李 霞， 包艷存， 李保華， 牛曉雪， 路 遠(yuǎn)， 牟 萌， 楊 林

(濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 山東 濰坊 261071)

cytological characteristics

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)學(xué)名石刁柏，是百合科天門冬屬多年生草本宿根性植物，以嫩莖供食，是國際市場公認(rèn)的營養(yǎng)保健蔬菜。核型分析表明，天門冬屬植物有二倍體、四倍體和六倍體，共同的染色體基數(shù)是x=10[1]，普通二倍體蘆筍有20條染色體2 n=2 x=20(XY)，其中有10條大染色體、2條中型染色體和8條小染色體，除了小染色體3號為亞中著絲粒染色體外，其他染色體都是中部著絲粒染色體，核型類型屬2 B型，較不對稱，為較原始的類型[2]。蘆筍屬于雌雄異株植物，一般蘆筍雌株只開雌花，雄株只開雄花，其性別決定主要體現(xiàn)在雌、雄花器官的形態(tài)建成上。蘆筍性別有3種基因型和4種表現(xiàn)型，分別為雌株(mm)、普通雄株(Mm)、超雄株(MM)、雄性兩性株(Mm，簡稱兩性株)，其中超雄株是有活力的[3-4]。蘆筍和其他雌雄異株植物一樣，不論是雌株還是雄株，最初形成的都是兩性花，同時(shí)具備雄蕊和雌蕊，在發(fā)育過程，雌性或雄性器官發(fā)生退化，兩性花逐漸發(fā)育形成單性花[5]。但自然界中有些蘆筍雄株的雌蕊退化不完全而會結(jié)出少量果實(shí)，形成種子，這樣的植株稱為兩性株，通常情況下蘆筍兩性株出現(xiàn)的比例僅有0～2%[6]。目前國內(nèi)僅在蘆筍兩性株的初步利用、調(diào)查、兩性花誘導(dǎo)及生理生化等方面做了研究[6-9]，還未涉及對蘆筍兩性株染色體的研究，故本試驗(yàn)采用常規(guī)的細(xì)胞學(xué)分析方法對蘆筍兩性株的染色體進(jìn)行有絲分裂和減數(shù)分裂研究，旨在為蘆筍兩性株的研究增加細(xì)胞學(xué)資料，為進(jìn)一步揭示兩性株生長發(fā)育提供理論基礎(chǔ)。

注：A為荷蘭全雄兩性株單株；B為兩性株后代套袋雄株(取此根尖和花蕾)；C為收獲的兩性株漿果；D為有種皮的兩性株種子；E為有種皮和無種皮的兩性株種子；F為無種皮的兩性株種子。圖1 兩性株試材Fig.1 Test materials of andromonoecious plants

1 材料與方法

1.1 材 料

以“冠軍”父本“荷蘭全雄”為原始材料，2018年9月田間調(diào)查3 267株制種群體(占地面積6.67 hm2)中雄株單株結(jié)種情況，發(fā)現(xiàn)有22株雄株結(jié)種，將新結(jié)種子全部收獲，共計(jì)2 256粒，觀察發(fā)現(xiàn)種子的大小、千粒重、飽滿度及種皮的有無等均不一致。所有種子于2019年3月育苗，6月定植于濰坊市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園大棚中，成活植株968株，成活率為42.91%，10月淘汰其中的雌株，剩余雄株418株，單株做標(biāo)記。2020—2021年連續(xù)2年調(diào)查兩性株后代雄株的生長情況，對其中結(jié)種單株用90目紗網(wǎng)套袋，取當(dāng)年生的根尖和花蕾分別進(jìn)行有絲分裂和減數(shù)分裂研究(圖1)。

1.2 方 法

1.2.1根尖染色體有絲分裂觀察

采用孚爾根染色法，取套袋兩性株當(dāng)年生的白色根尖，置于蒸餾水中于0 ℃處理24 h后，加入新配制的卡諾氏固定液Ⅰ(V乙醇∶V冰乙酸=3∶1)保存于4 ℃冰箱內(nèi)，根尖用1 mol/L鹽酸60 ℃解離10 min，Schiff試劑染色，1%醋酸洋紅常規(guī)壓片，Olympus BX 41顯微鏡觀察，挑選處于分裂中期形態(tài)良好的細(xì)胞在100倍的油鏡下拍照，對50個(gè)染色體中期分裂相好的制片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算染色體數(shù)目、相對長度、臂比等[10]，確定染色體核型[11]。

1.2.2花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察

采用改良苯酚品紅染色法，取套袋兩性株0.5 mm左右的花蕾，蒸餾水沖洗2～3次，在卡諾氏固定液Ⅰ中固定24 h，然后轉(zhuǎn)移到70%酒精中于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?%醋酸洋紅解剖制片，改良石炭酸品紅復(fù)染，酒精燈上微烤后壓片。對85個(gè)處于中期Ⅰ的細(xì)胞用Olympus BX 41顯微鏡觀察拍照并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍兩性株的根尖有絲分裂

對50個(gè)中期分裂相好的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，蘆筍兩性株的染色體數(shù)目為20條，20條染色體中包括8條中部著絲粒染色體，分別是第6、7、9、10號染色體；12條近中部著絲粒染色體，分別是第1、2、3、4、5、8號染色體；其中第8號染色體帶有隨體。最短的染色體是第10號，相對長度為6.14%，最長的染色體是第1號，相對長度為16.42%，染色體的長度比為2.67，介于2∶1～4∶1之間；臂比大于2∶1染色體占比為30%，介于1%～50%之間，核型屬于2 B型，核型公式為2 n=2 x=8 m+12 sm(2 SAT)(表1、圖2、圖3)。

注：A為棒狀二價(jià)體和環(huán)狀二價(jià)體；B為全部為環(huán)狀二價(jià)體；C為中期Ⅰ，箭頭示小環(huán)狀二價(jià)體；D為中期Ⅰ，箭頭示配對不完全的二價(jià)體；E為中期Ⅰ，箭頭示染色體粘連；F為中期Ⅰ，箭頭示環(huán)狀四價(jià)體；G為落后染色體-箭頭示；H為染色體橋-箭頭示。圖4 蘆筍兩性株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂Fig.4 The meiosis of pollen mother cells of andromonoecious plants of Asparagus officinalis L.

表1 蘆筍兩性株的核型參數(shù)Table 1 Karyotype parameters of andromonoecious plants of Asparagus officinalis L.

2.2 蘆筍兩性株的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂

對85個(gè)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ觀察結(jié)果顯示，所有細(xì)胞中，中期Ⅰ同源染色體配對過程中二價(jià)體出現(xiàn)的比例為97.65%，四價(jià)體為2.35%；二價(jià)體中96.39%是棒狀二價(jià)體和環(huán)狀二價(jià)體共存，6.02%為環(huán)狀二價(jià)體；減數(shù)分裂過程中有50%的細(xì)胞均存在一對較小的環(huán)狀二價(jià)體；中期Ⅰ出現(xiàn)了配對不完全的二價(jià)體和染色體粘連的現(xiàn)象。在由中期Ⅰ向后期Ⅰ轉(zhuǎn)變的過程中出現(xiàn)了落后染色體和染色體橋(圖4)。

圖3 蘆筍兩性株的核型模式Fig.3 Karyotype models of andromonoecious plants of Asparagus officinalis L.

3 討 論

本研究觀察到蘆筍兩性株體細(xì)胞染色體數(shù)目和花粉母細(xì)胞染色體數(shù)目均為2 n=2 x=20，這與林俊芳,莊偉建[12]，周勁松等[14]的研究結(jié)果一致，但隨體的位置及數(shù)量、染色體臂比、核型類型存在差異[12-14]。分析原因，一是在蘆筍進(jìn)化早期，性別決定并未發(fā)生，此時(shí)具有兩性特征，當(dāng)雄花的雌性器官或者雌花的雄性器官停滯發(fā)育時(shí)，此時(shí)由兩性逐漸向單性分化，由于發(fā)育階段的不同致使體細(xì)胞有絲分裂出現(xiàn)了不同；二是取材位置不同，先前的研究試材都是生長旺盛的莖尖，本研究的試材是兩性株當(dāng)年生的白色根尖。

國內(nèi)外對蘆筍兩性株的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ出現(xiàn)了棒狀和環(huán)狀的構(gòu)型，環(huán)狀四價(jià)體出現(xiàn)的頻率為2.35%，在觀察的細(xì)胞中有一半存在一對較小的環(huán)狀二價(jià)體。觀察到絕大多數(shù)蘆筍兩性株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體的行為正常，在少數(shù)的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中出現(xiàn)了配對不完全的二價(jià)體、染色體粘連、落后染色體及染色體橋等異常行為，異常行為的出現(xiàn)可能導(dǎo)致蘆筍兩性株一部分花粉敗育而不結(jié)實(shí)。分析原因，除了兩性株與普通蘆筍群體在進(jìn)化上有一定差異及兩性株花藥自身發(fā)育的情況外，可能在取材時(shí)外界環(huán)境干擾了不同材料的正常發(fā)育，導(dǎo)致不同的減數(shù)分裂現(xiàn)象出現(xiàn)。隨著染色體分帶、熒光原位雜交及各種分子技術(shù)的出現(xiàn)，蘆筍兩性株染色體配對研究的準(zhǔn)確率大大提高。