＊朱少瑜

（廈門寶太生物科技股份有限公司 福建 361022）

進(jìn)入21世紀(jì)以來，重組蛋白的分離純化技術(shù)發(fā)展非常迅速。重組蛋白的生產(chǎn)分成上游表達(dá)和下游純化兩個(gè)部分[1]，下游的分離純化技術(shù)是蛋白質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。在重組蛋白質(zhì)的分離純化過程中，層析技術(shù)通常用于分離工序的后部，因?yàn)槠錄Q定著產(chǎn)品的純度和收率。而柱層析具有高選擇性，在蛋白質(zhì)分離純化中已成為中流砥柱[2-3]，因而在生物制藥行業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用。

1.柱層析的原理

層析法是根據(jù)不同物質(zhì)理化性質(zhì)的不同，因而在固定相和流動(dòng)相中的吸附能力不同而建立起來的分離技術(shù)。其核心是樣品中的不同組分在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同，各組分隨著流動(dòng)相的移動(dòng)而在兩相中進(jìn)行不斷的分配。柱層析就是將固定相裝填在層析柱內(nèi)，被分離的組分由于與固定相的吸附力不同而吸附在固定相上。當(dāng)采用溶劑洗脫時(shí)，發(fā)生一系列吸附解吸頻繁作用的過程，與固定相吸附力較弱的組分，率先被洗脫出柱；與固定相吸附力較強(qiáng)的組分，滯后被洗脫出柱，從而達(dá)到分離純化的目的。

2.柱層析的種類

親和層析、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠層析這四種層析種類在重組蛋白的分離純化工藝中是最常用到的。一般來說，大部分純化工藝需要多種層析方法聯(lián)用或者僅用一種層析方法來獲取純度合格的目的蛋白。因此選擇合適的層析方法并排序是優(yōu)化蛋白質(zhì)純化工藝的關(guān)鍵。

(1)親和層析(AC)

AC是通過固定相配基與其特異性配體之間的特異性親和力的不同而分離的層析方法[4]。蛋白質(zhì)與配基間的結(jié)合是可逆的。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)通過層析柱時(shí)，配基直接與目的蛋白結(jié)合，也可以與目的蛋白的標(biāo)簽結(jié)合。不被吸附的雜質(zhì)則通過柱體，再利用高濃度的底物溶液或親和力更強(qiáng)的底物衍生溶液洗脫目的蛋白，從而達(dá)到分離純化目的蛋白的效果。AC具有高收率、高純度、速度快的特點(diǎn)，也是目前蛋白質(zhì)分離中最有效的方法[5-6]。一般在純化工藝的前中期應(yīng)用。根據(jù)后續(xù)蛋白的應(yīng)用需求，某些工藝可能只用一步親和層析即可獲得純度合格的目的蛋白質(zhì)，簡化工藝步驟和節(jié)省時(shí)間成本[7]。

(2)離子交換層析(IEX)

IEX分離蛋白的原理是基于蛋白質(zhì)組分凈電荷的不同，通過蛋白質(zhì)與帶電荷的固定相之間的靜電作用力結(jié)合能力的不同進(jìn)行分離。即根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)的差異，蛋白質(zhì)組分在離子交換介質(zhì)上的親和力不同，用不同的pH或離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行洗脫，從而使蛋白質(zhì)分離的柱層析方法[8]。離子交換分為兩類，陰離子交換層析和陽離子交換層析。在洗脫方式上，陰離子交換層析主要是改變緩沖液的離子強(qiáng)度濃度，一般采用流穿模式，通常用于分離大部分蛋白質(zhì)和去除內(nèi)毒素、宿主蛋白、DNA等；而陽離子交換層析主要是改變緩沖液的pH，通常采用吸附模式，帶正電荷的目的蛋白吸附在離子交換介質(zhì)上，帶負(fù)電的雜質(zhì)流穿，主要應(yīng)用于PI（等電點(diǎn)）＞5的蛋白質(zhì)[9-11]。

因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的凈電荷受其溶劑pH的影響。當(dāng)緩沖液pH＞pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，而當(dāng)緩沖液pH＜pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電（圖1）。因此，理論上可以通過調(diào)節(jié)緩沖液的pH，利用蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)變化，所有的蛋白質(zhì)均可用離子交換進(jìn)行分離。這也是離子交換層析應(yīng)用范圍廣的原因。IEX通常用于蛋白質(zhì)純化工藝的中期。但是對(duì)某些特定的蛋白質(zhì)而言，在純化工藝的前期或后期采用該方法也可能很好的將目的蛋白質(zhì)分離純化。

圖1 緩沖液pH值對(duì)蛋白質(zhì)帶電荷的影響

(3)疏水作用層析(HIC)

HIC是依據(jù)蛋白質(zhì)自身的疏水性不同，利用蛋白質(zhì)與疏水層析介質(zhì)的相互作用來分離蛋白質(zhì)。在HIC中，蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的緩沖液中可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的部分去折疊，將隱藏于內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來，使蛋白質(zhì)的疏水性增強(qiáng)，與層析介質(zhì)的結(jié)合力也增強(qiáng)。進(jìn)行樣品洗脫時(shí)，降低洗脫液的鹽濃度，與層析介質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)會(huì)恢復(fù)到原來的折疊結(jié)構(gòu)，降低其疏水性，從而把樣品洗脫出來，達(dá)到分離純化的目的。

HIC在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用[12]。是用于IEX后或者是樣品硫銨沉淀后理想的純化步驟。在這兩種情況下，樣品緩沖液中都含有高濃度的鹽，可以不經(jīng)過處理或很少的處理步驟即可直接對(duì)疏水層析柱進(jìn)行上樣操作。該層析方法通常在蛋白質(zhì)純化工藝的中期使用。

(4)凝膠層析(GF)

GF是根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小和形狀為分離基礎(chǔ)的。即不同的蛋白質(zhì)分子的大小和形狀通過凝膠介質(zhì)時(shí)，不同形狀、大小的蛋白質(zhì)分子經(jīng)過固定相的路徑不同，其所滯留時(shí)間的不同來進(jìn)行分離的一種柱層析方法（圖2）。與上述其他層析方法不同的是，蛋白質(zhì)分子不與凝膠介質(zhì)相互作用，可以不用更換緩沖液就能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。特別對(duì)高分子物質(zhì)有很好的分離效果。

圖2 不同大小的蛋白質(zhì)混合物用凝膠層析分離

因?yàn)镚F的分離是根據(jù)蛋白質(zhì)不同組分在層析柱內(nèi)流經(jīng)途徑的遠(yuǎn)近之差所達(dá)到分離效果，因此對(duì)層析柱的長度要求較高，一般為70～100cm。通?？梢灶A(yù)估GF的洗脫時(shí)間，所以可以根據(jù)上樣量和間隔時(shí)間進(jìn)行連續(xù)上樣，從而提高層析柱的使用率，縮短純化周期。凝膠層析一般用于脫鹽、組分分離、測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量等。因此，GF通常用在蛋白質(zhì)純化工藝的最后一步。

(5)層析方法對(duì)比

蛋白質(zhì)分離純化的方法很多,對(duì)于不同的目標(biāo)產(chǎn)物，分離純化的方法不同，而有些相同的目標(biāo)產(chǎn)物，分離純化的方法也不盡相同。對(duì)于柱層析來說，采用不同的柱層析種類，可能就會(huì)得到不同的目標(biāo)產(chǎn)物，收率、純度都會(huì)影響。因此充分了解柱層析種類的特性，才能設(shè)計(jì)出蛋白質(zhì)分離純化的最佳工藝。表1為應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的層析種類對(duì)比。

表1 應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的層析種類對(duì)比

通過對(duì)以上幾種柱層析種類的特性對(duì)比，在蛋白純化工藝設(shè)計(jì)時(shí)，一般將IEX或HIC放在工藝前端，GF放在工藝后端，AC放在工藝的中間或者不選用，當(dāng)然也有不同的選擇方式。柱層析的選擇也可以從鹽濃度的連續(xù)性或緩沖體系的種類，以及上樣量、濃縮體積等方面考慮，尤其是中間采用了離心或超濾等技術(shù)時(shí)，這就需要進(jìn)行有機(jī)組合。

3.柱層析在重組蛋白純化中應(yīng)用

通常在進(jìn)行重組蛋白質(zhì)純化工藝設(shè)計(jì)之前，首先需要先對(duì)目的蛋白的性質(zhì)、純化體系和雜質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行了解。例如：對(duì)目的蛋白的分子量、pI值、疏水性、帶電性等特性進(jìn)行了解。還需對(duì)影響目的蛋白活性的因素進(jìn)行了解，如pH值、有機(jī)溶劑、鹽濃度、溫度、剪切力等，以保證純化后的蛋白活性。通過對(duì)這些性質(zhì)的了解，方可對(duì)純化工藝進(jìn)行設(shè)計(jì)。蛋白質(zhì)純化工藝設(shè)計(jì)的基本原則為：在達(dá)到目標(biāo)活性和純度的前提下，盡可能采取最少的工藝步驟，來獲得最大的回收率。但實(shí)際蛋白純化過程中，通常采用三步純化策略[13]（圖3），這三步分別是：

圖3 三步純化策略示意圖

（1）捕獲，通常是對(duì)目的蛋白進(jìn)行初步的純化，將與目的蛋白質(zhì)性質(zhì)差異很大的物質(zhì)去除掉，如細(xì)胞中的核酸等；另外，尤其重要的是將那些對(duì)目的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)去除掉，如各種蛋白酶，以達(dá)到富集濃縮、穩(wěn)定產(chǎn)物的目的。通常應(yīng)用的層析技術(shù)有離子HIC、IEX、AC等。

（2）中純，將那些分子大小、理化性質(zhì)與目的蛋白質(zhì)類似的雜質(zhì)去除掉，一般采用與捕獲時(shí)不同的層析技術(shù)，如HIC。

（3）精純，最終去除那些微量雜質(zhì)，達(dá)到產(chǎn)品的純度要求，通常使用GF層析技術(shù)，一般選擇高選擇性的層析介質(zhì)。

以畢赤酵母表達(dá)重組人白細(xì)胞介素11（rhIL-11）的純化生產(chǎn)工藝為例[14]，說明柱層析在重組蛋白生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用。IL-11的純化工藝路線為：發(fā)酵上清→超濾→SP陽離子交換層析→HP疏水作用層析→凝膠過濾。在整個(gè)純化工藝中，發(fā)酵上清經(jīng)超濾濃縮置換緩沖液后的樣品電導(dǎo)較低，正好能滿足離子交換的上樣要求；而經(jīng)離子交換層析洗脫的樣品，樣品中含有一定的鹽濃度，剛好能滿足疏水層析的上樣要求，可以直接進(jìn)行疏水層析上樣。而且這兩步都是吸附性層析，有較好的濃縮樣品的能力，經(jīng)過這兩步純化后的小體積樣品剛好適合于凝膠過濾層析。因此，整個(gè)純化組合相對(duì)比較合理，不需要額外的處理步驟，易于工業(yè)放大。純化工藝的總回收率在28%左右，產(chǎn)品的最終純度在98%以上。

此外，對(duì)于純化同種目的蛋白，采用不同的柱層析工藝也可達(dá)到相同的純化效果。同樣以特寶rhIL-11（特爾康）的純化生產(chǎn)工藝為例[15]：發(fā)酵上清→超濾→CS金屬螯合層析→酶切→SP陽離子交換層析→凝膠過濾。整個(gè)純化工藝的捕獲階段，通過金屬螯合層析的高選擇性、高分辨率、高載量，在純化初期就將大部分的雜質(zhì)去除與樣品濃縮，減少樣品體積。樣品經(jīng)過酶切，通過陽離子交換將其余雜質(zhì)去除，產(chǎn)品最終純度達(dá)到99%以上，總回收率在30%左右。

通過對(duì)以上兩種不同的純化工藝的對(duì)比，經(jīng)過對(duì)目的蛋白（IL-11）的檢驗(yàn)分析[14]，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是相同的。因此在進(jìn)行蛋白純化工藝的設(shè)計(jì)時(shí)，可根據(jù)自己現(xiàn)有的設(shè)備、材料以及實(shí)際需求來選擇合適的柱層析種類，從而降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

4.結(jié)語

柱層析技術(shù)是目前較為先進(jìn)和完善的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)，具有高分辨率、高收率、高純度、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，是目前蛋白質(zhì)產(chǎn)品分離純化的重要手段。為蛋白質(zhì)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化、工業(yè)化提供了重要保證。