岳雪嬌， 劉 英， 向仰州， 黃 沛， 姚 斌

(1.中國林業(yè)科學研究院荒漠化研究所， 北京 100091；2.中國林業(yè)科學研究院生態(tài)保護與恢復研究所， 北京 100091；3.貴州師范學院生物科學學院， 貴陽 550018； 4.貴州師范學院地理與資源學院， 貴陽 550018)

TrrifoliumrepensL.

酸雨是當前影響和破壞生態(tài)系統(tǒng)的世界性重大環(huán)境問題之一[1-2]。近年來，我國酸雨有加重和蔓延的趨勢，2020年我國能源總需求量為23.2億～31.0億噸標準煤(其中90%的能源是化石燃料)，致酸物質(如二氧化硫、氮氧化物)的排放量大幅增加[2]。現階段我國受酸雨影響的地區(qū)已占國土面積的30%，酸雨給我國的經濟建設和人民生活造成了很大損失，已成為制約我國經濟和社會可持續(xù)發(fā)展的一個重要環(huán)境因素。

在土壤日益酸化的背景下，酸雨加快了土壤鹽基離子流失，導致酸化程度不斷加劇，不同程度影響植物的生長發(fā)育。酸雨脅迫能不同程度改變植物細胞質膜的透性，導致細胞功能喪失，表現為植物葉片不能正常進行光合作用，根系對土壤營養(yǎng)物質的吸收存在障礙。已開展的酸雨脅迫對植物生長發(fā)育響應特征及機理研究[3-6]的目標作物主要是糧食作物(如水稻[3,5,7]、小麥[3,5])、經濟作物(如油菜[3,5]、白菜[9]、板藍根[1]、棉花[11])、飼料作物(紫花苜蓿[8]、小黑麥[4])等，對草本植物的研究相對較少。白三葉和紅三葉是豆科三葉草屬多年生草本植物，兼具色澤美、綠期長、修剪次數少及固氮能力強等特性，為優(yōu)良的牧草，同時在草坪建植中被廣泛使用。酸雨對優(yōu)質牧草和重要草坪建植種三葉草的影響將逐步引起研究者的重視。但目前關于模擬三葉草逆境脅迫的研究多集中于干旱脅迫[12-13]、鹽脅迫[14-15]及重金屬脅迫[16-17]，酸雨脅迫對三葉草生長發(fā)育的研究報道甚少。鑒于此，通過研究不同pH的酸雨脅迫條件下白三葉和紅三葉的種子萌發(fā)及幼苗生長特征，量化判別二者對酸雨抵抗能力的強弱及差異，以期為酸雨或土壤酸化嚴重地區(qū)選種及其管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料白三葉購自貴州克勞沃草業(yè)有限公司，品種為海法白三葉(TrifoliumrepensL.cv.Haifa)；紅三葉由貴州綠地生態(tài)科技有限公司提供，品種為岷山紅三葉(Trifoliumpretense‘Minshan’)。

1.2 試驗設計

分別對白三葉和紅三葉進行不同的模擬酸雨脅迫處理，以去離子水為對照，共12個處理，5次重復。模擬酸雨的制備參照文獻[18]配制：先用硫酸和硝酸制備pH=1.0的酸雨母液，其中硫酸根和硝酸根的體積比為4.7∶1。以去離子水為稀釋液，將母液分別調制成pH值為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0的酸雨，并經ZD-型自動電位滴定儀校準(上海雷磁儀器公司)后備用。

分別選取籽粒飽滿，粒徑大小相近的白三葉和紅三葉種子用于試驗，先用0.05%的高錳酸鉀溶液消毒30 min，去離子水漂洗3次，然后用吸水紙吸干種子表面的水分得到備用草種。根據國際種子檢驗規(guī)程[19]，采用雙層濾紙發(fā)芽。在預先進行標記的培養(yǎng)皿中鋪2層濾紙，選取預處理后的白三葉和紅三葉種子放在濾紙上，50粒/皿，種子間距盡量保持一致。然后用移液管分別準確量取pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0的模擬酸雨溶液加入培養(yǎng)皿中，因濾紙干燥，第一次酸雨用量12 mL，以后每次用量10 mL。為保證酸雨濃度不變，每2 d更換一次相應的酸液。將各處理培養(yǎng)皿移至GXZ型光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)進行培養(yǎng)，溫度(25±0.5)℃，光照時間12 h/d。以后每天打開2次，與外界換氣5 min。發(fā)芽以突破種皮的胚軸長度達到真種子自身的長度為標準，每天統(tǒng)計發(fā)芽的種子數。

1.3 種子萌發(fā)的觀測與評估

發(fā)芽勢(%)=(4 d內正常發(fā)芽粒數/供試種子數)×100%[20]；

發(fā)芽率(%)=(8 d內全部正常發(fā)芽粒數/供試種子數)×100%[21]；

用電子天平稱量2個品種幼苗鮮重；

將2個品種幼苗放置在80 ℃的恒溫箱中，24 h后取出用電子天平直接稱重；

發(fā)芽指數=∑(Gt/Dt)，式中，Gt為總的發(fā)芽粒數，Dt為相應的發(fā)芽天數[22]；

活力指數=GI×S，式中，GI為發(fā)芽指數，S為第8天單株幼苗平均鮮重[1]。

1.4 數據處理

采用DPS 14.5統(tǒng)計軟件對數據進行方差分析[16]，并用Duncan’s 法進行處理間的多重比較，利用sigmaplot 12.5 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酸雨脅迫對紅三葉和白三葉種子發(fā)芽的影響

植物受到逆境脅迫會導致植物生長發(fā)育受到抑制，植物種子耐受環(huán)境因素脅迫的表現各異。模擬酸雨對2種三葉草種子發(fā)芽勢的影響見圖1。由圖1可知，隨著酸雨pH值的降低，紅三葉與白三葉種子的發(fā)芽勢均呈減小趨勢，且其發(fā)芽勢均低于對照。酸雨pH值5.0處理紅三葉與白三葉種子的發(fā)芽勢均與對照差異不顯著，受酸雨脅迫影響不明顯。紅三葉品種除pH值5.0處理外，其余處理的種子發(fā)芽勢均與對照差異極顯著(p<0.01)，但處理間無顯著性差異。酸雨pH值2.0和pH值2.5處理白三葉的種子發(fā)芽勢與對照差異極顯著(p<0.01)，pH值3.0處理與對照差異顯著(p<0.05)。

模擬酸雨對2種三葉草種子發(fā)芽率的影響見圖2。由圖2可知，隨著酸雨pH值的降低，紅三葉與白三葉種子發(fā)芽率均呈減小趨勢。但與對照相比，紅三葉與白三葉種子發(fā)芽率在pH值為5.0酸雨處理下略有增加，而其余處理的種子發(fā)芽率均低于對照。紅三葉品種在pH值為5.0時受酸雨脅迫的影響不明顯，其余處理的種子發(fā)芽率均與對照呈差異極顯著(p<0.01)，且pH值為3.0、2.5、2.0處理較pH值為4.0、3.5處理差異極顯著(p<0.01)。pH值為5.0和pH值為4.0處理白三葉受酸雨脅迫的影響不明顯，其余處理的種子發(fā)芽率均與對照差異極顯著(p<0.01)，且pH值為2.5和pH值為2.0的酸雨處理與pH值為3.5處理呈差異極顯著(p<0.01)。

圖1 模擬酸雨對紅三葉和白三葉種子發(fā)芽勢的影響Fig.1 The effect of simulated acid rain on the seed germination potential of red and white clover

圖2 模擬酸雨對紅三葉和白三葉種子發(fā)芽率的影響Fig.2 The effect of simulated acid rain on the seed germination rate of red and white clover

2.2 酸雨脅迫對紅三葉和白三葉種子活力的影響

一般而言，發(fā)芽率能反映環(huán)境脅迫對種子萌發(fā)的影響，但要反映出種子的活力及出苗的整齊程度則很難，通常以種子發(fā)芽指數來表征種子的活力。模擬酸雨對2種三葉草種子發(fā)芽指數的影響見圖3。由圖3可知，隨著酸雨脅迫強度增加，紅三葉與白三葉種子發(fā)芽指數均呈減小趨勢。紅三葉種子發(fā)芽指數均低于對照，且僅pH值為2.0和pH值為3.0處理與對照差異極顯著(p<0.01)，pH值為2.5處理與對照差異顯著(p<0.05)，其余處理種子發(fā)芽指數均與對照差異不顯著。白三葉除pH值為5.0處理外，其余處理的種子發(fā)芽指數均與對照差異極顯著(p<0.01)，且處理間均差異極顯著(p<0.01)。

圖3 模擬酸雨對紅三葉和白三葉種子發(fā)芽指數的影響Fig.3 The effect of simulated acid rain on the seed germination index of red and white clover

模擬酸雨對2種三葉草種子活力指數的影響見圖4。由圖4可知，隨著酸雨脅迫強度增加，紅三葉種子活力指數無明顯變化趨勢，而白三葉種子活力指數呈現明顯減小趨勢。相較于紅三葉，白三葉種子活力指數受到酸雨脅迫的影響更明顯。紅三葉除pH值為2.0處理與對照差異顯著外(p<0.05)，其余處理的種子活力指數均與對照差異不顯著。白三葉種子活力指數均低于對照，且pH值為5.0處理的種子活力指數與對照無顯著性差異，受酸雨脅迫影響不明顯；其余處理下的種子活力指數均與對照差異極顯著(p<0.01)，但處理間均無顯著性差異。

2.3 酸雨脅迫對紅三葉和白三葉幼苗重量的影響

酸雨脅迫會對植物的生物量產生影響，模擬酸雨對2種三葉草幼苗鮮重的影響見圖5。由圖5可知，隨著酸雨脅迫強度增加，紅三葉與白三葉幼苗鮮重均呈現降低趨勢，且兩個品種的幼苗鮮重均低于對照。相較于紅三葉，白三葉幼苗鮮重受酸雨脅迫的影響更明顯。pH值為5.0處理的紅三葉幼苗鮮重與對照無顯著差異，受酸雨脅迫影響不明顯；其余處理的幼苗鮮重均與對照差異極顯著(p<0.01)，但處理間均無顯著性差異。白三葉僅pH值為2.0和pH值為2.5處理與對照差異極顯著(p<0.01)，而pH值為3.5處理與對照差異顯著(p<0.05)，其余處理的幼苗鮮重均與對照差異不顯著。

圖4 模擬酸雨對紅三葉和白三葉種子活力指數的影響Fig.4 The effect of simulated acid rain on the seed vigor index of red and white clover

圖5 模擬酸雨對紅三葉和白三葉幼苗鮮重的影響Fig.5 The effect of simulated acid rain on the fresh biomass of red and white clover seedlings

圖6 模擬酸雨對紅三葉和白三葉幼苗干重的影響Fig.6 The effect of simulated acid rain on the dry biomass of red and white clover seedlings

模擬酸雨對兩種三葉草幼苗干重的影響見圖6。由圖6可知，隨著酸雨pH值的降低，紅三葉與白三葉幼苗干重均呈緩慢降低趨勢。pH值為5.0酸雨處理紅三葉的幼苗干重與對照差異顯著(p<0.05)，其余處理均與對照差異極顯著(p<0.01)。白三葉幼苗干重雖均低于對照，但酸雨pH值為3.5、4.0、5.0處理幼苗干重均與對照差異不顯著，僅酸雨pH值為2.0、2.5、3.0處理與對照差異極顯著(p<0.01)。

3 討 論

酸雨不僅對動植物具有直接的傷害作用，還會影響土壤肥力和活性，對作物生長造成損害，具有嚴重的危害性[23-24]。種子萌發(fā)和成苗這兩個關鍵階段決定了植物是否能夠正常生長。

3.1 酸雨脅迫對三葉草種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)期是植物生長周期中極易受到環(huán)境因素影響的關鍵時期之一，對外界環(huán)境十分敏感[25]。種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數、活力指數等指標可以用來反映種子的萌發(fā)能力，表征植物抗逆性的強弱[26]。本研究中，紅三葉種子pH值為5.0酸雨處理的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數及活力指數與對照差異不顯著，表明適當pH的酸雨對紅三葉種子萌發(fā)無明顯抑制作用，這與王文彥[27]的研究結果一致。pH值為4.0、3.5酸雨處理的紅三葉種子萌發(fā)雖受到酸雨脅迫影響，但影響較小并且均能正常萌發(fā)。而在酸雨pH值為3.0、2.5、2.0時，紅三葉種子萌發(fā)受到酸雨脅迫的影響較大，原因可能是重度酸雨脅迫導致種子細胞內保護酶活性降低，儲藏物質分解及呼吸代謝受到抑制，缺少萌發(fā)所需物質和能量[28]。但在該處理下仍有部分種子能夠正常萌發(fā)，種子活力指數甚至與對照無顯著性差異，說明紅三葉品種的抗酸性能力較強。白三葉品種種子萌發(fā)受酸雨脅迫的影響較大，其種子活力在酸雨脅迫下嚴重下降。酸雨pH值為3.5、3.0、2.5、2.0時，有部分種子可以萌發(fā)，這與魏禎禎等[29]對4種草坪草種子進行酸雨pH值為2.0時的模擬酸雨實驗，得到的種子萌發(fā)均受到完全抑制的結果不同，說明不同種子對酸雨的抵抗力各異。在酸雨pH值為5.0的條件下，白三葉種子能夠正常萌發(fā)，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數甚至略高于對照，這與王瑞龍[30]等對三葉鬼針草進行的模擬酸雨實驗結果相似，可能的原因是模擬酸雨中含有部分氮氧化物，氮氧化物可以為種子提供氮源，從而有利于種子萌發(fā)[31]。

3.2 酸雨脅迫對三葉草幼苗生長的影響

植物對酸脅迫的耐受存在一定的范圍。研究表明，景天三七能夠適應pH值為4.2～6.2的土壤環(huán)境[32]，類蘆能夠耐受的土壤環(huán)境pH值范圍為3.5～5.6[33]，而刨花楠在pH值為2.5的土壤環(huán)境中仍然能夠正常生長[34]，由此可知，不同植物對生長環(huán)境的酸脅迫的耐受程度不同，而種子成苗是植物生長周期中決定植物是否能夠正常生長的兩個關鍵階段之一，通過酸雨脅迫對三葉草幼苗生長的影響可以在一定程度上判斷其酸雨耐受能力。本研究通過三葉草幼苗的鮮重與干重來評價其生長情況，紅三葉幼苗pH值為5.0酸雨處理的鮮重、干重均與對照差異不顯著，表明適當pH的酸雨對紅三葉幼苗的生長無明顯抑制作用。pH值為4.0、3.5酸雨處理的紅三葉幼苗生長受酸雨脅迫影響較小，表明紅三葉品種可以耐受pH值為4.0、3.5的模擬酸雨，該結果與郝國寶等[35]對夏枯草種子進行的模擬酸雨實驗結果相似。而在酸雨pH值為3.0、2.5、2.0時，紅三葉幼苗生長受到酸雨脅迫的影響較大。白三葉品種幼苗生長相較于紅三葉品種受酸雨脅迫的影響更大，酸雨pH值為3.5、3.0、2.5、2.0時，幼苗的生長量極小，這與汪賽[36]對茶幼苗進行的酸雨處理實驗結果相似，表明白三葉品種的抗酸性能力低于紅三葉品種。

4 結 論

紅三葉與白三葉種子萌發(fā)和幼苗生物量均不同程度地受到模擬酸雨脅迫的抑制，但隨著酸雨脅迫程度增加，紅三葉種子的萌發(fā)潛力和幼苗的生物量累積均高于白三葉，說明紅三葉對酸雨脅迫的耐受性更強，本研究中其pH耐受范圍為2.0～4.5。因此，在酸性土壤或酸雨脅迫環(huán)境下，為提高草坪或牧草的產量及質量，需要考慮選育抗酸性能力較強的三葉草品種，即可以選擇紅三葉作為耐酸品種。

植物在生長過程中會啟動一定的防御機制來應對外界的各種脅迫[37]，當前，我國的酸雨問題仍然突出，硫酸型、混合型及硝酸型三種類型的酸雨并存，而且酸雨類型逐漸向硫酸硝酸混合型轉變，并且存在向硝酸型酸雨轉變的趨勢[38]。而上述研究僅為紅三葉種子在不同pH混合型酸雨脅迫(硫氮比為4.7∶1)下的初步結果，其潛在的生理生化及基因水平反饋機制仍需要進一步深入探討，以期為耐受酸雨的紅三葉品種選育、建植及管理提供理論依據。