盧慧芳，上官玲玲，夏會麗，宋慶怡，李 沛，李 庫，陳 雄，代 俊,

（1.發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)微生物重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443000）

在食品中添加鮮味料可增強食品的風味特征，如持續(xù)性、溫和感、濃厚感等。近年來，隨著市場巨大消費潛力的釋放，傳統(tǒng)的鮮味產(chǎn)品已不能滿足消費者對健康和新口味的追求，美味、安全、健康、天然的新型發(fā)酵調(diào)味產(chǎn)品逐漸在國內(nèi)外成為一種趨勢，特別是營養(yǎng)型鮮味調(diào)味產(chǎn)品數(shù)量逐年增長。目前，我國批準許可使用的鮮味調(diào)味料有L-谷氨酸鈉（MSG）、5′-鳥苷酸二鈉（GMP）、5′-肌苷酸二鈉（IMP）、5′-呈味核苷酸二鈉、琥珀酸二鈉、L-丙氨酸、甘氨酸，以及植物水解蛋白（HVP）、動物水解蛋白（HAP）、酵母抽提物（Yeast extracts）等。這幾類鮮味調(diào)味料中最主要的，應用最廣的是L-谷氨酸鈉，俗稱味精。

谷氨酸的制備方法有多種，主要為蛋白質(zhì)水解法、合成法和發(fā)酵法。發(fā)酵法是國內(nèi)外普遍采用的方法，發(fā)酵菌株主要為谷氨酸棒狀桿菌（）。我國谷氨酸發(fā)酵水平長期居于世界領(lǐng)先水平。谷氨酸發(fā)酵基本工藝為淀粉水解制成糖后，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)，然后通過等電等方法分離純化，再精制成為谷氨酸鈉結(jié)晶。因傳統(tǒng)發(fā)酵工藝存在原料來源不清潔、發(fā)酵產(chǎn)物雜質(zhì)多、產(chǎn)物需要純化等問題，不適合用于天然調(diào)味品的生產(chǎn)。

以天然植物來源玉米粉進行發(fā)酵可實現(xiàn)鮮味料的天然化。玉米粉是指由玉米去麩研磨之后所形成的粉末狀物質(zhì)，里面包含除玉米皮之外的所有成分，如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等，物產(chǎn)資源豐富，但僅作為糧食而言，經(jīng)濟價值較低，所以對玉米的深加工及多方面的應用尤為重要。然而，目前用玉米粉作為原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的研究較少，微生物直接利用玉米發(fā)酵的效率不高，如果將玉米粉中25%的碳水化合物經(jīng)淀粉酶酶解后，可作為優(yōu)質(zhì)碳源供微生物生長利用。此外，酵母抽提物是發(fā)酵工業(yè)中的主要原料之一，營養(yǎng)豐富，可以大大提高菌種的生產(chǎn)速率及發(fā)酵產(chǎn)品得率，常作為氮源使用。同時酵母抽提物也是一種優(yōu)良的天然調(diào)味料，其主要成分為多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B 族維生素及微量元素。這兩者共同發(fā)酵制備天然鮮味料，可大大提高發(fā)酵生產(chǎn)獲得鮮味調(diào)味品的可能性，豐富天然鮮味料的營養(yǎng)價值，使其風味更加細膩，口感更加自然、順暢，同時實現(xiàn)產(chǎn)品天然化。

為提高玉米粉的利用率，生產(chǎn)更加美味、安全、健康、天然的新型鮮味調(diào)味品。本文以玉米粉為原料利用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)天然鮮味料，首先通過單因素實驗和正交試驗優(yōu)化玉米粉酶解工藝，然后在搖瓶水平對谷氨酸棒桿菌GL-6 發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸的條件進行優(yōu)化，確定最佳氮源及含量和最佳玉米粉酶解液添加量，接著在20 L 發(fā)酵罐中進行驗證，并將發(fā)酵液離心后噴霧干燥制成天然鮮味產(chǎn)品，最后評價其指標。本研究以期得到綠色、健康、安全，且更具市場競爭力的新產(chǎn)品，為天然植物來源為底物發(fā)酵生產(chǎn)新型鮮味料提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷氨酸棒桿菌GL-6（GL-6） 由湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室保藏；玉米粉 河南省璞陽縣英倫玉米加工有限公司；淀粉酶AHA-400（酶活4000 U/mL） 安琪酵母股份有限公司；酵母抽提物FA31、FIG12LS、FM888、KA02、KU012 安琪酵母股份有限公司；食品級麥芽糊精（純度98%） 浙江一諾生物科技有限公司。

玉米粉具體成分如表1 所示。

表1 玉米粉營養(yǎng)成分Table 1 Nutritional composition of corn meal

20 L 發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40X 型生物傳感儀 濟南延和生物科技有限公司；V-1300 型可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；HH-2 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋 常州國華電器有限公司；FE28 型pH 計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Ultimate 3000 型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀賽默飛世爾科技（中國）有限公司；HP6890/5975C型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS） 美國安捷倫公司；自動微萃取裝置及萃取纖維 美國安捷倫公司；DBWAX 色譜柱 美國安捷倫公司；B-290 型微型噴霧干燥器 瑞士步琦公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米粉酶解工藝 稱取100 g 玉米粉，加入純水充分溶解，確保溶解完全后總體積為1 L，加入占玉米粉干基1%的淀粉酶AHA-400，于90 ℃水浴鍋中酶解2 h，酶解過程中每隔0.5 h 用玻璃棒攪拌1 min。

1.2.2 單因素實驗 本研究使用的玉米粉主要成分如表1 所示，為提高玉米粉的利用率，用淀粉酶AHA-400 進行酶解，選取固液比、酶添加量（以原料質(zhì)量為基準）、溫度和時間這四個主要影響酶解度（DE 值）大小的因素進行單因素實驗。在酶添加量1%，溫度90 ℃，酶解時間2 h 的條件下，研究固液比1:9、1:4、1:2.3、1:1.5 和1:1 對酶解度的影響；在溫度90 ℃，酶解時間2 h，固液比1:4 的條件下，研究酶添加量0.5%、1%、2%、3%和4%對酶解度的影響；在酶添加量1%，酶解時間2 h，固液比1:4 的條件下，研究酶解溫度75、80、85、90 和95 ℃對酶解度的影響；在酶添加量1%，溫度85 ℃，固液比1:4 的條件下，研究酶解時間1、2、3、4 和5 h 對酶解度和相對酶解率的影響。

1.2.3 正交試驗 以單因素實驗結(jié)果為依據(jù)，選擇四因素三水平作L（3）正交試驗，因素水平見表2，以DE 值為考察目標分析最佳酶解工藝方案。

表2 正交試驗因素水平設(shè)計Table 2 Factors and levels of the orthogonal tests

1.2.4 菌種活化方法 將實驗室斜面保藏的GL-6 接種1 環(huán)到裝有5 mL 的液體培養(yǎng)基的西林瓶中活化，在32 ℃，200 r/min 恒溫培養(yǎng)振蕩器培養(yǎng)24 h 得到一級種子液。再將一級種子液按2%的接種量接種至裝有50 mL 液體培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中培養(yǎng)，在30 ℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)24 h 得到二級種子液。將二級種子液按2%的接種量接種到后續(xù)實驗所用的培養(yǎng)基中，置于32 ℃，200 r/min 恒溫培養(yǎng)振蕩器進行搖瓶培養(yǎng)。

1.2.5 玉米粉酶解液培養(yǎng)基組分優(yōu)化及添加量的確定 根據(jù)預實驗確定培養(yǎng)基組分為：葡萄糖22 g/L，蛋白胨10 g/L，琥珀酸1 g/L，尿素10 g/L，七水硫酸鎂0.4 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，磷酸氫二鉀2.4 g/L，生物素0.3 mg/L，一水硫酸錳10 mg/L，維生素B1 0.2 mg/L。用HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0，滅菌條件為121 ℃，20 min。在此基礎(chǔ)上對氮源及其含量進行優(yōu)化，采用不同型號的酵母抽提物FA31、FIG12LS、FM888、KA02、KU012 替換培養(yǎng)基中的蛋白胨（peptone），在其他實驗條件不變的情況下進行培養(yǎng)，比較GL-6 的生長情況及生產(chǎn)谷氨酸的能力，確定最佳氮源，并對其含量進行優(yōu)化。

最佳酶解液添加量的確定：玉米粉酶解液用水稀釋至不同濃度，在培養(yǎng)基優(yōu)化后的基礎(chǔ)上，在搖瓶水平添加不同含量玉米粉酶解液（0%、25%、50%、75%、100%）進行發(fā)酵，比較GL-6 生產(chǎn)谷氨酸的能力。

1.2.6 玉米粉酶解液培養(yǎng)條件 搖瓶培養(yǎng)條件：在250 mL 搖瓶中裝入50 mL 液體培養(yǎng)基，接入2%的二級種子液，培養(yǎng)溫度32 ℃，200 r/min，培養(yǎng)48 h。

20 L 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：裝液量60%，接入8%的二級種子液，通氣量1.2 L/min，罐壓0.03 MPa，消泡劑10 mL，初始pH 為7.5，溫度32 ℃，發(fā)酵周期為52 h。調(diào)控策略為0～44 h 溫度32 ℃，44～52 h 溫度36 ℃；溶氧20%，溶氧與轉(zhuǎn)速偶聯(lián)（轉(zhuǎn)速范圍為100～500 r/min）。發(fā)酵9 h 開始持續(xù)補葡萄糖（50%），流速100 mL/h，流加濃氨水控制pH 為7.5。發(fā)酵完成后葡萄糖糖含量低于3 g/L，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液離心取上清于4 ℃冷藏備用。

1.3 分析方法

1.3.1 酶解度及相對酶解率的測定 還原糖含量用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定。葡萄糖標準曲線的繪制：準確配制濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L 的葡萄糖標準溶液，以葡萄糖濃度為橫坐標，以可見分光光度計吸收波長為540 nm 測定的不同葡萄糖濃度的值（OD）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。標準方程為Y=1.808X+0.088，其中=0.9997。還原糖計算公式如下：

DNS 法測定酶解度即DE（dextrose equivalent）值，計算公式如下：

相對酶解率：以1 h 酶解度為酶解率單位1，計算單位時間內(nèi)增加的酶解度為相對酶解率，計算公式如下：

1.3.2 生物量的測定 取1 mL 的發(fā)酵液，在離心機中12000 r/min，離心5 min，去掉上清，加入1 mL 去離子水重懸菌種細胞，相同條件離心水洗三次，最后用1 mL 去離子水重懸細胞，適當稀釋后以去離子水為對照在可見光分光光度計600 nm 處進行比色測定。讀取OD讀數(shù)乘以稀釋倍數(shù)得到的值作為最終OD值。

1.3.3 谷氨酸含量的測定 使用SBA-40X 型三通道生物傳感儀測定谷氨酸含量。配制100 g/dL 的谷氨酸標準溶液作為標品定標，進樣體積為25 μL，定標通過后，根據(jù)儀器檢測范圍適當稀釋待測樣品，然后測定讀數(shù)。

1.3.4 鮮味料的制備 將發(fā)酵液離心取上清，在上清液中加5%的麥芽糊精用B-290 型微型噴霧干燥器進行噴霧干燥。噴霧干燥的條件為：進口溫度120 ℃，出口溫度60 ℃，風機工作效率100%，蠕動泵工作效率18%。最終得到粉末狀的樣品即為鮮味料，本文天然鮮味料樣品為MJ（酶解組），鮮味料樣品為CK（對照組，不加酶解液）。噴霧干燥會使發(fā)酵液發(fā)生濃縮，得到的鮮味料樣品谷氨酸含量約為發(fā)酵液谷氨酸含量的4 倍左右，且用生物傳感儀和氨基酸分析儀對谷氨酸含量的檢測結(jié)果是一致的。

1.3.5 滋味評定 由12 名實驗室感官評價員（6 男6 女），主要從鮮味、咸味、甜味、酸味和苦味5 個項目進行打分，打分分值范圍為0～10 分，0～4 分滋味評定一般，5～8 分滋味評定中等，9～10 滋味評定強烈，隨后取平均值為滋味評價結(jié)果。

1.3.6 總氮的測定 采用凱氏定氮法測定總氮的含量。

1.3.7 總砷和總鉛的測定 總砷的含量參考食品安全國家標準《GB 5009.11-2014》進行測定，總鉛的含量參考食品安全國家標準《GB 5009.12-2017》進行測定。

1.3.8 17 種游離氨基酸的測定 使用氨基酸分析儀測定17 種游離氨基酸的含量。樣品制備方式為：稱取樣品0.5～1 g（精確到 0.001 g）置于50 mL 容量瓶中。加入20 mL 磺基水楊酸超聲至充分溶解后，定容至50 mL 刻度，充分混勻，靜置1 h 后準確吸取上清液1 mL 于25 mL 容量瓶中，加入檸檬酸鈉緩沖液定容至刻度，混勻后經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾至進樣瓶，待檢。溶劑標準為：氫氧化鈉溶液：500 g/L；磺基水楊酸溶液：50 g/L；檸檬酸鈉緩沖液：pH=2.2。稱取19.6 g 二水合檸檬酸鈉，溶解后轉(zhuǎn)入1000 mL 容量瓶中，加入16.5 mL 濃鹽酸，加水至刻度，混勻。必要時，可用HCL 或NaOH 調(diào)節(jié)pH 至2.2。

1.3.9 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定 使用氣相-質(zhì)普聯(lián)用儀GC-MS 測定。樣品處理方式為：稱取1 g（精確到0.001 g）樣品，1.5 g 氯化鈉和10 μL 濃度為1.98 g/L的4-甲基2-戊醇（色譜純）溶于5 mL 去離子水中，經(jīng)過0.22 μm 濾膜過濾后取2 mL 放入頂空萃取瓶中并放置于頂空進樣器上，樣品吹掃時間：30 min，樣品預熱時間：5 min，樣品解吸附溫度：180 ℃，樣品吹掃溫度：70 ℃。GC 條件為：色譜柱為安捷倫DBWAX 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫為40 ℃（保持2 min），以2 ℃·min升溫至250 ℃，保持5 min，總運行時間為112 min，汽化室溫度為250 ℃，載氣為高純度He（99.999%），溶劑延遲時間為2 min。MS 條件為：離子源為EI 源，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，電子源能量為70 eV，激活電壓為1.6 V。用Qualitative Navigator B.08.00 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)是三組平行實驗的均值，用Origin Pro2016 軟件作圖，采用Excel 2010 進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米粉酶解工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實驗 由圖1a 所示，隨著固液比的增加，酶解度（DE 值）表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在固液比1:4 時達到最大值，之后呈緩慢下降的趨勢。這是因為在酶添加量一定時，隨著固液比的增加，淀粉酶與玉米粉在反應過程中達到飽和平衡點并出現(xiàn)最大值。固液比1:4 時，DE 值達到54.64%，因此，1:4 是最佳固液比。

圖1 固液比（A）、酶添加量（B）、溫度（C）和時間（D）對玉米粉酶解度的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio （A）, enzyme dosage （B）,temperature （C） and time （D） on enzymatic hydrolysis of corn meal

由圖1b 所示，隨著淀粉酶添加量的增加，DE 值表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在酶添加量1%時達到最大值，之后呈緩慢下降的趨勢。這是因為當?shù)孜锍渥銜r，隨著酶添加量的增加，反應速率也隨之增大，并隨著結(jié)合程度逐漸增大，酶與玉米粉在反應過程中達到飽和平衡點并出現(xiàn)最大值。酶添加量1%時，DE值達到55.16%，酶解效果最好。因此，1%是最佳酶添加量。

由圖1c 所示，隨著酶解溫度的升高，DE 值表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當酶解溫度為85 ℃時，DE 值最大，酶反應速率最大。這是由于酶促反應都有最適的溫度范圍，酶解溫度過高和過低都會使酶的活力和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導致玉米粉酶解不夠充分。當酶解溫度為85 ℃時，DE 值達到58.05%，酶解效果最好。因此，85 ℃是最佳酶解溫度。

由圖1d 所示，隨著時間的延長，DE 值表現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢。這是因為隨著酶解時間的增加，淀粉酶與玉米粉之間充分接觸，使反應速度增加，當酶解時間為5 h 時，DE 值達到58.92%。但3 h 后DE 值上升緩慢，考慮到不能一味的追求酶解度最高，而忽略時間成本。因此計算了相對酶解率進行篩選，比較單位時間內(nèi)酶解度增加的速率，選擇相對酶解率高的為最佳，酶解3 h 相對酶解率達到3.01，酶解度為57.41%。因此，3 h 是最佳酶解時間。

2.1.2 正交試驗 以上單因素實驗確定了各因素的最佳酶解條件，但各因素之間可能存在交互作用。為進一步研究各因素對玉米粉酶解的影響，采用L（3）4 因素3 水平正交設(shè)計對酶解參數(shù)進行優(yōu)化。正交試驗設(shè)計和結(jié)果如表3 所示。

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

R 值越大，該因素對試驗結(jié)果的影響越大。由表3 所示，各因素影響玉米粉酶解效果的順序為：固液比（A）＞溫度（C）＞時間（D）＞酶添加量（B）。固液比是主要影響因素，其次是溫度和時間，酶添加量對酶解度影響最小?；谝陨戏治龃_定最佳酶解工藝條件為ABCD，即固液比1:4，酶添加量1%，溫度90 ℃，時間3 h。在此最佳條件下，酶解度達到60.84%。

2.2 C. glutamicum GL-6 發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸的條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基氮源優(yōu)化 采用不同型號的酵母抽提物FA31、FIG12LS、FM888、KA02、KU012 替換培養(yǎng)基中的蛋白胨（peptone）培養(yǎng)48 h，GL-6 的生長情況及生產(chǎn)谷氨酸的能力如圖2a、b 所示，用酵母抽提物KA02 培養(yǎng)12 h 后OD值達到16.49，用蛋白胨培養(yǎng)12 h 后OD值維持在10 左右。酵母抽提物整體比蛋白胨培養(yǎng)效果要好，但數(shù)據(jù)有些波動，且每個數(shù)據(jù)點相差較小，難以區(qū)分哪種型號的酵母抽提物培養(yǎng)最佳。用酵母抽提物FIG12LS 培養(yǎng)的谷氨酸含量相對較多，然而用蛋白胨培養(yǎng)的谷氨酸含量較低。用酵母抽提物FIG12LS培養(yǎng)24 h 后，GL-6 的OD值維持在13.00 和16.00 之間，谷氨酸含量最高為15.4 g/L，是蛋白胨培養(yǎng)的谷氨酸含量最高時的1.26 倍。酵母抽提物FIG12LS 雖然不是每個數(shù)據(jù)監(jiān)測點含量都是最高的，但整體呈逐漸上升趨勢，處于高點的數(shù)據(jù)監(jiān)測點較多。因此，選用酵母抽提物FIG12LS 培養(yǎng)效果最佳。

圖2 不同氮源培養(yǎng)對C. glutamicum GL-6 生物量（a）和谷氨酸含量（b）的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on C. glutamicum GL-6 biomass （a） and glutamate content （b）

2.2.2 培養(yǎng)基氮源含量優(yōu)化 確定酵母抽提物型號后，對其含量進行優(yōu)化。如圖3a、b 所示，當酵母抽提物FIG12LS 含量為30 g/L 時，GL-6生長相對較好，培養(yǎng)16 h 生物量最高，OD值為19.15，且谷氨酸含量相對較高，培養(yǎng)24 h 谷氨酸含量最高為17.9 g/L。綜上，酵母抽提物FIG12LS 30 g/L作為培養(yǎng)基氮源最佳。

圖3 氮源不同含量培養(yǎng)對C. glutamicum GL-6 生物量（a）和谷氨酸含量（b）的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources content on C.glutamicum GL-6 biomass （a） and glutamate content （b）

2.2.3 玉米粉酶解液添加量的確定 玉米粉酶解后成分復雜，在培養(yǎng)基中添加不僅會使培養(yǎng)基初糖含量發(fā)生變化，還可能含有某些抑制因子影響菌種生長。如圖4 所示，添加25%、50%、75%、100%玉米粉酶解液谷氨酸含量在前24 h 均比0%的玉米粉酶解液添加量低，添加酶解液GL-6 生長緩慢，谷氨酸積累受到抑制，而添加50%和75%的玉米粉酶解液發(fā)酵24 h 后谷氨酸含量比0%的玉米粉酶解液添加量高。當酶解液含量在100%時，谷氨酸含量增加較少（3.0 g/L）。綜上，添加50%的玉米粉酶解液即玉米粉含量100 g/L 效果最佳，發(fā)酵42 h谷氨酸含量達到15.9 g/L。

圖4 玉米粉酶解液添加量對C. glutamicum GL-6 發(fā)酵形成谷氨酸的差異性比較Fig.4 Comparison of different addition amount of corn meal hydrolysate on glutamate formation by C. glutamicum GL-6 fermentation

2.2.4 20 L 發(fā)酵罐水平擴大培養(yǎng) 為滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要，在20 L 發(fā)酵罐水平擴大培養(yǎng)，以添加0%的玉米粉酶解液發(fā)酵作為對照組（圖5a），以加入50%玉米粉酶解液發(fā)酵為酶解組（圖5b），分別發(fā)酵52 h 比較谷氨酸含量。有研究表明，谷氨酸棒桿菌的最適生長溫度與產(chǎn)物生成所需溫度不同，其最適生長溫度為30～32 ℃，谷氨酸形成的最適溫度為34～37 ℃。發(fā)酵結(jié)果如圖5a 所示，對照組發(fā)酵44 hGL-6 OD值達到79.87，在44 h 時升溫至36 ℃，生物量下降，谷氨酸含量升高，發(fā)酵52 h谷氨酸含量達到84.0 g/L。如圖5b 所示，酶解組發(fā)酵44 hGL-6 OD值達到75.01，在44 h 時升溫至36 ℃，生物量下降，谷氨酸含量升高，發(fā)酵52 h 谷氨酸含量達到98.0 g/L。酶解組和對照組OD值基本一致，酶解組比對照組谷氨酸含量提高16.7%，酶解組由于加入了玉米酶解液發(fā)酵，初糖含量較高，較對照組高77.3%。綜上，玉米粉酶解液不僅可以用來發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，而且可以促進谷氨酸的積累。

圖5 對照組（a）和酶解組（b）的發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Fermentation results of control group （a） and enzymolysis group （b）

2.3 天然鮮味料檢測分析

2.3.1 外觀及滋味評定 將上述兩罐發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液離心后在上清液中分別添加5%的麥芽糊精進行噴霧干燥，得到鮮味料樣品CK（對照組）和天然鮮味料樣品MJ（酶解組）。產(chǎn)品圖片如圖6 所示，樣品CK 和樣品MJ 均為微黃色粉末，但樣品MJ 相較于樣品CK 黃色偏深。

圖6 兩種樣品Fig.6 Two kinds of samples

對圖6 所示的兩種樣品進行滋味評定，結(jié)果如圖7 所示。兩種樣品主要為咸鮮味，且樣品MJ 比樣品CK 更鮮。兩種樣品均有甜味，且樣品MJ 較樣品CK 甜。樣品MJ 基本無酸味，樣品CK 略微有些酸味。兩種樣品基本都無苦味。綜上，樣品MJ 不僅比樣品CK 鮮味更強，感官整體評價還更優(yōu)。

圖7 兩種樣品滋味評價Fig.7 Taste evaluation of two samples

2.3.2 基礎(chǔ)指標 根據(jù)調(diào)味料的質(zhì)量檢測標準，檢測了樣品的幾個主要指標，如表4 所示，樣品CK 還原糖含量為4.3 g/100 g，總氮含量為59.2 g/100 g，樣品MJ 還原糖含量為14.0 g/100 g，總氮含量為72.5 g/100 g。樣品MJ 還原糖和總氮含量分別比樣品CK高225.6%和22.5%，而且圖7 所示的滋味評定中甜味感官與兩種樣品檢測到的還原糖含量基本一致。樣品總砷總鉛均未超標，符合食品添加劑安全標準。

表4 各樣品指標檢測結(jié)果Table 4 Test results of each sample

2.3.3 17 種游離氨基酸 氨基酸種類較多，具有功能和營養(yǎng)性，除了谷氨酸有較強的鮮味外，甘氨酸具有甜味，能調(diào)和酸味和咸味，丙氨酸具有特殊鮮味和甜味，可提高食品的營養(yǎng)價值，改善食品的風味。因此，兩種樣品進行氨基酸成分測定，結(jié)果如圖8 所示，樣品CK 的氨基酸總量為36.3 g/100 g，其中谷氨酸含量為35.4 g/100 g，樣品MJ 的氨基酸總量為44.8 g/100 g，其中谷氨酸含量為43.9 g/100 g，是樣品CK 的1.2 倍。圖7 所示的滋味評定中鮮味感官與氨基酸含量檢測結(jié)果基本一致。各樣品中氨基酸的主要成分為谷氨酸，其他氨基酸含量很少，其中樣品MJ 的谷氨酸和丙氨酸含量最高，其他氨基酸含量也相對較高，可能是加入玉米酶解液共同發(fā)酵產(chǎn)生的。

圖8 樣品氨基酸含量Fig.8 Amino acid content in the samples

2.3.4 揮發(fā)性風味物質(zhì) 揮發(fā)性風味是產(chǎn)品可接受性重要因素之一，良好的風味可帶來愉悅的感覺，對產(chǎn)品進行風味分析尤為重要。如表5 所示，樣品中共檢測到23 種主要揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中吡嗪類物質(zhì)8 種，酸類物質(zhì)5 種，酮類物質(zhì)5 種。吡嗪類物質(zhì)種類多且含量高，樣品CK 2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪含量分別達到1.301 μg/g 和1.429 μg/g，樣品MJ 2,3,5-三甲基吡嗪和川芎嗪含量分別達到7.118 μg/g 和6.113 μg/g。此外，樣品CK 酸味較重，醋酸和辛酸含量分別達到1.855 μg/g 和3.994 μg/g，樣品MJ 也有些許酸味，己酸含量達到1.152 μg/g。吡嗪類物質(zhì)是鮮味的主要來源，它不僅能夠提供鮮味，還有堅果和咖啡的風味，此外，一些吡嗪類物質(zhì)，如川芎嗪還具有一定的藥用價值。醋酸和辛酸具有刺激性和酸敗感，己酸則具有脂肪果味。圖7所示的滋味評定與表5 所示的揮發(fā)性風味物質(zhì)檢測結(jié)果基本一致。綜上，樣品MJ 作為天然鮮味調(diào)味品風味良好，可廣泛應用于食品領(lǐng)域。

表5 兩種樣品揮發(fā)性風味檢測結(jié)果Table 5 Volatile flavor test results of two samples

3 結(jié)論

該研究以玉米粉為主要原料，利用谷氨酸棒桿菌GL-6（GL-6）發(fā)酵生產(chǎn)新型天然鮮味料。首先通過單因素實驗和正交試驗得到玉米粉最佳酶解工藝為固液比1:4，酶添加量1%，溫度90 ℃，時間3 h，在此最佳條件下DE 值達到60.84%；同時在搖瓶水平確定了GL-6 發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸的最佳氮源為酵母抽提物FIG12LS 30 g/L，玉米粉酶解液最佳添加量為50%（v/v），接著在20 L 發(fā)酵罐水平進行發(fā)酵驗證，并將發(fā)酵液離心取上清加入5%的麥芽糊精噴霧干燥成粉末，該粉末即為本文研究所得的天然鮮味料；最后對樣品進行成分檢測和評定。結(jié)果表明該產(chǎn)品MJ 谷氨酸含量為43.9 g/100 g，氨基酸總含量為44.8 g/100 g，相較于樣品CK 含量分別提高了24.0%和23.4%。此外，產(chǎn)品富含堅果及咖啡風味的吡嗪類物質(zhì)，相較于對照組鮮味物質(zhì)含量和營養(yǎng)價值均有提高，風味也更加豐富。綜上所述，玉米粉發(fā)酵生產(chǎn)的天然鮮味料，不僅風味良好，營養(yǎng)素更豐富，還實現(xiàn)了大宗農(nóng)產(chǎn)品的深加工，為生產(chǎn)企業(yè)利用天然食品原料發(fā)酵生產(chǎn)新型鮮味料開辟了一條新的途徑，具有廣闊的市場前景。