楊益歡，禹利君,2,3, ，賀軍輝，周宇飛，徐 帥，劉仲華,2,3,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙 410128；4.湖南華萊生物科技有限公司，湖南益陽(yáng) 413513）

莓茶，又名藤茶，為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄（）的嫩莖葉加工制成的代用茶。據(jù)《中藥學(xué)》記載，莓茶具有清熱解毒、活血化瘀等功效，民間常用來(lái)治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、口腔潰瘍等疾病。研究發(fā)現(xiàn)，莓茶富含以二氫楊梅素和楊梅素為主的黃酮類(lèi)化合物，具有抗菌、消炎、抗血脂、保肝護(hù)肝等多種藥理功效。近年來(lái)，莓茶因優(yōu)越的保健功效受到許多消費(fèi)者的喜愛(ài)，一級(jí)莓茶成為代用茶已日漸流行，但入口苦澀，香氣呈現(xiàn)不愉快的“青氣”，使其品質(zhì)受到影響；成熟度較高的二級(jí)莓茶常用作提取二氫楊梅素的主要原料，還未見(jiàn)進(jìn)行茶飲開(kāi)發(fā)。能否借鑒黑茶茯磚“發(fā)花”的原理對(duì)不同等級(jí)的莓茶進(jìn)行“發(fā)花”處理，使其風(fēng)味口感得到提升改造還未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

“發(fā)花”是茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)風(fēng)味形成的關(guān)鍵工藝，通過(guò)控制一定的環(huán)境條件，促使優(yōu)勢(shì)菌—冠突散囊菌生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生俗稱(chēng)為“金花”的金黃色閉囊殼?！敖鸹ā蹦苡行Ц纳朴捎谠洗掷纤鶐?lái)的粗澀味。已有多項(xiàng)研究表明，利用冠突散囊菌“發(fā)花”可有效改善一些藥用植物資源的風(fēng)味口感。Zhang 等利用辣木和黑毛茶拼配“發(fā)花”有效改善了辣木葉辛辣刺鼻的氣味；鄭升海等通過(guò)冠突散囊菌發(fā)酵桑葉使其1-脫氧野尻霉素（DNJ）和水浸出率含量大幅增加等。為此，本研究采用兩種不同等級(jí)的莓茶為原料，通過(guò)手筑茯磚工藝對(duì)其進(jìn)行自然“發(fā)花”，并比較一級(jí)莓茶、二級(jí)莓茶及其發(fā)花前后感官品質(zhì)、主要風(fēng)味成分的變化，探討“發(fā)花”對(duì)莓茶品質(zhì)風(fēng)味的影響，進(jìn)一步豐富莓茶品類(lèi)，為冠突散囊菌發(fā)酵莓茶、大生產(chǎn)“發(fā)花”提供理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一級(jí)莓茶、二級(jí)莓茶 永順縣大豐生態(tài)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司提供；磷酸、碳酸鈉、茚三酮、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸（分析純）、乙腈、甲醇（色譜純） 國(guó)藥集團(tuán)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY，純度＞98%）、楊梅素（myricetin，MY，純度＞98%） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

GCMS-QP2010 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、UV-1750 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津有限公司；手動(dòng)SPME 進(jìn)樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco 公司；LC1260 型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶樣制備 用于“發(fā)花”的莓茶原料參照永順莓茶加工方法T/HNTI 041-2021進(jìn)行，一級(jí)莓茶采用春夏季節(jié)幼嫩莖葉制成，二級(jí)莓茶采用秋冬季粗老莖葉制成。莓茶壓制發(fā)花于湖南華萊生物科技有限公司的手筑茯磚車(chē)間完成，參考GB/T 9833.3-2013茯磚茶加工工序進(jìn)行?；竟ば?yàn)椋涸蠌?fù)水，渥堆、汽蒸、壓制、發(fā)花、干燥，制成“發(fā)花莓茶”。

1.2.2 感官審評(píng) 稱(chēng)取2 g 莓茶樣品投入150 mL 的審評(píng)杯中，沸水沖泡3 min，按沖泡次序?qū)⒉铚珵V入審評(píng)碗內(nèi)，分別參考莓茶審評(píng)方法和茯磚茶審評(píng)方法對(duì)茶葉外形、香氣、湯色、滋味、葉底逐項(xiàng)審評(píng)，結(jié)果采用評(píng)語(yǔ)形式。審評(píng)小組由5 名專(zhuān)業(yè)茶葉審評(píng)人員組成（男女比例2:3）。

1.2.3 水浸出物、可溶性糖和游離氨基酸含量分析茶樣經(jīng)研磨機(jī)研磨，過(guò)40 目篩。水浸出物的測(cè)定：參照GB/T 8305-2013《茶水浸出物測(cè)定》。可溶性糖總量測(cè)定采用蒽酮-硫酸法。游離氨基酸含量測(cè)定參照GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》。

1.2.4 二氫楊梅素、楊梅素的HPLC 定量檢測(cè) 稱(chēng)取2.000 g 粉碎茶樣，加70%甲醇30 mL，超聲浸提10 min，4000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，重復(fù)浸提一次，合并浸提液并定容至100 mL，搖勻，過(guò)0.45 μm 濾膜后參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行HPLC檢測(cè)，并制作二氫楊梅素和楊梅素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，二氫楊梅素標(biāo)曲：Y=25681885X+49439，=0.997；楊梅素標(biāo)曲：Y=37488103X-7727，=0.998；根據(jù)永順莓茶T/HNTI 041-2021 進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 香氣成分檢測(cè) 萃取頭使用前在240 ℃老化50 min。取粉碎茶樣2.0 g 于20 mL 頂空瓶中，以聚四氟乙烯瓶蓋封口，于80 ℃恒溫水浴平衡20 min，吸附50 min 后，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，解析5 min。

GC 條件：HP-88 毛細(xì)管柱（0.20 μm×100.0 m×0.25 mm），柱溫箱溫度：60.0 ℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣溫度240 ℃，樣品流速1.37 mL/min，升溫程序60 ℃保留5 min，3 ℃/min 升溫至140 ℃保留5 min，5 ℃/min 升至210 ℃保留10 min，再以5 ℃/min升溫至240 ℃保留10 min，載氣為高純度He（≥99.999%）。MS 條件：溫度200 ℃，色譜接口溫度220 ℃，電子轟擊離子源，質(zhì)荷比范圍：45～500 m/z。

利用NIST 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)GC-MS 分析得到的色譜峰進(jìn)行人工解析，保留相似度80%以上的物質(zhì)，按面積歸一法計(jì)算所檢測(cè)到的各組分的相對(duì)含量（以各香氣組分的峰面積占總峰面積的百分比表示組分的相對(duì)含量）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2019、SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，LSD 多重比較在＜0.05 顯著，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，GraphPad Prism8.0 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 “發(fā)花”對(duì)不同等級(jí)莓茶感官品質(zhì)的影響

從表1 和圖1 可知，二級(jí)莓茶比一級(jí)莓茶的成熟度高、色澤深、條索粗壯、苦澀味低、青草氣弱。“發(fā)花”后一、二級(jí)莓茶與其原料比較，湯色加深，青草香轉(zhuǎn)變?yōu)榫ㄏ?，苦澀味降低，葉底更加柔軟。由于二級(jí)莓茶原料采摘成熟度較高，含梗量多，壓磚發(fā)花后比一級(jí)莓茶茯磚疏松，磚內(nèi)金花更加茂密，滋味更加醇和可口，花果香顯露。由感官審評(píng)結(jié)果可知，二級(jí)莓茶“發(fā)花”以后品質(zhì)提升幅度更大。

圖1 不同等級(jí)莓茶“發(fā)花”前后對(duì)比圖Fig.1 Comparison of different grades of vine tea before and after fungal fermentation

表1 不同等級(jí)莓茶“發(fā)花”前后感官審評(píng)結(jié)果Table 1 Sensory evaluation results of vine tea with different grades before and after fungal fermentation

2.2 “發(fā)花”對(duì)不同等級(jí)莓茶主要生化成分的影響

2.2.1 “發(fā)花”對(duì)不同等級(jí)莓茶水浸出物、可溶性糖和氨基酸含量的影響 如圖2 所示，一級(jí)莓茶的水浸出物、可溶性糖含量顯著高于二級(jí)莓茶，游離氨基酸含量顯著低于二級(jí)莓茶（＜0.05）。一、二級(jí)莓茶“發(fā)花”后與其原料比較，水浸出物含量變化差異不顯著（0.05），可溶性糖含量分別下降了5.85%、19.97%。游離氨基酸含量經(jīng)“發(fā)花”后，差異顯著（＜0.05），分別下降了48.54%、38.57%?！鞍l(fā)花”是以冠突散囊菌為主體的發(fā)酵過(guò)程，在此過(guò)程中冠突散囊菌會(huì)消耗茶葉的營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)滿(mǎn)足自身生長(zhǎng)需求。但由于原料嫩度、含水量和含梗量不同，導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)菌的數(shù)量及生長(zhǎng)情況不同，因而莓茶內(nèi)含成分降解、聚合等轉(zhuǎn)化幅度不同。劉武嫦等以不同品種黑毛茶為原料的“發(fā)花”實(shí)驗(yàn)中獲得了相同的結(jié)論。

圖2 不同等級(jí)莓茶“發(fā)花”前后品質(zhì)成分變化Fig.2 Changes of quality components of different grades of vine tea before and after fungal fermentation

2.2.2 “發(fā)花”對(duì)不同等級(jí)莓茶二氫楊梅素和楊梅素含量的影響 二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DMY）和楊梅素（Myricetin，MY）是莓茶中主要的黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、消炎等多種功效。由圖3 可知，一級(jí)莓茶和二級(jí)莓茶的DMY 含量分別為312.80、154.56 mg/g，MY 含量分別為1.56、1.94 mg/g。Yu 等研究表明，DMY 在莖葉嫩度高的莓茶中含量更高，與本研究結(jié)果一致。一級(jí)莓茶發(fā)花后DMY、MY 含量均顯著增加（＜0.05），二級(jí)莓茶“發(fā)花”后MY 含量顯著降低（＜0.05），DMY 含量無(wú)明顯變化。這與Wu 等利用食藥用菌茯苓發(fā)酵莓茶其DMY 和MY 含量無(wú)明顯變化的結(jié)果不同，推測(cè)與發(fā)酵菌群不同有關(guān)。

圖3 不同等級(jí)莓茶“發(fā)花”前后二氫楊梅素和楊梅素含量變化Fig.3 Changes of dihydromyricetin and myricetin contents in different grades of vine tea before and after fungal fermentation

2.3 發(fā)花對(duì)不同等級(jí)莓茶香氣成分的影響

由表2 可知，本研究共鑒定出80 種揮發(fā)性成分，其中醇類(lèi)15 種、酮類(lèi)18 種、醛類(lèi)12 種、酯類(lèi)9種、烷烴類(lèi)7 種、烯烴類(lèi)10 種、雜環(huán)化合物類(lèi)6 種、其它化合物3 種。各類(lèi)香氣成分變化如圖4 所示。

圖4 莓茶“發(fā)花”前后香氣成分中各類(lèi)化合物相對(duì)含量差異Fig.4 Relative content difference of various compounds in aroma components of vine tea before and after fungal fermentation

表2 不同等級(jí)莓茶“發(fā)花”前后香氣成分及相對(duì)含量Table 2 Aroma components and relative content of vine tea with different grades before and after fungal fermentation

續(xù)表 2

續(xù)表 2

一、二級(jí)莓茶分別檢出52、57 種香氣成分，其中法尼醇、植醇、（E,E）-2,4-庚二烯醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛、-法呢烯、佛術(shù)烯等11 種物質(zhì)未在一級(jí)莓茶中檢出。一、二級(jí)莓茶“發(fā)花”后分別檢出49、56 種香氣成分，具有相同變化趨勢(shì)的成分41 種。其中16 種在“發(fā)花”后相對(duì)含量升高，25 種在“發(fā)花”后相對(duì)含量降低（表3）。從這些香氣組分的變化可以看出，呈花香的苯乙醛、藏花醛、β-石竹烯和具有果香的法尼基丙酮以及似咖啡香的苯并噻唑等物質(zhì)在“發(fā)花”后均表現(xiàn)為含量增高，而具有青草香的反-2-己烯醛、（E）-2-庚烯醛、反式-2-癸烯醛等物質(zhì)在“發(fā)花”后含量均明顯降低。研究表明，水楊酸甲酯、法尼基丙酮、藏花醛等成分對(duì)“菌花香”具有重要貢獻(xiàn)。“發(fā)花”后一級(jí)莓茶與二級(jí)莓茶比較發(fā)現(xiàn)，一級(jí)莓茶未檢出2-環(huán)己烯-1-酮、新植二烯、2,3,5,8-四甲基-1,5,9-癸三烯、脫氫芳基紫羅烯、棕櫚酸乙酯，而具有花香特征的2-環(huán)己烯-1-酮僅在二級(jí)莓茶“發(fā)花”后檢出。

表3 莓茶“發(fā)花“后具有相同變化趨勢(shì)的揮發(fā)性成分Table 3 Volatile components of vine tea with the same change trend after fungal fermentation

研究表明，氨基酸在微生物作用下發(fā)生分解代謝產(chǎn)生大量香氣物質(zhì)，如支鏈氨基酸（Leu、lle、Val）被轉(zhuǎn)化為具有麥芽味、果香的香氣化合物，芳香族氨基酸（Phe、Tyr、Trp）的分解代謝產(chǎn)生具有花香、化學(xué)溶劑氣味的化合物，本研究中二級(jí)莓茶氨基酸含量高于一級(jí)莓茶，這可能是其“發(fā)花”后較“發(fā)花”一級(jí)莓茶香氣豐富原因。

3 結(jié)論

探究“發(fā)花”對(duì)不同等級(jí)莓茶的感官品質(zhì)、主要生化成分、揮發(fā)性香氣成分的差異。結(jié)果表明：通過(guò)感官審評(píng)發(fā)現(xiàn)“發(fā)花”使莓茶顏色加深、苦澀味減弱，青草氣消失，一級(jí)莓茶發(fā)花后呈菌花香帶清香，滋味醇厚有回甘；二級(jí)莓茶“發(fā)花”后香氣呈菌花香帶花果香，滋味醇和回甘。一、二級(jí)莓茶的水浸出物、可溶性糖、氨基酸、二氫楊梅素和楊梅素含量差異顯著，“發(fā)花”使可溶性糖、氨基酸含量均顯著降低（＜0.05）。共鑒定出80 種揮發(fā)性香氣成分，其中醇類(lèi)15 種、酮類(lèi)18 種、醛類(lèi)12 種、酯類(lèi)9 種、烷烴類(lèi)7 種、烯烴類(lèi)10 種、雜環(huán)化合物類(lèi)6 種、其它化合物3 種?！鞍l(fā)花”后二級(jí)莓茶酮類(lèi)、醛類(lèi)、烯烴類(lèi)、酯類(lèi)和雜環(huán)化合物香氣成分相對(duì)含量均高于一級(jí)莓茶?！鞍l(fā)花”一級(jí)莓茶香氣清新，可能與反式-2-壬醛、反-2-己烯醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛等成分含量較高有關(guān)?！鞍l(fā)花”二級(jí)莓茶具有花果香，可能是因?yàn)榫哂谢ㄏ?、果香的苯甲醇、苯乙醛、藏花醛?-環(huán)己烯-1-酮、二氫--紫羅蘭酮等成分含量較高。

綜上所述，發(fā)花能提升莓茶風(fēng)味品質(zhì)，尤其是二級(jí)莓茶。結(jié)合目前莓茶的制作大多使用嫩莖葉，而粗老莖葉仍處于廢棄狀態(tài)，因此發(fā)花二級(jí)莓茶更具有開(kāi)發(fā)前景，有助于提高莓茶的高值化利用以及豐富莓茶品類(lèi)。