蓋賽倫，陳曉潔，凌 濤，張騰勛，耿 萌，齊 威，羅學(xué)剛，張同存，王 楠,

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，教育部工業(yè)發(fā)酵微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制工程研究中心，天津 300457）

嬰兒期是腸道菌群定殖的關(guān)鍵時(shí)期，腸道菌群早期定殖模式可以影響腸道生理發(fā)育、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等的成熟，影響遠(yuǎn)期肥胖、過敏性疾病等的發(fā)病幾率。近年來，國內(nèi)外大量研究顯示腸道微生物參與調(diào)控腸道細(xì)胞增殖分化，其中，益生菌發(fā)揮了極重要的益生作用。益生菌的干預(yù)對(duì)動(dòng)物早期腸道形態(tài)發(fā)育、腸道上皮細(xì)胞增殖分化、腸道緊密連接及粘膜屏障形成等腸道發(fā)育過程有重要影響。一方面，益生菌可以通過自身組分（如菌毛蛋白、細(xì)胞壁成分等）、代謝產(chǎn)物（丁酸等）、分泌蛋白（如鼠李糖乳桿菌LGG 分泌的P40 和P75）等促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖分化、增強(qiáng)腸道粘膜屏障功能；另一方面，益生菌還可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)腸道功能，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體腸道粘膜免疫功能。

鼠李糖乳桿菌（）是一種存在于人體腸道中的革蘭氏陽性菌。其中，鼠李糖乳桿菌LGG 是目前全球研究最為廣泛，應(yīng)用最多的益生菌之一，主要通過平衡腸道菌群、維護(hù)腸道屏障結(jié)構(gòu)完整、調(diào)節(jié)腸道免疫功能和增強(qiáng)腸道免疫力發(fā)揮對(duì)腸道的保護(hù)作用。LGG 通過促進(jìn)腸道緊密連接和黏蛋白表達(dá)維護(hù)腸道屏障結(jié)構(gòu)完整。LGG 的早期定殖（出生后1～5 d）促進(jìn)了小鼠腸道功能成熟和免疫球蛋白A 的產(chǎn)生，同時(shí)降低了其成年后對(duì)結(jié)腸炎的易感性。然而，目前可用于嬰幼兒食品的益生菌菌株十分有限，且大多數(shù)為國外菌株，因此，篩選具有促進(jìn)腸道生長發(fā)育潛能的鼠李糖乳桿菌，一方面對(duì)于研究益生菌調(diào)節(jié)腸道發(fā)育的功能機(jī)制具有重要科學(xué)價(jià)值；另一方面對(duì)于開發(fā)具有維護(hù)嬰幼兒腸道健康以及臨床腸道損傷修復(fù)作用的益生功能食品具有重要意義。

目前，大量用于研究益生菌在腸道發(fā)育和腸道疾病中作用的體外模型主要依賴于永生化的細(xì)胞系，但由于腸道不同部位的組織具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生理功能，使用單一的離體細(xì)胞模型，很難模擬人體腸道的結(jié)構(gòu)、功能，導(dǎo)致研究結(jié)果具有局限性。最近的研究表明，離體的腸道干細(xì)胞和隱窩可以在基質(zhì)膠中經(jīng)由3D 培養(yǎng)模式形成腸道類器官。這一結(jié)構(gòu)包含特定組織來源的所有終末分化細(xì)胞，在形態(tài)和細(xì)胞組成上與體內(nèi)腸道極為相似。來自小腸的腸道類器官由于其隱窩豐富通常是體外研究腸道發(fā)育和損傷修復(fù)的良好工具。目前已有利用小腸類器官研究益生菌對(duì)腸道發(fā)育影響的相關(guān)報(bào)道。Wu 等研究證實(shí)了羅伊氏乳桿菌（）D8 既可以在生理?xiàng)l件下促進(jìn)來自小腸的腸道類器官生長增殖，也可以改善TNF-誘導(dǎo)的腸道類器官的損傷，促進(jìn)腸道上皮的修復(fù)。Hou 等利用腸道類器官與固有層淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，證明了羅伊氏乳桿菌D8 可以通過刺激固有層淋巴細(xì)胞分泌IL-22 來促進(jìn)腸道干細(xì)胞及腸上皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而修復(fù)受損的腸道屏障。

本研究以從1 月齡健康嬰兒糞便中分離鑒定的5 株鼠李糖乳桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，比較其耐酸、耐膽鹽、表面疏水性、自動(dòng)聚集能力及黏附性能，篩選出具有優(yōu)良抗性和黏附性能的鼠李糖乳桿菌SW-02，并進(jìn)一步利用腸道類器官模型對(duì)鼠李糖乳桿菌SW-02 的促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖、完善腸道緊密連接及粘膜屏障的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用菌株鼠李糖乳桿菌LGG 菌株 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，菌種保藏號(hào)：ATCC 53103；5 株鼠李糖乳桿菌SW-01、SW-02、SW-03、SW-04、SW-X 和兩株副干酪乳桿菌TX-01、TX-02 分離自1 月齡健康嬰兒糞便，保藏于天津科技大學(xué)工業(yè)微生物菌種資源平臺(tái)；雄性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠（4 周齡） 中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（北京），動(dòng)物試驗(yàn)均按照天津科技大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)（GB/T 35892-2018）批準(zhǔn)的方案進(jìn)行；人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29（ATCC HTB-38） 保藏于本實(shí)驗(yàn)室，用10%胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO的條件下培養(yǎng)。

MRS 培養(yǎng)基、瓊脂粉、瓊脂糖、鹽酸、牛膽鹽、青-鏈霉素、冰杜爾貝科磷酸鹽緩沖液（Dulbecco Phosphate-Buffered Saline，DPBS）、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（20000～28880 U/mg）、Trizol 試劑、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） 北京索萊寶科技有限公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基 美國Gibco 公司；胎牛血清新西蘭Newzerum 公司；溫和細(xì)胞解離試劑（Gentle Cell Dissociation Reagent，GCDR）、類器官培養(yǎng)基（IntestiCult OGM Mouse Kit） 加拿大干細(xì)胞技術(shù)有限公司；基質(zhì)膠（Matrigel Matrix） 美國BD 公司；SYBRGreen qPCR Master mix 德國DBI Bioscience 公司；EdU 檢測試劑盒 大連美侖生物技術(shù)有限公司；小鼠黏蛋白2（Mucin2，MUC2）檢測試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；多聚甲醛 天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；TritonX-100、四甲基偶氮唑鹽（MTT） 美國Sigma 公司；胎牛血清（FBS） 澳洲Ausbian 公司。

TUS-200P 振蕩型恒溫金屬浴 中國上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD 型單人單面凈化工作臺(tái)中國上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；HE-120 多功能水平電泳槽 中國上海天能科技有限公司；SKY-2102C 生化培養(yǎng)箱 中國上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；311 型CO培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾科技有限公司；ECLIPSE TE2000U 倒置顯微鏡 日本尼康公司；LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器 中國上海申安有限公司；Hybrid Technology多功能酶標(biāo)儀美國伯騰儀器有限公司；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；JIDI-18D 離心機(jī) 廣州吉迪儀器有限公司；TY-80B 脫色搖床常州潤華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化和生長曲線測定 從-80 ℃冰箱取出凍存的菌液，在無菌超凈臺(tái)中劃線于固體MRS培養(yǎng)基上，挑取單菌落于5 mL 液體MRS 培養(yǎng)基中活化兩次，將活化的菌體以1%（v/v）的接種量接種于液體MRS 培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫孵育器24 h，每隔2 h 取樣，并在600 nm 波長處測定其光密度值，繪制菌株的生長曲線。

1.2.2 供試菌株耐受性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 耐酸性能力測定 參照郝冉等的方法，將離心洗滌后的菌體分別重懸于經(jīng)溶解度為36%～37%的鹽酸調(diào)節(jié)后pH 為1、2、3 的液體MRS 培養(yǎng)基中，以正常pH 的菌液作為對(duì)照（正常生長狀態(tài)的乳酸菌），調(diào)整菌液濃度為5×10CFU/mL。各組分別取100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)4 h。每孔加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 作用4 h，終止培養(yǎng)后每孔加入100 μL 的二甲基亞砜，在室溫于轉(zhuǎn)速為100 r/min 的搖床上振蕩15 min 以充分溶解結(jié)晶物。利用多功能酶標(biāo)儀測量570 nm 波長處的吸光度（OD）值，存活率按以下公式計(jì)算：

1.2.2.2 耐膽鹽能力測定 參照Liu 等的方法，將活化的菌體以10CFU/mL 分別接種在空白對(duì)照MRS 液體培養(yǎng)基、含有0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的MRS 液體培養(yǎng)基中，以不含膽鹽的菌液作為對(duì)照（正常生長狀態(tài)的乳酸菌）。37 ℃培養(yǎng)4 h，采用同1.2.2.1 的MTT 方法進(jìn)行檢測和計(jì)算存活率。

1.2.2.3 菌株疏水率測定 參照杜蘭蘭等的方法，將活化的菌體以2%（v/v）接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。菌液以5000 r/min離心10 min 收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS，pH7.2）洗滌2 次后重懸。利用多功能酶標(biāo)儀在600 nm 處檢測其吸光度即初始吸光度值OD，之后將3 mL 細(xì)菌懸浮液與600 μL 的二甲苯（5:1）混合，漩渦振蕩2 min。室溫孵育1 h，棄去有機(jī)相，取水相于600 nm 波長處測定其吸光度值OD，表面疏水性按以下公式計(jì)算：

1.2.2.4 菌株自動(dòng)聚集率測定 參照杜蘭蘭等的方法，將活化的菌體以2%（v/v）接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。將菌懸液漩渦振蕩10 min 后在600 nm 波長下測定其吸光值作為整個(gè)細(xì)菌懸液的吸光值（OD），后放于37 ℃靜置孵育。分別在30、60、90、120、150 min時(shí)取上層樣品，測定其吸光度（OD）。自動(dòng)聚集率按以下公式計(jì)算：

1.2.2.5 對(duì)腸道細(xì)胞的黏附能力評(píng)價(jià) 參照Li 等的方法評(píng)價(jià)細(xì)菌對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 的黏附能力。將HT-29 細(xì)胞接種于96 孔板中，待細(xì)胞長至單層貼壁狀態(tài)，1×PBS 清洗細(xì)胞兩次后加入無抗生素和無血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基預(yù)孵育37 ℃培養(yǎng)30 min。將活化的菌體以10CFU/mL 懸浮于無抗生素和無血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中以制備細(xì)菌懸液，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基后每孔加入制備好的細(xì)菌懸液100 μL，37 ℃孵育2 h，PBS 洗去未黏附的細(xì)菌后于波長570 nm 處測定吸光值（黏附菌組），以未進(jìn)行PBS 清洗細(xì)菌的細(xì)胞作為總菌組，以不加細(xì)菌懸液的細(xì)胞組作為對(duì)照組，之后采用同1.2.2.1 的MTT方法進(jìn)行檢測和計(jì)算黏附能力。計(jì)算公式如下：

1.2.3 供試菌株對(duì)腸道類器官生長的影響

1.2.3.1 類器官的提取與分離 參考Sato 等的方法略作修改，在幽門下5 cm 處及距回盲部5 cm 處分別離斷小腸。將小腸放入DPBS 中，去除殘留的腸系膜及血管，然后用10 mL 注射器吸取冰DPBS從靠近幽門端沖洗腸腔，使腸內(nèi)容物排出。將洗凈的小腸剪成5 mm 左右的片段，轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管，冰浴靜置至腸片段沉底，棄掉上清，加入25 mL 溫和細(xì)胞解離試劑置于搖床上以20 r/min 轉(zhuǎn)速室溫孵育15 min，用含有0.1% FBS 的PBS 終止消化，反復(fù)吹吸，自然靜置5min 吸取上清，以70 μm 細(xì)胞過濾器過濾收集上清液，沉淀，重復(fù)上述吹吸步驟3 次。過濾后的上清液于4 ℃以300 g 的離心速率離心5 min，棄上清液，分別用預(yù)冷的添加1%青-鏈霉素的PBS和DMEM/F-12 培養(yǎng)基重懸沉淀并離心進(jìn)行清洗。最后加入適當(dāng)體積類器官生長培養(yǎng)基重懸沉淀，以1:2 比例與Matrigel 混勻，按每孔50 μL 的體積種植到37 ℃預(yù)溫的24 孔板中，放入培養(yǎng)箱中1 h，待基質(zhì)膠固化后，加入500 μL 類器官生長培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d 換一次培養(yǎng)基，每5～7 d 傳代一次。

1.2.3.2 類器官與菌株共培養(yǎng)及出芽率、出芽個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù) 倒置顯微鏡下觀察類器官的生長情況，將類器官以50 個(gè)/孔的密度接種到24 孔板，待1～2 d 后生長到具有一定球形類器官結(jié)構(gòu)時(shí)與菌株進(jìn)行共培養(yǎng)。將菌體用類器官生長培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，以1×10CFU/孔的密度加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)分為3 組進(jìn)行，對(duì)照組（Control）、LGG 共培養(yǎng)組和SW-02 共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)3 d，在光學(xué)顯微鏡下觀察類器官生長情況，并計(jì)算類器官的出芽率及出芽個(gè)數(shù)。

1.2.3.3 EdU 染色評(píng)估類器官的增殖狀態(tài) 類器官的增殖情況利用EdU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行。首先對(duì)處理后的類器官進(jìn)行EdU 標(biāo)記，每孔加入200 μL 含有50 μmol/L EdU 的培養(yǎng)基孵育2 h，棄去培養(yǎng)基。用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，然后利用Apollo?熒光染料進(jìn)行染色，最后用Hoechst33342 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色以評(píng)估總細(xì)胞數(shù)，并在共聚焦顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算EdU 陽性細(xì)胞數(shù)的比例。

1.2.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測定基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 利用Trizol 試劑提取總RNA，取2 μg RNA 用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR 擴(kuò)增體系20 μL：qPCR master mix 10 μL，50×ROX 0.4 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，無菌蒸餾水7.6 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃l min，55 ℃ l min，95 ℃ 15 s 繪制熔解曲線。以GAPDH 作為參考基因，2法計(jì)算目標(biāo)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。目標(biāo)基因的引物序列見表1。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 引物Table 1 Primers for real-time PCR

1.2.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測定MUC2含量 類器官與菌體共培養(yǎng)后，離心收集培養(yǎng)基上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測培養(yǎng)基上清液中MUC2 水平，試劑盒采用小鼠MUC2 的ELISA 檢測試劑盒，檢測方法參考說明書進(jìn)行。最后在450 nm波長測定光密度值，同時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣本中MUC2 含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。運(yùn)用SPSS 19.0 軟件，通過One-way ANOVA 和Two-way ANOVA 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行繪圖及擬合處理。＜0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的生長曲線測定

通過生長曲線的測定來評(píng)價(jià)所篩菌株的差異性，結(jié)果如圖1 所示：

圖1 供試菌株的生長曲線Fig.1 Growth curve of the tested strains

由圖1 可以看出，所有的鼠李糖乳桿菌菌株在0～4 h 為生長遲滯期，4～12 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，OD由0.1 左右迅速提高至1.3 左右，此時(shí)生長速度較快。12 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，OD基本不變，與對(duì)照菌LGG 無明顯差異。而兩株副干酪乳桿菌TX-01和TX-02 生長較為緩慢，24 h 時(shí)OD 值分別為1.11和1.06。

2.2 供試菌株的耐受性

2.2.1 耐酸性能力測試 從圖2 可以看出：當(dāng)pH為1、2 和3 時(shí)，鼠李糖乳桿菌SW-02 的存活率顯著高于商用菌株LGG（＜0.05），存活率分別達(dá)到了23.13%±1.75%、30.36%±2.54%和50.73%±2.77%。同時(shí)，在pH 為3 時(shí)，鼠李糖乳桿菌SW-03 和鼠李糖乳桿菌SW-X 的存活率顯著高于除SW-02 與LGG外的其他四組（＜0.05），存活率分別達(dá)到了35.17%±1.49%和33.51%±1.88%，也有較強(qiáng)的耐酸性。這表明SW-02、SW-03 和SW-X 具有更優(yōu)的耐酸性，能在高濃度的胃液中存活并進(jìn)入小腸。郭羽等證實(shí)，LGG 在pH1.5 和2 的條件下培養(yǎng)4 h 其存活率分別為25.12%和27.96%。賀珊珊等對(duì)5 株益生菌進(jìn)行耐酸性篩選，其中鼠李糖乳桿菌LR-D 能夠短時(shí)耐受低pH 環(huán)境，在pH2.5 的發(fā)酵液中培養(yǎng)2 h的存活率能夠達(dá)到14.39%。對(duì)照本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SW-02 的耐酸能力與上述菌相比更有優(yōu)勢。

圖2 供試菌株的耐酸性能力Fig.2 Acid resistance of the tested strains

2.2.2 耐膽鹽能力測試 從圖3 可以看出，鼠李糖乳桿菌SW-X、SW-03 和SW-02 的耐膽鹽能力最為突出，顯著高于對(duì)照菌株鼠李糖乳桿菌LGG 和其余菌株（＜0.05），在膽鹽濃度為0.3%時(shí)，存活率分別達(dá)到了51.04%±4.61%、47.02%±4.11%和47.35%±4.21%。而SW-01、SW-04、TX-01 和TX-02 的存活率與LGG 相差不大。這表明，SW-X、SW-03 和SW-02具有更優(yōu)的耐膽鹽性。與本文的研究結(jié)果相似，呂嘉櫪等發(fā)現(xiàn)在膽鹽濃度為0.1%～0.3%時(shí)，LGG 菌落存活率為37%～60%。薛梅等發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌LV108 在膽鹽濃度為0.3%時(shí)，培養(yǎng)2 h 后存活率在45%左右，在膽鹽濃度為0.1%時(shí)，培養(yǎng)2 h 后存活率大于75%。對(duì)照本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SW-X、SW-03 和SW-02 在相同濃度膽鹽處理4 h 時(shí)，存活率與鼠李糖乳桿菌LV108 處理2 h 時(shí)結(jié)果相似，表明本實(shí)驗(yàn)篩選菌株SW-X、SW-03 和SW-02 具有更好的耐膽鹽能力。

圖3 供試菌株的耐膽鹽能力Fig.3 Bile salt tolerance of the tested strains

2.2.3 疏水率和自動(dòng)聚集率測定 研究表明，細(xì)菌的疏水性能力、自動(dòng)聚集能力和細(xì)菌的黏附性能存在一定的相關(guān)性，疏水性和自動(dòng)聚集能力越高，其粘附性越好。因此，通過疏水性實(shí)驗(yàn)和自動(dòng)聚集實(shí)驗(yàn)，來測定菌株對(duì)HT-29 細(xì)胞的粘附性，以評(píng)價(jià)菌株在腸上皮的粘附能力。結(jié)果如圖4、圖5 所示：

圖4 供試菌株的疏水率Fig.4 Hydrophobicity of the tested strains

圖5 供試菌株的自動(dòng)聚集率Fig.5 Automatic aggregation rate of the tested strains

從圖4 可以看出，細(xì)菌表面疏水性實(shí)驗(yàn)中，不同菌株的疏水性能力出現(xiàn)出明顯的差異，SW-02、SW-01、LGG、SW-04 和TX-02 的疏水率相對(duì)較高，分別為22.94%±1.80%、22.36%±1.68%、16.52%±2.10%、12.90%±2.53%和12.76%±1.75%，而SW-03、SWX 和TX-01 的疏水性能力相對(duì)較差，分別為10.87%±2.07%、6.46%±1.80%和8.74%±1.69%。杜蘭蘭等的研究表明，LGG 對(duì)二甲苯的疏水率為9.85%±1.25%。李珊珊等的研究表明，鼠李糖乳桿菌ATCC7469對(duì)二甲苯的疏水率為15%左右，對(duì)照本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SW-02 和SW-01 的疏水性能力與上述菌相比更有優(yōu)勢。

從圖5 可以看出，自動(dòng)聚集能力實(shí)驗(yàn)中，各菌株之間的自動(dòng)聚集率表現(xiàn)出明顯的差異。在2.5 h 時(shí)，SW-01 自動(dòng)聚集率最高，為14.46%±1.20%，SW-02 和SW-03 次之，自動(dòng)聚集率分別達(dá)到了11.55%±0.89%和10.57%±1.04%。龔虹等認(rèn)為自動(dòng)聚集能力高的細(xì)菌，其表面疏水性也高。本研究中對(duì)比表面疏水性能力和自動(dòng)聚集能力結(jié)果發(fā)現(xiàn)SW-01 和SW-02的表面疏水性與自動(dòng)聚集能力均較高。

2.2.4 供試菌株對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 黏附能力的測定 為了進(jìn)一步驗(yàn)證菌株對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附能力，利用HT-29 細(xì)胞測定了各菌株對(duì)細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果如圖6 所示：

圖6 供試菌株對(duì)HT-29 細(xì)胞的黏附率Fig.6 Adhesion rates of the tested strains to HT-29 cells

從圖6 可以看出，與對(duì)照菌株LGG 相比，菌株SW-02、SW-01 和SW-03 均表現(xiàn)出較高的黏附能力，黏附率分別為17.42%±1.22%、14.01%±1.82%和12.52%±1.43%。菌株TX-01 和TX-02 的黏附能力最差，黏附率均顯著低于對(duì)照菌株LGG（＜0.05）。與本文的研究結(jié)果相似，唐雅茹等測得植物乳桿菌KLDS1.0386 對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附率為16.65%。在本研究中，通過對(duì)菌株生長曲線、耐酸耐膽鹽實(shí)驗(yàn)、疏水性實(shí)驗(yàn)和自動(dòng)聚集能力實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)的測定，綜合判斷發(fā)現(xiàn)從健康嬰兒中分離獲得的菌株SW-02 的耐受性較好，因此后續(xù)對(duì)鼠李糖乳桿菌SW-02 的促腸道類器官生長作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.3 鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)腸道類器官的影響

2.3.1 鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)腸道類器官生長的影響 從小鼠小腸中分離隱窩，并進(jìn)行長期傳代培養(yǎng)形成腸道類器官，結(jié)果如圖7 所示。

分離的腸道隱窩數(shù)小時(shí)至1 d 內(nèi)閉合構(gòu)成球形結(jié)構(gòu)（圖7A），其中心可見內(nèi)腔，隨著腸道干細(xì)胞的自我更新、不斷增殖，2～3 d 左右形成出芽結(jié)構(gòu)并向外突出生長（圖7B），經(jīng)6～7 d 培養(yǎng)后類器官最后可形成多個(gè)出芽結(jié)構(gòu)，演化成為典型的腸道類器官（圖7C）。后續(xù)視類器官的生長情況5～7 d 可傳代1 次，凍存、復(fù)蘇后均有活力。

圖7 腸道類器官的形態(tài)學(xué)變化Fig.7 Morphological changes of intestinal organoids

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)腸道類器官生長的影響，以LGG 作為對(duì)照菌株，將SW-02 與腸道類器官進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果如圖8 所示。

從圖8 可以看出，與對(duì)照組相比，與鼠李糖乳桿菌SW-02 共培養(yǎng)的類器官體積明顯增大，同時(shí)SW-02 顯著提高了類器官的出芽率和出芽個(gè)數(shù)（＜0.05）。這說明SW-02 能促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)了腸道類器官的生長。類器官具有某些與來源器官相似的結(jié)構(gòu)特征和功能特性，而且能夠在體外3D 培養(yǎng)體系中穩(wěn)定擴(kuò)增，因此在生物學(xué)基礎(chǔ)研究、構(gòu)建疾病模型、腫瘤研究、組織再生修復(fù)、基因治療以及藥物篩選等方面顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。Lukovac等利用腸道類器官模型，研究了益生菌的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFA）及嗜黏蛋白阿克曼菌（）和普氏糞桿菌（）的代謝產(chǎn)物對(duì)腸道類器官中基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。與本文的研究結(jié)果相似，羅伊氏乳桿菌D8 可以促進(jìn)小鼠腸道類器官生長增殖。Sittipo 等證實(shí)熱滅活的嗜酸乳桿菌可以使輻射所致?lián)p傷的腸道類器官恢復(fù)生長，提高出芽率。

圖8 鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)腸道類器官生長的影響Fig.8 Effect of L. rhamnosus SW-02 on the growth of intestinal organoids

2.3.2 EdU 染色檢測鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)腸道類器官中細(xì)胞增殖的影響 利用EdU 染色評(píng)價(jià)了鼠李糖乳桿菌SW-02 腸道類器官中細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖9 所示。

從圖9 可以看出，鼠李糖乳桿菌SW-02 能促進(jìn)類器官中細(xì)胞的增殖，EdU 陽性細(xì)胞的百分比為85.2%±2.7%，顯著高于對(duì)照組的45%±0.9%（＜0.05）。與LGG 共培養(yǎng)的類器官中EdU 陽性細(xì)胞的百分比為69.9%±5.5%。這說明SW-02 的刺激，能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖。相似地，Wu 等和Hou 等兩個(gè)研究工作均證實(shí)羅伊氏乳桿菌D8 可以上調(diào)腸道類器官中EdU 陽性細(xì)胞數(shù)。

圖9 EdU 染色檢測鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)腸道類器官增殖的影響Fig.9 Effect of L. rhamnosus SW-02 on the proliferation of intestinal organoids by EdU staining

2.3.3 鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)腸道類器官中相關(guān)基因mRNA 水平的影響是腸道干細(xì)胞的標(biāo)記物，陽性細(xì)胞能夠分化為所有類型的腸道上皮細(xì)胞，是一種增殖細(xì)胞的相關(guān)抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)。緊密連接蛋白Zo-1 對(duì)于上調(diào)上皮增殖和促進(jìn)有絲分裂的完成具有至關(guān)重要的作用。因此本研究利用Real-time PCR 檢測了腸道干細(xì)胞標(biāo)志物、細(xì)胞增殖相關(guān)基因和緊密連接蛋白的mRNA 水平，結(jié)果如圖10 所示。

從圖10 可以看出，SW-02 的刺激顯著促進(jìn)了的表達(dá)（＜0.05）；同時(shí)，的表達(dá)出現(xiàn)了明顯上調(diào)的趨勢，這與腸道類器官EdU 染色的結(jié)果一致；緊密連接蛋白的mRNA 水平也呈顯著上調(diào)的趨勢（＜0.05）。這些結(jié)果進(jìn)一步說明鼠李糖乳桿菌SW-02 可以促進(jìn)腸道類器官的生長，促進(jìn)腸道屏障的成熟。Sittipo 等證實(shí)熱滅活的嗜酸乳桿菌可以上調(diào)輻射所致?lián)p傷的腸道類器官的的mRNA水平。是腸道上皮細(xì)胞增殖能力和腸道發(fā)育程度的常用檢測指標(biāo)，已有多項(xiàng)關(guān)于益生菌及其蛋白對(duì)小腸類器官及乳鼠小腸組織中的影響的相關(guān)報(bào)道。與本研究結(jié)果相似，Wu 等證實(shí)羅伊氏乳桿菌D8 增加了小鼠小腸類器官中的mRNA 水平。

圖10 鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)腸道類器官中相關(guān)標(biāo)志基因mRNA 水平的影響Fig.10 Effect of L. rhamnosus SW-02 on the mRNA levels of the related marker genes in intestinal organoids

2.3.4 鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)腸道類器官中黏蛋白MUC2 表達(dá)的影響 為了研究鼠李糖乳桿菌SW-02對(duì)腸道粘膜屏障的影響，利用ELISA 的方法檢測了鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)MUC2 表達(dá)的影響，結(jié)果如圖11 所示。

圖11 鼠李糖乳桿菌SW-02 對(duì)腸道類器官中黏蛋白MUC2 表達(dá)的影響Fig.11 Effect of L. rhamnosus SW-02 on the express of MUC2 in intestinal organoids

從圖11 可以看出，與對(duì)照組相比，SW-02 的處理明顯促進(jìn)了MUC2 的分泌。這些結(jié)果說明鼠李糖乳桿菌SW-02 有助于腸道粘膜屏障的完善。研究證實(shí)熱滅活的嗜酸乳桿菌可以上調(diào)輻射所致?lián)p傷的腸道類器官中的mRNA 水平。與這些研究相似，本研究中通過建立體外腸道類器官模型，發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌SW-02 在腸道類器官的出芽個(gè)數(shù)、出芽率、增殖情況等方面具有顯著促進(jìn)作用，同時(shí)可以上調(diào)、、的mRNA 相對(duì)表達(dá)量和粘蛋白MUC2 分泌。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究以從一月齡健康嬰兒糞便中分離的5 株鼠李糖乳桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，以LGG 為對(duì)照菌株，通過耐酸、耐膽鹽、疏水性、自動(dòng)聚集和細(xì)胞粘附性實(shí)驗(yàn)，篩選出具有良好抗性的鼠李糖乳桿菌SW-02。進(jìn)一步通過構(gòu)建腸道類器官模型，發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌SW-02 能夠促進(jìn)腸道類器官的生長增殖、促進(jìn)腸道緊密連接蛋白和粘蛋白MUC2 的表達(dá)，有利于腸道屏障的完善。以上研究結(jié)果表明鼠李糖乳桿菌SW-02 具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，有望成為商業(yè)開發(fā)的備選菌株。