王 溪，凌映茹，張 昊，吉文亮

（江蘇省疾病預防控制中心，江蘇南京 210009）

有機磷阻燃劑（Organophosphorus Flame Retardants，OPFRs）被認為是已被限制使用的溴系阻燃劑的合適替代品。除了用作阻燃劑外，OPFRs 還被用作增塑劑、穩(wěn)定劑、液壓油中的潤滑劑、消泡劑和地板上光劑等。近幾十年來被廣泛應用于紡織品、塑料、家具、電子設備等材料中。OPFRs 具有半揮發(fā)性，在生產(chǎn)和使用過程中主要以摻雜混合而非化學鍵合的方式加入到材料中，這使其普遍存在于空氣、土壤、水、塵埃和沉積物等非生物環(huán)境中，且殘留量與日俱增。實驗研究已經(jīng)證明某些OPFRs具有神經(jīng)毒性、致癌性、生殖毒性、內分泌干擾性等。其中，磷酸三（2-乙基己基）酯（Tris（2-ethylhexyl）phosphate，TEHP）、磷酸三（丁氧基乙基）酯（Tris（2-butoxyethyl） phosphate，TBOEP）、磷酸三正丁酯（Tributyl phosphate，TnBP）能夠誘發(fā)妊娠X 受體激動劑活性；磷酸三苯酯（Triphenyl phosphate，TPhP）、TnBP、TBOEP 和磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris（2-chloroethyl） phosphate，TCEP）具有發(fā)育神經(jīng)毒性等。作為一類新型污染物，OPFRs 對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成巨大影響與潛在威脅，已被歐盟列為高度關注物質。近年來，國際上已經(jīng)陸續(xù)制定了相關規(guī)定限制OPFRs 的使用：2010 年《加拿大消費產(chǎn)品安全法案》禁止兒童產(chǎn)品泡沫材料使用TCEP；2011 年美國華盛頓州《兒童安全產(chǎn)品法》要求制造商向州政府報告兒童產(chǎn)品中的 TCEP、TPhP、磷酸三（1, 3-二氯-2-丙基）酯（tris（1, 3-dichloroisoprophy）phosphate，TDCPP）的含量；2014 年歐盟官方發(fā)布了對玩具安全指令2009/48/EC 附件二附錄C 的修訂，最新規(guī)定了玩具中TCEP、磷酸三（2-氯丙基）酯（ Tris（ 2-chloroisopropyl） phosphate， TCPP） 和TDCPP 均不能超過5 mg/kg；2019 年美國《有毒物質控制法》提議對TCEP 和TPhP 進行優(yōu)先風險評估。我國規(guī)定了紡織品中的TCPP 不能超過10 mg/kg，而關于食品中OPFRs 的限值尚未見相關規(guī)定。考慮到部分OPFRs 具有較高的親脂性和半揮發(fā)性，在環(huán)境中具有較強的遷移能力，并有一定的生物蓄積潛力，建立一種測定食品中OPFRs含量的方法是很有必要的。

OPFRs 的分子結構由一個磷酸根骨架和3 個取代基團構成，較為常見的OPFRs 共22 種，根據(jù)取代基的不同可分為三大類。其中，鹵代烷基磷酸酯7 種，烷基磷酸酯有10 種，芳基磷酸酯5 種。分子量越大的OPFRs 極性越弱，也越難揮發(fā)。測定廢水、魚類、母乳等樣品中的OPFRs 前處理方法主要有固相萃取法、液液萃取法、QuEChERS 法等。儀器檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法等。液相色譜-質譜法更適用于相對分子量較大的OPFRs 的測定。目前，OPFRs 的分析研究主要集中在粉塵、紡織品、水體及各種魚類。Poma 等表示，對于人類暴露OPFRs 評估，膳食攝入途徑或許最為重要。Li 等發(fā)現(xiàn)不同地域食品中30 種OPFRs 濃度和分布有較大差異，指出建立合適的多殘留提取分離方法和通用分析標準，對于準確比較不同區(qū)域各類食品中OPFRs含量水平至關重要。目前，關于食品中OPFRs 含量的檢測方法報道較少，可能是因為食品中OPFRs 含量更低、基體成分更為復雜、檢測起步較晚、質量控制要求更加嚴格。嬰兒代謝和免疫系統(tǒng)不成熟，容易暴露于外源性化學物質。因此建立一種食品尤其是嬰兒食品中OPFRs 的檢測方法尤為重要。目前，嬰兒米粉中OPFRs 的檢測方法未見報道。

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術，以期建立了嬰兒米粉中磷酸三乙酯（Triethyl phosphate，TEP）、磷酸三異丙酯（Triisopropyl phosphate，TiPP）、磷酸三丙酯（Tri-n-propyl Phosphate，TnPP）、磷酸三異丁酯（Triisobutyl phosphate，TiBP）、TnBP、TCEP、TPhP、 TCPP、 TBOEP、 TDCPP、 TEHP 等 11 種OPFRs 的檢測方法，為嬰幼兒米粉中OPFRs 的檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品：嬰兒米粉 購買于超市和網(wǎng)店，共4 種不同品牌；標準品：TEP（純度99.68%）、TiPP（純度94.2%）、TnPP（純度99.57%）、TiBP（純度99.5%）、TnBP（純度99.6%）、TCEP（純度98.73%）、TPhP（純度98.75%）、TCPP（純度99.17%）、TBOEP（純度92.09%）、TDCPP（純度95.35%）、TEHP（純度98.74%）等11 種OPFRs 均為固體 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；ACQUITY UPLCBEH C色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters 公司；甲醇、乙腈、甲酸 均為色譜純，德國Merk 公司；甲酸銨 色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水 瓶裝純凈水，浙江娃哈哈公司；有機相針式濾器濾膜 13 mm×0.22 μm，尼龍材質，上海安譜實驗科技股份有限公司；Captiva Econo Filter 有機相針式濾器濾膜 13 mm×0.22 μm，聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）材質，美國Agilent 公司；有機相針式濾器濾膜 13 mm×0.22 μm，再生纖維素材質，美國Agilent 公司；分散固相萃?。―ispersive solid phase extraction，dSPE）凈化管A、B、C 三種（A 管含150 mg MgSO，50 mg C，50 mg GCB，50 mg PSA；B 管含150 mg MgSO，100 mg C，20 mg GCB，100 mg PSA；C 管含150 mg MgSO，150 mg C，20 mg GCB，150 mg PSA） 德國CNW 公司；脫水試劑（4 g NaSO、1 g NaCl） 上海安譜實驗科技股份有限公司。

Acquity I CLASS PLUS 超高效液相色譜儀、Xevo TQ-XS 型質譜儀 美國Waters 公司；2-16KL型臺式離心機 德國Sigma 公司；N-EVAP-111 型氮吹儀 美國Organomation 公司；Vortex-6 型渦旋混合器 江蘇其林貝爾公司；D-78224 型超聲波清洗儀 德國Elma 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

1.2.1.1 標準儲備溶液 分別準確稱取TEP、TiPP、TnPP、TiBP、TnBP、TCEP、TPhP、TCPP、TBOEP、TDCPP、TEHP 各10 mg（精確至0.1 mg），用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備溶液，-18 ℃下保存。

1.2.1.2 混合標準中間溶液 移取TEHP 標準儲備溶液1 mL 用甲醇定容至10 mL 得到濃度為0.1 mg/mL的TEHP 標準中間溶液。分別移取1.0 mg/mL TEP、TiPP、TnPP、TiBP、TnBP、TCEP、TPhP、TCPP、TBOEP、TDCPP 標準儲備溶液各0.1 mL 和0.1 mg/mL TEHP 中間溶液0.1 mL，用甲醇定容至10 mL，得到濃度為10 μg/mL 混合標準中間溶液Ⅰ（TEHP 濃度為1 μg/mL）。移取混合標準中間溶液Ⅰ0.1 mL 用甲醇定容至10 mL，得到濃度為100 μg/L混合標準中間溶液Ⅱ（TEHP 濃度為10 μg/L）。移取混合標準中間溶液Ⅱ0.1 mL 用甲醇定容至10 mL，得到濃度為1 μg/L 混 合 標 準 中 間 溶 液Ⅲ（TEHP 濃 度 為0.1 μg/L），4 ℃冷藏保存。

1.2.1.3 混合標準溶液系列 分別移取混合標準中間溶液Ⅰ0.1 mL，混合標準中間溶液Ⅱ0.1、0.5、1、2、5 mL，混合標準中間溶液Ⅲ5 mL，用80%甲醇定容至10 mL，得到濃度為0.5、1、5、10、20、50、100 μg/L 的混合標準溶液系列（TEHP 標準系列濃度為0.05、0.1、0.5、1、5、10 μg/L）。

1.2.2 樣品前處理 稱取1.0 g（精確至0.001 g）混合均勻的嬰兒米粉，置于50 mL 離心管中，加入0.5%甲酸乙腈溶液10 mL，渦旋混勻2 min，加入脫水試劑（4 g NaSO、1 g NaCl），渦旋混勻2 min。超聲（25 kHz）提取10 min，10000 r/min 室溫離心5 min，吸取上清液1.5 mL 置于dSPE 凈化管A 管（150 mg MgSO，50 mg C，50 mg PSA，50 mg GCB）中，渦旋混勻。12000 r/min 室溫離心5 min，吸取上清液1 mL，氮吹至近干，用1 mL 80%甲醇復溶，PTFE 濾膜過濾，供超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLCBEH C色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A 相為含5 mmol/L 甲酸銨的水溶液，B 相為乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣體積5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for mobile phase

1.2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子模式；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；碰撞氣類型：氬氣；毛細管電壓：3.0 kV；去溶劑溫度：450C；去溶劑流速：800 L/Hr；錐孔流速：150 L/Hr；霧化氣壓力：7.0 bar；碰撞氣流速：0.15 mL/min。11 種OPFRs 的其他質譜參數(shù)見表2。

表2 目標化合物質譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters for the target OPFRs

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Masslynx 軟件（美國Waters 公司）采集數(shù)據(jù)并積分，使用Origin 9.0（美國Origin Lab 公司）作圖，使用Microsoft Excel 2010（美國微軟公司）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 質譜、色譜條件優(yōu)化

將單一標準溶液以5 μL/min 的流速注入Xevo TQ-XS 質譜儀中，選擇Combined 模式，在MS1 Scan 母離子掃描模式下找到各目標物質的母離子。隨后打開碰撞氣，通過調節(jié)碰撞能，選取各目標物質信號最強的子離子作為定量離子，信號次強的子離子作為定性離子，通過優(yōu)化各離子對的毛細管電壓、錐孔電壓和碰撞能，最終確定質譜參數(shù)，如表2 所示。

采用Waters ACQUITY UPLCBEH C色譜柱進行分離。實驗比較了不同水相及有機相作為流動相時OPFRs 的響應。以5 mmol/L 甲酸銨水溶液作為水相時，比0.1%甲酸水作為水相時目標物的響應提高、半峰寬減小、保留增強。過強的保留使得分析時間延長。以甲醇作為有機相時，比乙腈作為有機相時目標物的保留減弱。最終采用5 mmol/L 甲酸銨水溶液作為水相，乙腈作為有機相，目標物響應強、峰形好、分析時間短。本實驗11 種OPFRs 中有兩對同分異構體（TiPP 和TnPP，TiBP 和TnBP），反相鍵合固定相的形狀選擇性對其分離具有潛在優(yōu)勢。兩對同分異構體中，均是烷基異位取代的化合物優(yōu)先出峰，表明當形狀選擇性在分離中起到更重要的作用時，長而窄的分子（和那些短和寬的分子相比）會優(yōu)先被保留。實驗通過調整流動相梯度，在同分異構體出峰時間附近減少有機相比例，實現(xiàn)了同分異構體的良好分離。同分異構體分離后，提高有機相比例，在15 min 內完成了11 種OPFRs 分析，大大縮短了分析時間。11 種OPFRs 標準溶液的提取離子流圖如圖1 所示。

圖1 11 種OPFRs 標準溶液的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 11 kinds of OPFRs standard solutions

2.2 實驗干擾的排除

有文獻表明，食品中TEP 檢出率很高。但經(jīng)本實驗發(fā)現(xiàn)，程序空白中有TEP 檢出，其色譜峰保留時間和相對離子豐度與標準溶液一致，可能導致樣品分析時TEP 檢測結果假陽性。通過拆分樣品分析全流程，找出了程序空白中TEP 的來源：每進行一步樣品分析，都分別把對應的提取溶液進UPLC-MS/MS分析，結果顯示，提取液過濾膜之前，均沒有TEP 檢出；過了濾膜以后，檢出了TEP。這證明程序空白中檢出的TEP 來自于濾膜。實驗對比了三種有機相針式濾器濾膜，當濾膜材質為尼龍和再生纖維素時，程序空白中有TEP 檢出；當濾膜材質為PTFE 時，程序空白中TEP 大大減少（小于檢出限），因此本實驗采用PTFE 濾膜過濾，排除了TEP 假陽性問題。程序空白提取液過不同濾膜時TEP 的檢出情況如圖2所示。

圖2 程序空白提取液過不同濾膜時TEP 的檢出情況Fig.2 Detection of TEP when blank extract passed through different filter membrane

2.3 樣品前處理條件的選擇

實驗比較了不同溶劑的提取效率，通過在空白樣品中加標50 μg/kg（TEHP 5 μg/kg）OPFRs，分別采用0.5%甲酸乙腈、4:1 乙腈丙酮和乙腈進行提取，按照1.2.2 處理，計算回收率得到。發(fā)現(xiàn)三種提取溶劑對10 種OPFRs 的提取效率差別不大，但對TEHP的提取效率差別較大，分別是81.7%、69.9%、77.1%，因此選擇0.5%甲酸乙腈作為提取溶劑。不同溶劑的提取效率如圖3 所示。實驗比較了A、B、C 三種凈化管對同一加標樣品（加標濃度為50 μg/kg，TEHP 5 μg/kg）的凈化效果及提取效率的影響。發(fā)現(xiàn)三種凈化管對10 種OPFRs的提取效率影響差別不大，但對TEHP 的提取效率影響較大，分別是81.7%（A 管）、58.6%（B 管）、56.1%（C 管），推測是由于過高的C含量會使THEP產(chǎn)生吸附而使其提取效率降低。最終采用A 管進行凈化處理，不同凈化管對OPFRs 提取效率的影響如圖4 所示。

圖3 不同溶劑的提取效率Fig.3 Extraction efficiency of different solvents

圖4 不同凈化管對OPFRs 提取效率的影響Fig.4 Effect of different purification pipes on extraction efficiency of OPFRs

實驗比較了OPFRs 在甲醇、80%甲醇中的響應。分別采用這兩種溶劑配制相同系列的混合標準溶液，通過比較線性方程的斜率發(fā)現(xiàn)，TEP 在兩種溶劑中的斜率變化不大，其余10 種目標物均在80%甲醇中的斜率較大，說明其在80%甲醇中的響應更強。因此選擇80%甲醇配制標準溶液系列以及作為樣品前處理的復溶溶劑。不同溶劑中OPFRs 的響應如表3 所示。

表3 不同溶劑中OPFRs 的響應Table 3 Response of OPFRs in different solvents

2.4 基質效應

基質效應在液相色譜-質譜聯(lián)用技術中普遍存在，主要是由于共提取物與目標分析物在電噴霧離子源上存在競爭效應。以不含OPFRs 的嬰兒米粉作為空白基質，按1.2.2 進行樣品前處理并獲得空白基質溶液，分別在空白基質溶液和80%甲醇中加入同等濃度（10 種OPFRs 10 μg/L，TEHP 1 μg/L）的混合標準溶液，將OPFRs 在空白基質溶液中的峰面積與80%甲醇中的峰面積進行比較，比值大于100%代表基質增強，反之代表基質抑制。結果表明，除了TnBP基質抑制效應較強（61.6%）外，其余10 種目標物的基質效應在85.9%～125.3%，表明嬰兒米粉經(jīng)過樣品前處理之后基質去除效果明顯?？紤]到大部分OPFRs的基質效應均在80%～120%范圍內，因此仍采用80%甲醇配制標準溶液系列以滿足高通量檢測要求。

2.5 方法學參數(shù)

本方法采用離子對和保留時間定性，外標法定量。按1.2.1 配制標準溶液系列、儀器工作條件測定，以峰面積A 和對應的標準溶液系列濃度C 繪制標準曲線，除TEHP 之外，其余10 種OPFRs 在0.5～100 μg/L范圍內相關性良好，相關系數(shù)＞0.996。而TEHP 的響應很強，濃度過高時標準曲線會出現(xiàn)彎曲，最終確定TEHP 的線性范圍為0.05～10 μg/L，相關系數(shù)＞0.994。以信噪比S/N=3 和S/N=10 確定11 種OPFRs測定方法的檢出限（Limit of detection，LOD）為0.003～0.926 μg/kg，定量限（Limit of quantitation，LOQ）為0.01～2.78 μg/kg。11 種OPFRs 的方法檢出限、定量限、線性相關系數(shù)見表4。分別在嬰兒米粉中加入低、中、高3 個濃度水平的混合標準溶液，加標回收率為63.2%～113.4%，相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）均小于10%。方法學結果較為滿意。加標實驗結果見表5。

表4 11 種OPFRs 的檢出限、定量限、線性相關系數(shù)及線性方程Table 4 LOD, LOQ, linear correlation coefficient and linear equation of 11 kinds of OPFRs

表5 嬰兒米粉中OPFRs 的加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 5 Recovery rate and relative standard deviation of OPFRs in babyrice cereal (n=6)

2.6 樣品測定

將市售的4 種嬰兒米粉分別混勻，按1.2.2 進行樣品前處理，結果顯示，4 種嬰兒米粉中TPhP 的檢出率高達100%，含量在6.7～23.0 μg/kg 范圍內。其中一份嬰兒米粉還檢出了TnBP（15.6 μg/kg）和TCPP（14.6 μg/kg）。

3 結論

本法基于超高效液相色譜質譜聯(lián)用技術，建立了適用于嬰兒米粉中 11 種 OPFRs 的檢測方法。通過優(yōu)化質譜、色譜條件，有效分離了兩對同分異構體，且縮短了分析時間。通過拆分樣品分析全流程，發(fā)現(xiàn)濾膜中含有 TEP 可能導致檢測結果的假陽性。通過篩選濾膜材質，采用 PTFE 濾膜過濾，排除了 TEP 假陽性的問題。優(yōu)化了樣品提取溶劑，選擇0.5% 甲酸乙腈作為提取溶劑；優(yōu)化分散固相萃取凈化管，選擇 A 管進行凈化分析。建立的檢測方法，11 種 OPFRs 線性關系良好，檢出限（3S/N）低，靈敏度高。嬰兒米粉中低、中、高 3 個添加濃度水平的加標回收率結果均較為滿意。實際樣品測定結果顯示，4 種嬰兒米粉中 TPhP 的檢出率高達 100%，其中一份嬰兒米粉還檢出了 TnBP 和 TCPP。本方法減少了實驗操作誤差，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可以實現(xiàn) 11 種 OPFRs 的有效分離和準確定量測定，可以滿足嬰兒米粉中痕量 OPFRs 定量分析的要求，對食品中 OPFRs 的監(jiān)控有參考意義。