胡玉潔，胡 喻，劉 鵬，將明玥，鄭 靖

(1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川 瀘州 644300；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 644300)

急性肝衰竭(acute Liver failure，ALF)是由各種原因引起的大量肝細(xì)胞迅速壞死、凋亡并伴有肝功能?chē)?yán)重障礙危及生命的臨床綜合征，病死率高[1]。目前肝移植是ALF唯一根治的方法，但受到肝源稀缺、費(fèi)用昂貴、術(shù)后排斥等諸多因素限制[2-3]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植成為治療急性肝衰竭的新興方式。研究表明[4-8]，BMSCs可以抑制炎癥反應(yīng)、減少肝細(xì)胞凋亡、改善線粒體呼吸功能、分化成為功能性肝細(xì)胞，同時(shí)還具備不違背社會(huì)倫理、制備簡(jiǎn)便、容易獲取等優(yōu)點(diǎn)，使其成為治療晚期肝病的研究熱點(diǎn)。

中醫(yī)尚無(wú)急性肝衰竭的準(zhǔn)確病名，依據(jù)中醫(yī)藏象學(xué)說(shuō)，肝臟可歸屬于中醫(yī)的脾藏[9]，由于本病以黃疸為突出的癥狀，病重勢(shì)急，變化迅速，故又稱(chēng)之為“瘟黃”、“疫黃”、“急黃”等，黃為脾之臟色，黃疸亦為脾之本病。本實(shí)驗(yàn)以健脾利濕、清熱解毒作為指導(dǎo)思想，選用四川省名老中醫(yī)孫同郊教授經(jīng)驗(yàn)方茵陳四苓顆粒(原方名為肝毒清顆粒)，為本院院內(nèi)制劑，由茵陳、澤瀉、豬苓、白頭翁、大黃等多味中藥組成。根據(jù)本課題團(tuán)隊(duì)前期研究表明[10-12]，茵陳四苓顆粒能抑制全身炎癥反應(yīng)、對(duì)抗內(nèi)毒素血癥、保護(hù)線粒體、促進(jìn)肝細(xì)胞再生。本實(shí)驗(yàn)就茵陳四苓顆粒聯(lián)合BMSCs移植治療急性肝衰竭大鼠，探討是否能通過(guò)影響大鼠肝臟能量代謝及線粒體呼吸功能方面減輕急性肝衰竭，進(jìn)一步研究中藥聯(lián)合干細(xì)胞移植治療急性肝衰竭大鼠的作用機(jī)制。以期為臨床提供更佳的治療手段。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2～3周齡，體質(zhì)量(120±20)g，10只健康SPF級(jí)SD雄性大鼠，用于干細(xì)胞制備。6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，60只健康SD雄性大鼠，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2018-17，使用許可證號(hào)：SCXK(川)2018-065。

1.2 藥物與試劑

1.2.1 藥物 茵陳四苓顆粒(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，由醫(yī)院制劑室制備，川藥制劑Z20070525，許可證號(hào)：川2016039HZ。)；復(fù)方甘草酸苷片(日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130077)；硫代乙酰胺(Sigma 型號(hào) 163678-25G)；戊巴比妥粉劑(上海榕柏)。試劑：總蛋白定量測(cè)定試劑盒(南京建成，型號(hào) A045-4-2)；ATP含量測(cè)定試劑盒(南京建成，型號(hào)A095-1-1)；線粒體提取試劑盒(索萊寶，型號(hào) SM0020)；線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ活性檢測(cè)試劑盒(索萊寶，型號(hào) BC0515、BC3230)；線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性檢測(cè)試劑盒(索萊寶，型號(hào) BC3240)。L-DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清(Hyclone公司)；青鏈霉素溶液(碧云天)；胰酶細(xì)胞消化液(碧云天)；抗大鼠CD-25/45、99-PE單克隆抗體(Bioelend)。

1.2.2 儀器、耗材 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)；電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器公司)；37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)、-80℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)；FLUKO超細(xì)勻漿器(弗魯克(上海)流體機(jī)械制造公司)；酶標(biāo)儀(美谷分子儀器公司)；UV752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表公司)；透射電子顯微鏡(日本電子 JEOL生產(chǎn))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 采用全骨髓貼壁法制備大鼠BMSCs 大鼠2%戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后予以脫頸處死；放入75%酒精浸泡5 min后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗5 min后取出雙下肢，鈍性分離股骨、脛骨，剪去兩端骨骺，無(wú)菌條件下快速予以細(xì)胞培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，輕柔吹打混勻，維持細(xì)胞濃度1.0×106個(gè)/mL接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h更換完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底達(dá)90%時(shí)，用0.25%胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，分瓶傳代培養(yǎng)；傳至第三代時(shí)用流式細(xì)胞儀鑒定。

2.2 構(gòu)建急性肝衰竭大鼠模型及評(píng)價(jià)造模成功的方法和指標(biāo)

2.2.1 造模方法 隨機(jī)將60只SD健康雄性大鼠等分為6組，分別為正常組、聯(lián)合組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型組、中藥組、干細(xì)胞組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，保持充足飼料和飲水，室溫控制在22℃左右，記錄各組大鼠體重變化情況。于造模前12 h禁食不禁飲，除開(kāi)正常組外各組均予以硫代乙酰胺(TAA)300 mg/kg腹腔注射造模，正常組予以等量生理鹽水腹腔注射干預(yù)，間隔24 h重復(fù)1次。造模期間提供葡萄糖氯化鈉補(bǔ)充熱量，觀察大鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食量、體重及大小便等情況。

2.2.2 評(píng)價(jià)造模成功的方法和指標(biāo)

2.2.2.1 大鼠一般情況改變 模型組10只大鼠于造模后出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)量劇減，行為異常，進(jìn)食量及飲水量顯著減少，體重下降，可見(jiàn)毛發(fā)粗糙晦暗，四肢皮膚青紫，皮下可見(jiàn)瘀癍、瘀點(diǎn)，大便稀溏，小便黃少，其中個(gè)別大鼠肛周出現(xiàn)異常出血，相繼出現(xiàn)死亡，最后僅存活4只。

2.2.2.2 正常組與模型組血清學(xué)結(jié)果比較 正常組大鼠肝功能指標(biāo)是處于SD大鼠血液生化指標(biāo)的正常參考范圍內(nèi)，而模型組大鼠肝功能AST、ALT、TBIL在48 h內(nèi)均明顯升高，符合急性肝功能衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表1。

表1 正常組與模型組造模48 h后肝功水平比較

2.2.2.3 正常組與模型組肝臟組織病理HE染色比較 對(duì)模型組肝組織進(jìn)行HE染色，可見(jiàn)肝細(xì)胞分葉不明顯，肝索排列紊亂，中央靜脈內(nèi)皮部分缺失，中央靜脈和門(mén)管區(qū)周?chē)渭?xì)胞不同程度變性壞死，見(jiàn)壞死肝細(xì)胞崩解，結(jié)構(gòu)模糊，壞死區(qū)伴有少量核圓形深染的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，膽管正常結(jié)構(gòu)消失，符合肝衰竭肝損傷表現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

A-正常組

2.3 給藥方法 造模成功后，參照《中藥藥理研究方法學(xué)》計(jì)算中藥組及聯(lián)合組予以茵陳四苓顆粒灌胃(1.5 g/kg，2次/d)，陽(yáng)性對(duì)照組予以復(fù)方甘草酸苷片溶液灌胃(7.5 mg/kg，2次/d)，其余組灌胃等量生理鹽水；干細(xì)胞組及聯(lián)合組尾靜脈注射BMSCs懸液(1.0×106個(gè)/mL)，其余各組尾靜脈注等體積細(xì)胞培養(yǎng)液。

2.4 標(biāo)本取材和處理 干預(yù)72h后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥麻醉后開(kāi)腹，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后脫頸處死，立即取出肝組織分別用3%戊二醛和4%多聚甲醛固定，部分肝組織-80℃低溫保存，用于測(cè)定線粒體呼吸鏈復(fù)合體I、II、III酶活性和ATP酶含量。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 生化檢測(cè) 大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后靜置離心收集血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肝功AST、ALT、TBIL。

2.5.2 Westerb-blot法測(cè)定大鼠肝臟中Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大鼠肝臟總蛋白，經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗兔抗大鼠Bcl-2抗體、Caspase-3抗體(濃度：1∶2000)，再將PVDF膜二抗孵育(稀釋濃度：1∶5000)，將放有膜的曝光板放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀的暗室中，根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，用天能GIS機(jī)箱控制軟件V2.0對(duì)條帶進(jìn)行曝光掃描，結(jié)果以目的蛋白相對(duì)表達(dá)量表示。

2.5.3 磷鉬酸比色法測(cè)定肝臟線粒體ATP含量 參考ATP含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)及測(cè)定原理，對(duì)肝組織樣本處理后，制備底物液、顯色應(yīng)用液，采用磷鉬酸比色法進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)組織、細(xì)胞中ATP含量計(jì)算公式：ATP濃度(umol/gropt)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(1×103umol/L)×樣本測(cè)定前稀釋倍數(shù)/血紅蛋白濃度(gHb/L)，計(jì)算ATP含量。

2.5.4 紫外分光光度計(jì)測(cè)定呼吸鏈復(fù)合體I、II、III活性 按照線粒體提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將肝組織置于4℃冰上勻漿，勻漿液離心取上清液(即為包漿提取物)，采取紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定用于測(cè)定呼吸鏈復(fù)合體I、II、III酶活性。以微量石英比色皿計(jì)算復(fù)合體I酶活性，按樣本蛋白濃度計(jì)算復(fù)合體II、III活力。

2.5.5 肝臟組織病理檢測(cè) 將固定于10%中性甲醛固定液中的肝組織標(biāo)本取出，進(jìn)行脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片等操作后于顯微鏡下觀察肝臟病理結(jié)構(gòu)變化。

2.5.6 透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 肝組織于3%戊二醛固定后置于1%四氧化鋨再固定，使用丙酮逐級(jí)脫水，脫水完畢后進(jìn)行滲透與包埋已備下一步超薄切片(約50 mm厚)，用雙色染色法染色15～20 min后進(jìn)行圖像采集，觀察肝細(xì)胞及肝線粒體等病理結(jié)構(gòu)變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選擇GraphPad Prism8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及作圖，多組間比較使用單因素ANOVA進(jìn)行比較分析，差異顯著(P<0.05)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BMSCs培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 將大鼠BMSCs接種至培養(yǎng)瓶48 h后換液大部分細(xì)胞貼壁，顯微鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞呈圓形，呈“滿(mǎn)天星”分布，折光性強(qiáng)(見(jiàn)圖2-A原代細(xì)胞)。細(xì)胞快速增長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形、紡錘狀、漩渦狀均勻排列，逐漸融合成片(見(jiàn)圖2-B第二代、圖2-C為第三代)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物CD29表達(dá)率為99.90%，CD90表達(dá)率為99.56%，呈強(qiáng)陽(yáng)性，CD45表達(dá)率為0.51%，CD34表達(dá)率為0.20%，呈陰性，見(jiàn)圖3。

A-原代細(xì)胞

圖3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果

3.2 各組大鼠血清AST、ALT、TBIL水平比較 與模型組相比，干預(yù)組大鼠肝功水平(AST、ALT、TBIL)均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與正常組相比肝功水平仍高(P<0.05)。各干預(yù)組相比，聯(lián)合組肝功(AST、ALT、TBIL)水平最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠血清AST、ALT及TBIL水平比較

3.3 各組大鼠肝臟組織病理觀察 正常組肝索排列較為整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)肝細(xì)胞變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維增生。與正常組相比，模型組肝索排列相對(duì)紊亂，可見(jiàn)中央靜脈或門(mén)管區(qū)周?chē)渭?xì)胞明顯變性壞死、膽管壞死，同時(shí)壞死區(qū)伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，基本符合肝衰模型的病變特征；各干預(yù)組與模型組比較，各組肝索排列相對(duì)整齊，肝細(xì)胞壞死程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見(jiàn)圖5。

正常組

3.4 透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果 正常組肝細(xì)胞體積大，呈多角形或多面體，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；細(xì)胞核完整，體形大而圓，位于中央，胞漿豐富且線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等細(xì)胞器，各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，僅在胞漿內(nèi)見(jiàn)少量的脂滴。模型組電鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞胞漿中較多數(shù)線粒體已發(fā)生腫脹，嵴斷裂、溶解甚至消失，細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)聚集，胞漿電子密度增高，可見(jiàn)大量凋亡的肝細(xì)胞，疑似為凋亡現(xiàn)象。其余各組以聯(lián)合組肝細(xì)胞胞漿中線粒體病變程度最小、范圍較小，較少數(shù)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，見(jiàn)圖6。

正常組

3.5 各組大鼠肝臟ATP濃度結(jié)果 據(jù)表2、表3統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與模型組相比，正常組大鼠肝臟勻漿中和線粒體提取液中ATP濃度均明顯升高(P<0.01)；聯(lián)合組大鼠肝臟勻漿中和線粒體提取液中ATP濃度均升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠肝臟勻漿中ATP濃度變化

表3 各組大鼠線粒體提取液中ATP濃度的變化

與聯(lián)合組相比，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝臟線粒體提取液中ATP濃度降低(P<0.05)。余組間大鼠肝臟線粒體ATP濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.6 各組大鼠線粒體提取液中復(fù)合體I、II、III活力變化 由表4可見(jiàn)，與模型組相比，正常組大鼠肝臟線粒體提取液中復(fù)合體Ⅰ、II、III活力明顯升高，差異極顯著(P<0.01)；聯(lián)合組大鼠肝臟線粒體提取液中復(fù)合體Ⅰ、III活力升高，差異顯著(P<0.05)；其余各干預(yù)組大鼠肝臟線粒體提取液中復(fù)合體Ⅰ、II、III活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠線粒體提取液中復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活力的變化

與聯(lián)合組相比，干細(xì)胞組大鼠肝臟線粒體提取液中復(fù)合體Ⅱ活力降低，差異顯著(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝臟線粒體提取液中復(fù)合體Ⅲ活力降低，差異顯著(P<0.05)。其余組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.7 肝組織Bcl-2、Caspase-3的蛋白表達(dá) 與正常組相比，模型組大鼠肝臟中Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，各干預(yù)組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，聯(lián)合組Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與聯(lián)合組相比，各干預(yù)組大鼠肝臟中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。分別見(jiàn)圖7、表5。

圖7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

表5 各組大鼠肝臟中Bcl-2、Caspase-3的蛋白表達(dá)

4 討論

急性肝衰竭是由多種原因引起的致死性疾病，臨床上表現(xiàn)為肝臟大面積的變性和壞死，肝功能的急劇下降甚至完全喪失，以及由之引起的多器官功能的障礙。至今本病發(fā)病機(jī)制尚未研究明確，據(jù)研究表明[13-14]大量肝細(xì)胞凋亡為其主要發(fā)病機(jī)制之一，線粒體作為細(xì)胞能量代謝中心，在肝細(xì)胞凋亡過(guò)程中伴隨著線粒體大小、形態(tài)、數(shù)量、結(jié)構(gòu)異常改變，線粒體在肝細(xì)胞凋亡中起到至關(guān)重要的作用[15-16]，并在肝臟疾病中發(fā)揮著舉足輕重的影響。ALF的治療一直是臨床亟待解決的難題，因此肝衰竭治療可以從改善線粒體結(jié)構(gòu)、提高能量代謝、保護(hù)線粒體電子呼吸鏈功能方面探索。近年來(lái)干細(xì)胞移植成為治療ALF研究熱點(diǎn)，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是來(lái)源于骨髓的中胚層非造血多能干細(xì)胞，具有抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、改善線粒體功能、提高生存率等作用[17]。鑒于以上諸多優(yōu)點(diǎn)，吸引廣大研究者選擇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植替代肝臟移植治療肝衰竭。

急性肝衰竭大致可歸屬于中醫(yī)領(lǐng)域中“急黃”、“瘟黃”等病范疇，此類(lèi)患者臨床常不同程度伴有腹脹、厭油納差、乏力等脾氣虛、濕邪困脾的表現(xiàn)。故本實(shí)驗(yàn)提出從“脾”論治急性肝衰竭。中醫(yī)脾與線粒體的功能特征有許多相同之處[18]。1991年首次提出“中醫(yī)脾-線粒體”假說(shuō)，其氧化磷酸化產(chǎn)能過(guò)程與脾主運(yùn)化功能相吻合，脾(線粒體)的強(qiáng)弱決定正氣的盛衰及機(jī)體是否發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)采用“健脾利濕”聯(lián)合“清熱解毒”法治療急性肝衰竭，選用由四川省名中醫(yī)孫同郊教授經(jīng)驗(yàn)方擬定——茵陳四苓顆粒(原肝毒清顆粒)，是本院自主開(kāi)發(fā)的院內(nèi)制劑，主要由茵陳、白術(shù)、茯苓、豬苓、澤瀉、大黃、梔子等藥物組成。茵陳乃“退黃要藥”、白術(shù)為“補(bǔ)氣健脾第一藥”、茯苓“健脾祛濕第一藥”、豬苓“健脾利水”、澤瀉“健脾滲濕”，諸藥共奏清熱解毒、健脾利濕之功。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[19-22]，茵陳具有保肝、抗炎、抑制線粒體凋亡的作用，白術(shù)、豬苓能減輕肝細(xì)胞損傷、促進(jìn)肝細(xì)胞再生，大黃具備促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放的功效，其中白術(shù)、大黃、澤瀉均能改善線粒體結(jié)構(gòu)功能、增強(qiáng)線粒體能量代謝。因此茵陳四苓顆粒有藥理學(xué)基礎(chǔ)證明具有保肝、改善線粒體結(jié)構(gòu)功能的功效。根據(jù)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[23]，茵陳四苓顆粒聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能減輕急性肝衰竭大鼠肝臟炎癥活動(dòng)指數(shù)、抑制肝臟細(xì)胞凋亡、抑制線粒體凋亡。

研究表明[14]，線粒體功能障礙與肝衰竭發(fā)病密切相關(guān)。線粒體作為機(jī)體“能量工廠”，是細(xì)胞能量合成、儲(chǔ)藏、交換以及細(xì)胞進(jìn)行氧化呼吸的場(chǎng)所。線粒體將有機(jī)物氧化產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)之為氧化磷酸化。ATP廣泛存在于細(xì)胞中，能直接反映機(jī)體能量代謝狀態(tài)。電子傳遞鏈的作用代表線粒體最基本的功能，由于其功能與呼吸作用直接相關(guān)，亦稱(chēng)之為呼吸鏈。呼吸鏈由4種復(fù)合物、細(xì)胞色素C和輔酶Q構(gòu)成。4種復(fù)合物(Complex)按照電子傳遞先后順序，分為復(fù)合物I、II、III、IV，分別又名為NADH脫氫酶(NADH dehydrogenase)、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)、CoQH2-細(xì)胞色素C還原酶復(fù)合物、細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome c Oxidase)。呼吸鏈分為主呼吸鏈和次呼吸鏈，其中主呼吸鏈?zhǔn)怯蒒ADH開(kāi)始的呼吸鏈，由復(fù)合體I、III、IV組成；次呼吸鏈?zhǔn)怯蒄ADH2開(kāi)始，包含復(fù)合體II、III、IV，本條電子傳遞不經(jīng)過(guò)復(fù)合體I。在正常生理電子傳遞過(guò)程中，復(fù)合物酶的活性變化能較為直觀地反映線粒體呼吸功能。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射硫代乙酰胺構(gòu)造急性肝衰竭大鼠模型，模型組大鼠肝線粒體復(fù)合物I、II、III酶的活性與正常組相比均明顯下降，使呼吸鏈電子傳遞受阻，ATP生成減少。肝線粒體酶復(fù)合物活性下降導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，這可能是急性肝衰竭的發(fā)病機(jī)制之一。聯(lián)合組與干預(yù)組相比，復(fù)合體Ⅰ、III活力升高，復(fù)合物Ⅰ是機(jī)體內(nèi)部能量物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成ATP 的橋梁[24]。線粒體ATP含量均顯著增多，說(shuō)明茵陳四苓顆粒聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能通過(guò)改善線粒體呼吸功能、提高ATP含量、增強(qiáng)能量代謝，從而達(dá)到治療急性肝衰竭的作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)采用“健脾補(bǔ)脾”聯(lián)合“清熱解毒”的治法，將茵陳四苓顆粒聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性肝衰竭大鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明聯(lián)合組能顯著提高大鼠肝臟線粒體呼吸鏈復(fù)合物活力、增強(qiáng)ATP活性、改善能量代謝，證實(shí)“從脾論治”對(duì)線粒體的功能恢復(fù)具有明顯的作用，最終達(dá)到改善急性肝衰竭大鼠病情的目的。但本實(shí)驗(yàn)存在移植干細(xì)胞頻數(shù)較少、途徑單一、數(shù)量有限，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)可設(shè)置不同的移植頻數(shù)、劑量、途徑，從而進(jìn)一步優(yōu)化干細(xì)胞移植治療急性肝衰竭效果，以選取最佳劑量、把握最佳移植時(shí)機(jī)，為中藥聯(lián)合干細(xì)胞治療急性肝衰竭提供新的診治思路。