張 雯，張禧慶，董淑君，王 丹，馬 越, ，鄭振佳

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與食品營養(yǎng)研究所，果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；3.山東杰諾檢測服務(wù)有限公司，山東煙臺 265200）

南瓜廣泛種植于世界各地，具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤等作用，深加工過程會產(chǎn)生大量南瓜皮副產(chǎn)物，大量丟棄造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。南瓜皮富含多糖，從南瓜皮中提取多糖，可以促進(jìn)南瓜資源的綜合利用，提高其工業(yè)附加值。目前關(guān)于南瓜多糖的研究大多集中于提取工藝優(yōu)化、結(jié)構(gòu)解析及生物活性評價等方面，有關(guān)南瓜多糖與金屬離子螯合的研究較少。

三價鉻離子是葡萄糖耐量因子的重要組成，可以加速葡萄糖在體內(nèi)的利用，具有降血糖作用。但該形式會影響鉻的吸收利用，研究表明與有機(jī)物復(fù)合后的鉻更易被吸收，因此開發(fā)一種具有生物活性的新型有機(jī)鉻產(chǎn)品具有重要意義。多糖結(jié)構(gòu)中含有羥基、羧基等基團(tuán)，可以與三價鉻離子以配位鍵結(jié)合，形成多糖鉻復(fù)合物，能夠更好地被人體利用。多糖金屬離子復(fù)合物既保持了天然多糖的生物活性，又可發(fā)揮金屬元素的生理作用。目前已報道的可與鉻進(jìn)行復(fù)合的多糖有黃芪多糖、灰樹花多糖、靈芝多糖、苦瓜多糖、樺褐孔菌多糖和海藻多糖等，這些研究多集中于多糖鉻的螯合工藝及降血糖、降血脂等生物活性的分析，但有關(guān)鉻與南瓜多糖螯合產(chǎn)物的制備和消化過程中的生物接受率的研究較少。

本研究從南瓜皮中提取南瓜皮多糖，采用單因素法和響應(yīng)面法確定南瓜皮多糖與三價鉻離子的最佳螯合工藝，并研究南瓜皮多糖鉻的體外消化特性，為南瓜皮多糖鉻的高效制備與新型補(bǔ)鉻產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

愛碧斯南瓜皮 山東省煙臺市萊陽市孟宇食品有限公司提供；氯化鉻 分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；三價鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 μg/mL） 北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院；無水乙醇、氫氧化鈉 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸 優(yōu)級純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硝酸 UP 級，蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司；人工胃液、人工腸液福州飛凈生物科技有限公司；透析袋 怡康科貿(mào)生物試劑耗材實(shí)驗(yàn)有限公司。

電感耦合等離子體質(zhì)譜7800（ICP-MS-7800）美國安捷倫公司；Multiwave PRO 微波消解儀 奧利地安東帕公司；FD-304 冷凍干燥機(jī) 濟(jì)南駿德儀器有限公司；DKZ-2B 電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科技儀器有限公司；SECURA224-ICN 型電子天平賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；S210 pH 計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南瓜皮多糖的制備 稱取新鮮南瓜皮1 kg，切碎，加入去離子水6 L，水提90 min，過濾后收集濾液，重復(fù)提取一次；合并濾液，濃縮，加入4 倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，收集沉淀并復(fù)溶，Sevag 法除蛋白后醇沉，冷凍干燥得南瓜皮多糖。苯酚-硫酸法測得南瓜皮多糖含量為77.79%。

1.2.2 南瓜皮多糖鉻復(fù)合物的制備 稱取一定質(zhì)量的南瓜皮多糖溶于200 mL 去離子水中，與一定濃度的氯化鉻溶液等體積混合，調(diào)節(jié)混合液pH，在一定溫度下反應(yīng)一段時間。反應(yīng)完畢后，加入4 倍體積的無水乙醇，醇沉，離心10 min，沉淀復(fù)溶后透析48 h，冷凍干燥得南瓜皮多糖鉻。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 鉻與多糖質(zhì)量比對螯合率的影響 將不同質(zhì)量比（0.01:1，0.05:1，0.1:1，0.2:1，0.5:1，1:1）的南瓜皮多糖與鉻混合液調(diào)整反應(yīng)pH 為7，在70 ℃振蕩120 min，加入4 倍體積的無水乙醇，醇沉，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定上清液中鉻離子含量，計算螯合率，考察鉻與多糖質(zhì)量比對螯合率的影響。

1.2.3.2 反應(yīng)溫度對螯合率的影響 固定鉻與多糖質(zhì)量比為0.2:1，反應(yīng)pH 為7，將混合液在不同溫度（50、60、70、80、90 ℃）下振蕩120 min，醇沉后測定上清液中鉻離子含量，相關(guān)步驟按照“1.2.3.1”操作，考察反應(yīng)溫度對螯合率的影響。

1.2.3.3 反應(yīng)pH 對螯合率的影響 固定鉻與多糖質(zhì)量比為0.2:1，調(diào)節(jié)不同pH（6、7、8、9、10）后將混合液在70 ℃振蕩120 min，醇沉后測定上清液中鉻離子含量，相關(guān)步驟按照“1.2.3.1”操作，考察反應(yīng)pH 對螯合率的影響。

1.2.3.4 反應(yīng)時間對螯合率的影響 固定鉻與多糖質(zhì)量比為0.2:1，反應(yīng)pH 為7，將混合液在70 ℃分別振蕩不同時間（60、90、120、150、180、210 min），醇沉后測定上清液中鉻離子含量，相關(guān)步驟按照“1.2.3.1”操作，考察反應(yīng)時間對螯合率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以單因素結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇對南瓜皮多糖鉻螯合率影響顯著的鉻與多糖質(zhì)量比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH 進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以螯合率為響應(yīng)值，因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素及水平Table 1 Response surface analysis factor and level coding table

1.2.5 螯合率的計算

1.2.6 鉻含量的計算

1.2.6.1 鉻標(biāo)曲的繪制 利用三價鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL 的鉻溶液。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定，儀器操作條件參考GB 5009.268-2016。以鉻元素濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)信號值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=32.1232X+0.0063，=0.9998。

1.2.6.2 鉻含量的測定 稱取南瓜皮多糖鉻0.02 g，加7 mL 濃硝酸浸泡過夜，微波消解，分別于120 ℃消解3 min，180 ℃消解10 min，爬升時間5 min，趕酸1 h，冷卻后轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中，去離子水定容，稀釋50 倍后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定。

1.2.7 體外消化試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[19-20]并稍作修改，對南瓜皮多糖鉻和氯化鉻進(jìn)行體外模擬消化試驗(yàn)。向5 mg/mL 的南瓜皮多糖鉻和鉻溶液中添加1 mol/L 的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 至2，加入等體積模擬胃液，混勻后在37 ℃的水浴分別振蕩反應(yīng)0、30、60、90、120、150、180、210、240 min，在95 ℃沸水浴中滅酶處理10 min，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

取模擬胃液消化120 min 后的南瓜皮多糖鉻和氯化鉻溶液，冷卻至室溫后加入1 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)pH 至7，將等體積模擬腸液混入均勻，轉(zhuǎn)入透析袋中，在37 ℃的恒溫水浴震蕩器中分別反應(yīng)1、2、4、6、8 h 后，反應(yīng)后在95 ℃沸水浴中滅酶處理10 min，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7.1 鉻離子溶解率的測定 向消化后的溶液中加入4 倍體積的無水乙醇醇沉，5000 r/min 離心10 min后取上清液，測定鉻離子含量，按照下列公式計算：

式中：S 表示上清液中鉻離子的濃度，μg/mL；Y 表示樣品中鉻離子的濃度，μg/mL。

1.2.7.2 透析率的測定 將消化后的溶液取樣，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定鉻離子含量，按照下列公式計算：

式中：T 表示透析液鉻離子的濃度，μg/mL；V 表示透析液體積，mL；Y 表示樣品中鉻離子的含量，μg/g；M 表示樣品的質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)平行三次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；利用Design Expert 8.0.6 軟件中的Box-Bohnken 法優(yōu)化試驗(yàn)方案并處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析（Duncan 法，n=3，＜0.05）；采用Origin 2019 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 鉻與多糖質(zhì)量比對螯合率的影響 由圖1 可知，隨著鉻與多糖質(zhì)量比的增大，螯合率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當(dāng)質(zhì)量比為0.05:1 時，螯合率達(dá)到最大值為92.22%。當(dāng)質(zhì)量比大于0.05:1 時，螯合率降低，這種變化可能是因?yàn)槟瞎掀ざ嗵欠肿又械慕Y(jié)合位點(diǎn)暴露減少，導(dǎo)致螯合率不高，故選擇鉻與多糖質(zhì)量比為0.05:1 為最佳。

圖1 鉻與多糖質(zhì)量比對螯合率的影響Fig.1 Effects of the mass fraction between chromium and polysaccharide on the chelation rate of PPP-Cr（III） complex

2.1.2 反應(yīng)溫度對螯合率的影響 由圖2 可知，反應(yīng)溫度在50～60 ℃時螯合率呈遞增的趨勢，當(dāng)溫度為60 ℃時，螯合率達(dá)到最高，為77.33%。隨著溫度的繼續(xù)升高，螯合率下降，這可能是因?yàn)闇囟葧绊懛肿又g的碰撞頻率，當(dāng)溫度過高時，多糖分子與鉻離子運(yùn)動過快，解析速率高于結(jié)合速率。因此，溫度選擇60 ℃為最佳。

圖2 反應(yīng)溫度對螯合率的影響Fig.2 Effects of the reaction temperature on the chelation rate of PPP-Cr（III） complex

2.1.3 反應(yīng)pH 對螯合率的影響 由圖3 可知，隨著pH 的增大，螯合率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當(dāng)pH 小于7 時，螯合率隨pH 的增大而增加，在pH 為7 時螯合率達(dá)到最大值；隨著pH 繼續(xù)增大，南瓜皮多糖與鉻離子的螯合率下降，這可能是因?yàn)樗嵝詶l件下H與鉻離子競爭在多糖上的結(jié)合位點(diǎn)；堿性條件下，部分鉻離子因堿性環(huán)境溶解度下降，導(dǎo)致螯合率下降。因此，選擇pH 為7 為最佳。

圖3 反應(yīng)pH 對螯合率的影響Fig.3 Effects of the reaction pH on the chelation rate of PPPCr（III） complex

2.1.4 反應(yīng)時間對螯合率的影響 由圖4 可知，反應(yīng)時間在60～180 min 以內(nèi)時，南瓜皮多糖鉻的螯合率趨于平穩(wěn)狀態(tài)，隨著時間的延長，螯合率保持在71%左右，可發(fā)現(xiàn)時間對螯合率的影響較小，因此可將反應(yīng)時間作為次要考慮因素，不作為響應(yīng)面優(yōu)化的參數(shù)。

圖4 反應(yīng)時間對螯合率的影響Fig.4 Effects of the reaction time on the chelation rate of PPP-Cr（III） complex

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的結(jié)果上，選擇鉻與多糖質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH 進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2，回歸方程方差分析見表3。由表3 可知，模型＜0.01，表明模型極顯著，失擬項(xiàng)=0.3123＞0.05，表明不顯著，=0.9233，=0.8247，表明模型的擬合效果較好。以南瓜皮多糖鉻的螯合率（%）為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到的回歸方程為：Y=96.17+10.65A+4.97B+2.62C-8.21AB-5.54AC-4.62BC-9.15A-4.69B-3.36C。根據(jù)回歸方程及方差分析可知，影響螯合率的主次順序?yàn)殂t與多糖質(zhì)量比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)pH，此外，一次項(xiàng)A 及二次項(xiàng)A對螯合率的影響極顯著，一次項(xiàng)B及交互項(xiàng)AB 對螯合率的影響顯著。一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AC、BC 及二次項(xiàng)B、C對螯合作用影響不顯著。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations

2.2.2 三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖分析 鉻與多糖質(zhì)量比和反應(yīng)溫度、鉻與多糖質(zhì)量比和反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH 的交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖分別如圖5 所示。在鉻與多糖質(zhì)量比和反應(yīng)溫度的交互作用中，鉻與多糖質(zhì)量比方向的響應(yīng)面更陡峭，等高線更加密集，而在反應(yīng)溫度方向的響應(yīng)面較為平緩，等高線較為稀疏，表明鉻與多糖質(zhì)量比對螯合率的影響更顯著。在鉻與多糖質(zhì)量比和反應(yīng)pH的交互作用中，鉻與多糖質(zhì)量比方向的響應(yīng)面更陡峭，等高線更加密集，而在反應(yīng)pH 方向的響應(yīng)面較為平緩，等高線較為稀疏，表明鉻與多糖質(zhì)量比對螯合率的影響更顯著。在反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH 的交互作用中，反應(yīng)溫度方向的響應(yīng)面更陡峭，等高線更加密集，而在反應(yīng)pH 方向的響應(yīng)面較為平緩，等高線較為稀疏，表明反應(yīng)溫度對螯合率的影響更顯著。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.5 The response surface plots and contour plots of the interaction of various factors

2.2.3 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 通過模型預(yù)測得到南瓜皮多糖鉻復(fù)合物的最佳合成條件為：鉻與多糖質(zhì)量比0.08:1，溫度60.94 ℃，pH6.84，南瓜皮多糖鉻復(fù)合物的理論最大螯合率為99.33%?？紤]實(shí)際情況，將條件調(diào)整為鉻與多糖質(zhì)量比0.08:1，溫度60 ℃，pH6.8，在此條件下，南瓜皮多糖鉻復(fù)合物螯合率為99.23%±0.12%，與模型預(yù)測值相近，相差0.10%。可選用該模型。

2.3 南瓜皮多糖鉻和氯化鉻的體外消化特性

2.3.1 南瓜皮多糖鉻和氯化鉻在模擬胃液中的消化情況 南瓜皮多糖鉻和氯化鉻在胃液中的鉻離子溶解率如圖6 所示。從圖6 中可以看出，氯化鉻在胃液中的溶解率較高，在30～150 min 內(nèi)，溶解率先下降后上升，150 min 時溶解率達(dá)到最大值39.92%，隨著反應(yīng)的進(jìn)行溶解率呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，推測前期鉻離子會與胃液中的胃蛋白酶結(jié)合使所得鉻離子溶解率較低，后期在酸性環(huán)境下解離速度大于結(jié)合速度，導(dǎo)致胃液中濃度上升。南瓜皮多糖鉻的鉻離子溶解率隨時間的增加而增大，但遠(yuǎn)小于氯化鉻中鉻離子的溶解率，這可能是因?yàn)槟瞎掀ざ嗵倾t對胃液具有抗消化性，因此解析程度較弱，緩釋性較好。

圖6 鉻離子溶解率在胃液中隨反應(yīng)時間的變化Fig.6 Variation of solubility of chromium ions in gastric juice with digestion time

2.3.2 南瓜皮多糖鉻和氯化鉻在模擬腸液中的消化與吸收情況 南瓜皮多糖鉻和氯化鉻在腸液中的消化情況見圖7。在1～6 h 內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的增加，氯化鉻的鉻離子溶解率顯著下降（＜0.05），當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時溶解率為0.9%，主要是因?yàn)樵谌鯄A性環(huán)境下鉻離子生成鉻沉淀，導(dǎo)致溶解率降低。南瓜皮多糖鉻的鉻離子在腸液中的溶解率低于胃液，溶解率低于氯化鉻，含量趨勢為先上升后保持穩(wěn)定，南瓜皮多糖鉻在堿性環(huán)境下溶解率不高，但因?yàn)樘堑谋Ｗo(hù)作用沒有引起鉻離子含量下降。

圖7 鉻離子溶解率在腸液中隨反應(yīng)時間的變化Fig.7 Changes of chromium ions solubility in intestinal fluid with digestion time

南瓜皮多糖鉻和氯化鉻在腸液中的透析率隨反應(yīng)時間的變化見圖8。南瓜皮多糖鉻的透析率在0.2%～1.0%之間且隨時間的延長而增加，這與Garcia等發(fā)現(xiàn)飲食中鉻的透析率在0.4%～1.6%之間的結(jié)果接近。南瓜皮多糖鉻的透析率大于氯化鉻在腸液中的透析率，原因推測為多糖及其消化產(chǎn)物與鉻離子結(jié)合，具有一定的保護(hù)作用，提高了鉻離子的透過率。結(jié)果表明，南瓜皮多糖鉻的生物接受率高于氯化鉻，與Disilvestro 等發(fā)現(xiàn)吡啶甲酸鉻比氯化鉻利用率更高的結(jié)果類似。

圖8 鉻離子透析率在腸液中隨反應(yīng)時間的變化Fig.8 Changes of chromium ions dialysis rate in intestinal fluid with digestion time

3 結(jié)論

本研究建立了南瓜皮多糖鉻復(fù)合物制備工藝，考察了鉻與多糖質(zhì)量比、溫度、pH 和時間對南瓜皮多糖鉻螯合率的影響。根據(jù)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定了對螯合率影響順序依次是質(zhì)量比、溫度、pH，最佳工藝條件為鉻與多糖質(zhì)量比0.08:1，溫度60 ℃，pH6.8，螯合率為99.23%±0.12%，優(yōu)化后的工藝可用于南瓜皮多糖鉻的制備。體外消化模擬試驗(yàn)表明，南瓜皮多糖鉻在胃腸液中的溶解率低于氯化鉻，在胃液酸性環(huán)境中具有一定緩釋效果，在腸液中的透析率高于氯化鉻，因此南瓜皮多糖鉻具有較高的生物接受率。本研究為新型補(bǔ)鉻產(chǎn)品的開發(fā)和南瓜皮的綜合利用提供參考。