR-27b-3p組細(xì)胞凋亡率變化無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖4 各組A549細(xì)胞凋亡率變化情況

五、 各組A549細(xì)胞侵襲變化情況

(見圖5)所示：與NC組比較，miR-27b-3p組侵襲細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)；與miR-27b-3p+VC組比較，miR-27b-3p+lncRNA ST7-AS1組侵襲細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.05)；而NC組和Control組、miR-27b-3p+VC組和miR-27b-3p組侵襲細(xì)胞數(shù)量變化無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖5 各組A549細(xì)胞侵襲變化情況

討 論

肺癌不僅是最常見的惡性腫瘤之一，也是所有癌癥中發(fā)病率和死亡率最高的[11]。在中國(guó)，隨著老齡化人口規(guī)模的增加、生活方式的改變以及經(jīng)濟(jì)和環(huán)境因素的影響，肺癌的發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)上升趨勢(shì)[12]。NSCLC極具隱匿性，大多數(shù)患者確診即為中晚期，不適合手術(shù)治療。盡管近幾年醫(yī)療技術(shù)有所提高，但NSCLC患者的早期診斷、綜合管理和預(yù)后仍不理想[13]。因此，探究有效的診斷和治療方法是控制NSCLC的重中之重。

越來越多的證據(jù)表明，miRNAs介導(dǎo)的靶基因的異常表達(dá)參與了許多病理過程。miRNAs編碼區(qū)往往位于脆弱的基因組區(qū)域，腫瘤中容易發(fā)生基因擴(kuò)增或缺失[14]。多項(xiàng)研究也證實(shí)腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中存在大量異常表達(dá)的miRNAs，這些miRNAs調(diào)控的許多靶基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。因此，探究miRNAs介導(dǎo)的靶基因及其相關(guān)信號(hào)通路，有助于理解NSCLC的分子機(jī)制，促進(jìn)新治療策略的開發(fā)。本研究通過探究miR-27b-3p在NSCLC中的表達(dá)和調(diào)節(jié)作用發(fā)現(xiàn)，miR-27b-3p在NSCLC細(xì)胞系中低表達(dá)，且在A549細(xì)胞中表達(dá)最低，故后續(xù)選擇A549細(xì)胞作為研究對(duì)象。進(jìn)一步研究顯示，上調(diào)miR-27b-3p表達(dá)可顯著抑制NSCLC A549細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這些發(fā)現(xiàn)表明了miR-27b-3p在NSCLC中起到腫瘤抑制作用。事實(shí)上，其他研究亦表明miR-27b-3p在人類癌癥中發(fā)揮抑制作用，如，Miao等[16]研究表明，miR-27b-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中下調(diào)，過表達(dá)的miR-27b-3p可抑制細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤的進(jìn)展，且在體內(nèi)過表達(dá)亦可抑制異種移植瘤的生長(zhǎng)；Han等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-27b-3p在食管癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，miR-27b-3p的下調(diào)表達(dá)與細(xì)胞分化差、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，上調(diào)其表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。與miR-27b-3p在某些人類癌癥中的抑制作用相反，還發(fā)現(xiàn)miR-27b-3p在三陰性乳腺癌、結(jié)直腸癌等癌細(xì)胞中的表達(dá)增加，如，Shen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-27b-3p在三陰性乳腺癌中上調(diào)，并通過調(diào)節(jié)PPARG和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移；Yang等[19]研究表明，miR-27b-3p可通過靶向HOXA10促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。這些結(jié)果表明，由于不同腫瘤微環(huán)境中的不同靶基因，miR-27b-3p的具體作用是腫瘤特異性的，因此闡明miR-27b-3p表達(dá)的分子機(jī)制至關(guān)重要。

隨著lncRNA在各種腫瘤中作為抑癌基因或癌基因越來越受到關(guān)注，lncRNA可作為治療分子靶點(diǎn)或具有預(yù)后價(jià)值的潛在生物標(biāo)志。而LncRNA ST7-AS1是新發(fā)現(xiàn)的位于7q31.2的LncRNA，具有拷貝數(shù)變異(CNVs)，可導(dǎo)致下游癌癥中的基因紊亂，與腫瘤生物學(xué)過程中的增殖、凋亡和細(xì)胞遷移密切相關(guān)[20-21]。有研究表明，LncRNA ST7-AS1表達(dá)水平與癌癥患者的總生存期相關(guān)，并在多種癌癥(包括肺腺癌、乳腺癌等)的臨床病例特征和不良預(yù)后相關(guān)[10，22]。本研究證實(shí)lncRNA ST7-AS1被miR-27b直接靶向下調(diào)，且miR-27b可能通過抑制NSCLC細(xì)胞A549中l(wèi)ncRNA ST7-AS1表達(dá)抑制細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)上調(diào)lncRNA ST7表達(dá)可逆轉(zhuǎn)此過程，因此，lncRNA ST7-AS1是開發(fā)新型抗NSCLC策略的一個(gè)有吸引力的目標(biāo)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ST7-AS1很有可能是miR-27b-3p的新型靶標(biāo)基因，miR-27b通過下調(diào)lncRNA ST7-AS1表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該發(fā)現(xiàn)可能有助于揭示該疾病發(fā)生和惡性進(jìn)展的分子機(jī)制。然而，lncRNA ST7-AS1直接或間接調(diào)控NSCLC的形成仍需研究，此外，NSCLC的形成是一個(gè)極其復(fù)雜的發(fā)展過程，僅在單一細(xì)胞系中研究不具有普遍性，后續(xù)仍需要在動(dòng)物模型及更多細(xì)胞系中進(jìn)行更進(jìn)一步的探究。