＊邰佳 馬海英

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院藥學(xué)部 遼寧 110032）

玉米須是禾本科植物玉蜀黍的花柱頭，是我國傳統(tǒng)的中藥材，常用于治療高血壓、水腫、膀胱炎、腎炎和泌尿系統(tǒng)感染、結(jié)石等癥，具有較好的療效。毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米須安全性好，大量食用對(duì)人體無害[1]，世界上許多國家都將其列為安全的保健飲品食用。對(duì)玉米須的利用在我國古代本草里也早有記載。玉米是我國的重要種植物，近五年的平均年產(chǎn)量近2.5億噸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，玉米作物中的玉米須與玉米粒的產(chǎn)量接近1:20，按此計(jì)算，玉米須的年產(chǎn)量近0.1億噸[2]。玉米須的年產(chǎn)量甚為可觀，具有明確的藥理作用和良好的使用安全性，值得大家廣為推廣和使用。玉米須具有較好的利用價(jià)值，但目前我國的玉米須資源絕大部分作為廢棄物棄于田間地頭，部分與秸稈一起供動(dòng)物食用，也有一少部分被康美藥業(yè)等中藥材加工企業(yè)收購。需要增加玉米須的利用途徑，拓寬玉米須的使用方法，提高玉米須的有效率用程度，變廢為寶。文獻(xiàn)研究證明，玉米須含有黃酮[3]、多糖[4]等活性化學(xué)成分，對(duì)于多種人類疾病具有較好的療效，將其棄之甚為可惜。玉米須及其加工產(chǎn)品具有較好的開發(fā)價(jià)值，應(yīng)大力開發(fā)利用，提高玉米須的利用率[5]。研究表明，固態(tài)發(fā)酵技術(shù)可以有效提高中藥活性成分的產(chǎn)量[6]，可以改變酒、醋等食品的風(fēng)味物質(zhì)，越來越多的應(yīng)用于人民生活中。本文采用混合菌株培養(yǎng)，以黃酮和多糖為指標(biāo)，優(yōu)化玉米須的固態(tài)發(fā)酵工藝，考察固態(tài)發(fā)酵對(duì)玉米須提取物品質(zhì)的影響，為玉米須資源的充分有效利用，提供支持和依據(jù)。

1.材料與方法

(1)原料與試劑

玉米須（采自沈陽本地，陰干后粉碎過40目篩），枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，酵母膏葡萄糖培養(yǎng)基購自上海研生生化試劑有限公司，水為實(shí)驗(yàn)室二級(jí)水，其他試劑均為分析純。

(2)儀器設(shè)備

YXQ-LS-100S型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），KR4i型低溫離心機(jī)（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），HH-6S型恒溫水浴鍋（上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），UV-8000型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），AB204-S型電子天平（美國梅特勒-托利多公司）。

(3)玉米須的固體發(fā)酵工藝

玉米須經(jīng)陰干粉碎過40目篩后蒸汽滅菌，冷至室溫，與培養(yǎng)基充分混合均勻，調(diào)節(jié)水分為50%至60%，100℃常壓滅菌30min，冷卻后無菌接種枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌，接種比例為8%，35℃厭氧發(fā)酵培養(yǎng)72h，發(fā)酵完成后將物料烘干粉碎，即得玉米須固體發(fā)酵物。

(4)總黃酮和多糖的測(cè)定方法

本研究采用已多年使用的方法進(jìn)行總黃酮和多糖的含量測(cè)定，采用侯少平[7]等人提出的乙醇回流提取法提取玉米須中的總黃酮，以紫外可見分光光度法測(cè)定總黃酮含量。采用鐘世紅[8]等人提出的苯酚-硫酸比色法測(cè)定玉米須中多糖的含量。

2.結(jié)果與分析

(1)菌種比例對(duì)發(fā)酵后總黃酮和多糖的影響

與單一菌種的發(fā)酵工藝相比，混合菌種可以提供的酶系統(tǒng)相對(duì)更加完整，也更適用于對(duì)玉米須的固體發(fā)酵。參考前人研究結(jié)果，本試驗(yàn)使用枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌的混合菌種來協(xié)調(diào)發(fā)酵，通過不同菌種間的協(xié)同作用來增加玉米須發(fā)酵物中總黃酮和多糖的產(chǎn)量。在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接種了枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌，接種比例分別為1:1、2:3、1:2、2:1、3:2，結(jié)果見表1。當(dāng)枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌為3:2時(shí)，總黃酮和多糖含量均達(dá)到最高，分別為4.27%和6.27%。發(fā)酵后的總黃酮含量和多糖含量與發(fā)酵前相比均有提高，固態(tài)發(fā)酵工藝可以提高玉米須的品質(zhì)。參考不同菌種比例的研究結(jié)果，本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌的比例為3:2作為混合菌比例，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 不同比例的混合菌發(fā)酵后對(duì)總黃酮和多糖含量的影響

(2)接種量對(duì)發(fā)酵后總黃酮和多糖的影響

微生物發(fā)酵過程中，菌種的接種量也是重要的影響因素。這是因?yàn)檫m宜的菌種接種量會(huì)加快發(fā)酵速率，提高效率。以較低的接種量接種時(shí)，會(huì)有一段時(shí)間是菌種的繁殖期，之后菌種才會(huì)對(duì)玉米須有發(fā)酵作用。較低的接種量會(huì)延長(zhǎng)固態(tài)發(fā)酵的工藝過程，造成不必要的時(shí)間和人工的浪費(fèi)。過大的菌種接種量則會(huì)引起不必要的消耗，也不利于發(fā)酵過程。參考前人的研究結(jié)果表明，過大的菌種接種量也會(huì)影響固體發(fā)酵物的品質(zhì)。這是由于過多的菌種間會(huì)存在競(jìng)爭(zhēng)，可能產(chǎn)生更多的菌種繁殖代謝產(chǎn)物，而這些代謝產(chǎn)物并不一定會(huì)提高發(fā)酵物的品質(zhì)。因此，適宜的接種量對(duì)于固態(tài)發(fā)酵工藝來說是重要的工藝控制點(diǎn)，需要進(jìn)行考察，在實(shí)際生產(chǎn)過程中也要嚴(yán)格的按照篩選得到的接種量來接種，避免造成固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)不同。本文對(duì)接種量進(jìn)行考察，接種比例為3:2的枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌混合菌種，分別按照1.0%、2.0%、5.0%、8.0%和10.0%的接種量來接種，測(cè)定發(fā)酵物中的總黃酮和多糖含量，結(jié)果見表2。當(dāng)接種量為8.0%時(shí)，玉米須發(fā)酵物中的總黃酮和多糖含量均達(dá)到最高。以8.0%為混合菌接種量，進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 不同接種量的混合菌發(fā)酵后對(duì)總黃酮和多糖含量的影響

(3)發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵后總黃酮和多糖的影響

微生物的發(fā)酵溫度也是影響玉米須固體發(fā)酵物品質(zhì)的重要影響因素，過低的發(fā)酵溫度不利于菌種的繁殖，混合菌種體內(nèi)的酶催化活性不夠，不利于對(duì)玉米須的發(fā)酵。而過高的發(fā)酵溫度可能會(huì)導(dǎo)致菌種體內(nèi)的酶失活，也不利于發(fā)酵環(huán)境中的一系列化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，過高的發(fā)酵溫度下，微生物易于產(chǎn)生一些對(duì)人體不利的代謝產(chǎn)物，因此需要對(duì)發(fā)酵溫度進(jìn)行考察，選擇適宜的發(fā)酵溫度來進(jìn)行固體發(fā)酵。在盡可能的多獲得總黃酮和多糖的前提下，要采用適宜的發(fā)酵溫度進(jìn)行發(fā)酵。參考發(fā)表文獻(xiàn)的研究成果，一般微生物發(fā)酵溫度的考察以25℃開始，接近50℃結(jié)束。本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-15]方法，以接種比例為3:2的枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌混合菌種，按照8.0%的接種量來接種，分別在28℃、30℃、33℃、35℃、38℃的條件下發(fā)酵，測(cè)定玉米須發(fā)酵物中的總黃酮和多糖含量，不同發(fā)酵溫度對(duì)玉米須固態(tài)發(fā)酵物中總黃酮和多糖含量的影響，結(jié)果見表3。研究結(jié)果表明，玉米須發(fā)酵物中總黃酮和多糖隨著發(fā)酵溫度的升高，變化趨勢(shì)是相同的。當(dāng)發(fā)酵溫度為35℃時(shí)，玉米須發(fā)酵物中的總黃酮和多糖含量均達(dá)到最高，之后二者均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。說明以總黃酮和多糖為目標(biāo)物的固態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)酵溫度不應(yīng)超過35℃，因此，本試驗(yàn)以35℃為適宜的發(fā)酵溫度進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵工藝研究。

表3 不同發(fā)酵溫度對(duì)玉米須固態(tài)發(fā)酵物中總黃酮和多糖含量的影響

(4)發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵后總黃酮和多糖的影響

固態(tài)發(fā)酵時(shí)間過短，則菌種對(duì)玉米須的作用時(shí)間不足，品質(zhì)改變不大。固態(tài)發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，可能存在微生物與微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)，可能產(chǎn)生一些影響品質(zhì)的微生物代謝產(chǎn)物。因此，選擇適宜的發(fā)酵時(shí)間有利于獲得高品質(zhì)的玉米須固體發(fā)酵產(chǎn)物。適宜的發(fā)酵時(shí)間也有利于控制發(fā)酵工藝的能耗和人工成本。本試驗(yàn)考察了24h、48h、72h、96h和120h的發(fā)酵時(shí)間，結(jié)果見表4。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72h時(shí)，玉米須固體發(fā)酵物中的總黃酮和多糖含量均達(dá)到最高，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，最佳發(fā)酵時(shí)間為72h。

表4 不同接種時(shí)間對(duì)玉米須固態(tài)發(fā)酵物中總黃酮和多糖含量的影響

3.討論

固態(tài)發(fā)酵技術(shù)是在較少水存在的條件下，將微生物接種在基質(zhì)上繁殖，利用微生物的作用促進(jìn)基質(zhì)發(fā)酵的一種方式。固態(tài)發(fā)酵可以促進(jìn)基質(zhì)中的活性成分的提高，并能提高一些基質(zhì)中某些特異物質(zhì)的含量，也就是食品中提到的風(fēng)味物質(zhì)。近十年間，固態(tài)發(fā)酵技術(shù)迅速發(fā)展起來，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛[16]。尤其在中藥藥渣的再利用，中藥材活性成分的發(fā)酵炮制，以及釀酒、釀醋等食用產(chǎn)品的風(fēng)味加工上都取得了較大的進(jìn)展[17-19]。通過固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，可以提高中藥藥渣等廢棄物的再利用價(jià)值，實(shí)現(xiàn)中藥材資源的充分和有效的利用。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)也可改變酒、醋等食用品的風(fēng)味物質(zhì)組成，生產(chǎn)出風(fēng)味各異的高品質(zhì)食品。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)的一種成本較低，采用常見工藝設(shè)備進(jìn)行發(fā)酵，操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)控制的關(guān)鍵控制點(diǎn)清晰，生產(chǎn)后幾乎沒有廢水廢液排放，是一種發(fā)酵工業(yè)的綠色清潔生產(chǎn)工藝。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，對(duì)人員和場(chǎng)地的要求不高，具備發(fā)酵的場(chǎng)地和設(shè)備，人員具有基本的化學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，通過培訓(xùn)，就可按照規(guī)程開展生產(chǎn)工作，方法易于推廣。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)的這些優(yōu)點(diǎn)使得該技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用越來越廣泛，在混合菌種的使用上也越來越趨于成熟，對(duì)于不同的目標(biāo)化合物，采用不同種類混合菌種的發(fā)酵技術(shù)也越來越具備經(jīng)驗(yàn)。玉米須是玉米作物的副產(chǎn)物，我國的科研工作者已對(duì)玉米須的化學(xué)成分進(jìn)行了較全面的研究，也對(duì)玉米須的藥理作用進(jìn)行了較全面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。相對(duì)而言，玉米須對(duì)人類的安全性很高，幾乎無毒副作用。我國是玉米作物的種植大國，玉米須的產(chǎn)量很大，幾乎遍布整個(gè)中國。因此，對(duì)玉米須的合理開發(fā)利用，變廢為寶，是科研工作者近些年需要解決的問題之一。

本試驗(yàn)選取枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌為混合菌種，對(duì)玉米須進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以總黃酮含量和多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定玉米須固體發(fā)酵工藝的最佳工藝條件：經(jīng)試驗(yàn)，枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌混合菌種的接種比為3:2，接種量為8%，發(fā)酵溫度為35℃，發(fā)酵時(shí)間為72h。固態(tài)發(fā)酵后玉米須中的總黃酮含量提高了38.89%，多糖含量提高了32.69%。這可能是因?yàn)橛衩醉氈芯哂休^高的纖維物質(zhì)，在復(fù)合微生物菌的作用下，纖維素的細(xì)胞壁被枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌的酶系代謝，促進(jìn)了黃酮和多糖的釋放。因此，經(jīng)微生物發(fā)酵后，玉米須中的總黃酮和多糖含量均有所增高。通過固態(tài)發(fā)酵的工藝，可以有效提高玉米須中活性成分的含量。我國的玉米資源豐富，玉米須中活性成分含量高，目前大部分作為廢棄物處置，應(yīng)為玉米須的充分利用提供更多可行的途徑，本文為玉米須資源的綜合利用提供了一個(gè)附加值更高的方法，可供相關(guān)人員借鑒使用，也可作為農(nóng)業(yè)資源深加工的實(shí)例推廣應(yīng)用。