＊柯 苗

（咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 陜西 712000）

維生素C即VC，在維持人體正常的生理機(jī)能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]，維生素C的穩(wěn)定性比較差，容易發(fā)生氧化分解反應(yīng)，對(duì)于抗壞血酸含量，可作為評(píng)估水果、蔬菜新鮮度的關(guān)鍵指標(biāo)[2]，由此可見，對(duì)各類食物中的維生素C含量進(jìn)行測(cè)定意義重大。對(duì)于維生素C測(cè)定方式，可劃分為化學(xué)法以及儀器法兩種類型，根據(jù)實(shí)踐研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)法的操作過程比較復(fù)雜，所需時(shí)間長，相對(duì)而言，采用儀器法測(cè)定維生素C速度快，檢測(cè)限比較低，優(yōu)勢(shì)顯著。因此，對(duì)維生素C儀器定量分析技術(shù)進(jìn)行深入研究迫在眉睫。

1.分光光度法

(1)紫外分光光度法

①常規(guī)紫外分光光度法

常規(guī)紫外分光光度法主要被應(yīng)用于維生素C片劑含量檢測(cè)中。在pH5～6溶液以及EDTA溶液中，維生素C的穩(wěn)定性比較強(qiáng)，乙酸—乙酸鈉緩沖液的pH值為6，因此，可將EDTA以及乙酸—乙酸鈉緩沖液作為溶劑[3]，在265.4nm位置對(duì)吸收度進(jìn)行檢測(cè)。在具體的測(cè)定過程中，要求繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇不同濃度的維生素C，與對(duì)照品溶液進(jìn)行對(duì)比，對(duì)吸收度進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)，對(duì)于維生素C濃度，需進(jìn)行線性回歸，在具體的測(cè)定過程中，需對(duì)維生素C濾液進(jìn)行稀釋處理，在相同條件下對(duì)吸收度進(jìn)行檢測(cè)，并代入至回歸方程中，即可計(jì)算出維生素C的含量[4]。

②三波長分光光度法

三波長分光光度法主要被應(yīng)用于藥品維生素C含量測(cè)定中。選擇三個(gè)波長，分別為λ1=261.8nm、λ2=214nm、λ3=292nm，在三個(gè)波長處理，使得干擾組的△A接近于“0”。在實(shí)際測(cè)定中，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，制備濃度不同的維生素C對(duì)照溶液，將60%乙醇作為溶劑，將其作為空白對(duì)照組，在λ1=261.8nm、λ2=214nm、λ3=292nm下對(duì)吸光度進(jìn)行檢測(cè)[5]，針對(duì)濃度C以及A，需進(jìn)行線性回歸。另外，還需對(duì)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于K1以及K3的平均值，可根據(jù)，進(jìn)行計(jì)算，并作為常數(shù)項(xiàng)，對(duì)常數(shù)B=(λ2-λ1)/(λ3-λ1)進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)算。在測(cè)樣過程中，對(duì)于測(cè)樣液的吸光度A1、A2以及A3，均需代入至B(K3-K1)]中，在計(jì)算出值后，再代入至維生素C回歸方程中，對(duì)待測(cè)組分含量進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)算[6]。

③導(dǎo)數(shù)光譜法

導(dǎo)數(shù)光譜法主要被應(yīng)用于微乳維生素C含量測(cè)定中。在該方法的實(shí)際應(yīng)用中，可對(duì)油包水（W/O）型微乳以及水包油（O/W）型微乳中的維生素C進(jìn)行檢測(cè)。在對(duì)W/O型微乳中的維生素C進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可采用三階導(dǎo)數(shù)法對(duì)W/O型溶液進(jìn)行掃描[7]，發(fā)現(xiàn)在270nm波長處吸收最大，但是在這一波長位置，降解產(chǎn)物沒有吸收，據(jù)此即可對(duì)維生素C含量進(jìn)行檢測(cè)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)備不同體積的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，并分別加入W/O型微乳NaHCO3、EDTA-2Na以及NaCl溶液中，在定容后，將氯仿、醋酸氯仿加入至離心管中發(fā)生結(jié)冰和融化反應(yīng)，并進(jìn)行離心處理，提取油相和乳化劑，另外，準(zhǔn)備空白微乳，其中沒有加入維生素C，再采用三階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行掃描，在270nm波長處，對(duì)峰高H進(jìn)行檢測(cè)，并制定回歸方程，據(jù)此確定樣品中的維生素C含量。在對(duì)O/W型微乳中的維生素C進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在284nm波長位置，O/W型溶液的微乳乳滴二階導(dǎo)數(shù)吸收為“0”。在具體的檢測(cè)過程中，首先準(zhǔn)備不同體積的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，再分別加入O/W型微乳、NaCl以及ED-TA-2Na，對(duì)于提取液，可選擇氯仿，據(jù)此進(jìn)行提純處理，采用二階導(dǎo)數(shù)法掃描[8]，對(duì)284nm處的峰高H進(jìn)行檢測(cè)，并制定回歸方程，據(jù)此確定樣品中的維生素C含量。

(2)可見分光光度法

①間接光度法

間接光度法主要被應(yīng)用于飲料維生素C含量測(cè)定中。在pH為5.0的乙酸—乙酸鈉緩沖溶液中，維生素C能夠與三價(jià)鐵以及二氮雜菲發(fā)生相互作用，進(jìn)而形成二價(jià)鐵一二氮雜菲絡(luò)合物[9]，該化合物為橘紅色，當(dāng)波長為510nm時(shí)吸收最大。在該方法的實(shí)際應(yīng)用中，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將草酸-乙酸作為溶劑，制備維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，維生素C標(biāo)準(zhǔn)液的體積有所不同，再分別加入顯色劑以及緩沖溶液，經(jīng)過稀釋處理后定容20min，在波長為510nm時(shí)比色，計(jì)算出回歸方程。在維生素C含量測(cè)定中，將已經(jīng)過稀釋處理的樣液作為空白組，選擇稀釋倍數(shù)相同的另一支，在顯色后對(duì)吸收度進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)量結(jié)果代入至回歸方程中，對(duì)維生素C含量進(jìn)行測(cè)定[10]。

②FIA差示光度法

當(dāng)溶液pH在2～6時(shí)，維生素C可與1,10-二氮雜菲Fe（III）混合液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并形成有色1,10-二氮雜菲-Fe（II），在波長510nm位置可形成最大吸收。在具體的檢測(cè)過程中，可采用蠕動(dòng)泵取載流液，準(zhǔn)備維生素C對(duì)照品以及0.005%的顯色劑，另一個(gè)通道可抽取濃度不同的維生素C對(duì)照品，采用三通充分混合，觀察顯色后，采用分光光度計(jì)比色，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制濃度繪制工作曲線，并根據(jù)回歸方程進(jìn)行計(jì)算[11]。

2.流動(dòng)注射分光光度法

流動(dòng)注射光度法主要被應(yīng)用于水果維生素C含量測(cè)定中，可顯著提升檢測(cè)速度，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果的靈敏度比較高，可顯著減少AA氧化損失。另外，還可應(yīng)用流動(dòng)注射反相合并帶技術(shù)[12]，將乙酸作為介質(zhì)，AA可與過量發(fā)生反應(yīng)，在350nm處檢出剩余的，流動(dòng)注射光度法的線性范圍在0～5.0×10-5mol/L之間，可被應(yīng)用于飲料以及片劑維生素C測(cè)定中，采樣頻率為70次/h，平均回收率高于98.7%。

3.旋光法

(1)直接旋光法

維生素C具有旋光性特征，首先配制5%碳酸氫鈉溶劑，并配制不同濃度的維生素C對(duì)照品溶液，將溶劑作為空白對(duì)照組，對(duì)各組旋光度進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行線性回歸計(jì)算分析[13]。

(2)差示旋光法

當(dāng)維生素C處于pH值不同的溶液中時(shí)，旋光度的差異比較大，片劑輔料旋光度穩(wěn)定性比較強(qiáng)，通過應(yīng)用差示旋光法，即可有效消除影響。首先制備2份體積適宜的維生素C對(duì)照品，采用乙酸液以及5%碳酸氫鈉溶液進(jìn)行稀釋和定容處理，將前者作為空白對(duì)照組，對(duì)后者的差示旋光度△α進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)濃度對(duì)差示旋光度進(jìn)行線性回歸計(jì)算分析。再采用上述方法，配制2份樣品液，并進(jìn)行過濾和稀釋處理，對(duì)差示旋光度進(jìn)行檢測(cè)[14]，將所得結(jié)果代入回歸方程中。

4.熒光法

熒光分析法的靈敏度比較高，當(dāng)紫外線照射至物體表面后，物體即處于激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子在去激發(fā)過程中，首先進(jìn)行碰撞，然后再反射，可產(chǎn)生特殊的熒光，其能夠反映出物質(zhì)的特性。還原型維生素C在發(fā)生活性炭氧化反應(yīng)后，即可轉(zhuǎn)變?yōu)槊摎渚S生素C，另外，其還能夠與鄰苯二胺發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而形成喹喔啉[15]，如圖1所示，在一定條件下，喹喔啉的熒光強(qiáng)度與維生素C濃度之間為正比關(guān)系，據(jù)此即可對(duì)維生素C含量進(jìn)行測(cè)定。該檢測(cè)方法的操作方式便捷，靈敏度比較高，回收率在97.60%～101.02%之間。

圖1 還原型維生素C、鄰苯二胺反應(yīng)方程式

5.高效液相色譜法

高效液相色譜法主要被應(yīng)用于藥品維生素C測(cè)定中。維生素C的化學(xué)鍵具有極性特性，對(duì)樣品進(jìn)行洗脫分離處理，避免受到輔料的干擾。將偏磷酸作為溶劑，配制形成多種濃度的維生素C對(duì)照品溶液，設(shè)定三種條件，包括Alltima C12色譜柱、磷酸二氫鉀一乙腈流動(dòng)相、紫外243nm色譜，分別對(duì)峰面積進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)測(cè)定所得結(jié)果繪制曲線。先取樣品，然后再采用偏磷酸進(jìn)行提純和稀釋處理[16]，在色譜條件相同時(shí)，對(duì)峰面積進(jìn)行檢測(cè)，并代入至回歸方程中，對(duì)維生素C含量進(jìn)行檢測(cè)。該方法的平均回收率為102.05%，而RSD為2.0%。

6.薄層掃描法

薄層掃描法主要被應(yīng)用于維生素C片劑測(cè)定中。維生素C具有還原性特征，在藍(lán)色染料2,6-二氯靛酚鈉中加入維生素C，可將前者還原為酚亞胺。采用pH為3.5的檸檬酸-氫氧化鈉緩沖液，配制形成濃度不同的維生素C對(duì)照品溶液，采用2,6-二氯靛酚鈉的乙醇液對(duì)層析試紙進(jìn)行著色處理，運(yùn)用定量毛細(xì)管吸取部分溶液，滴入至層析試紙上[17]，將層析試紙充分晾干，并固定在玻璃板上，放置在薄層掃描儀中，在波長290nm以及420m處進(jìn)行掃描，對(duì)峰面積進(jìn)行檢測(cè)，并繪制曲線，根據(jù)回歸方程進(jìn)行計(jì)算。薄層掃描法的平均回收率為99.9%。

7.電化學(xué)法

(1)庫侖滴定法

電解電極反應(yīng)，即可形成I2，當(dāng)處于特定條件時(shí)，I2可發(fā)生氧化反應(yīng)，進(jìn)而形成維生素C，對(duì)維生素C進(jìn)行定量分析。在具體的檢測(cè)過程中，需應(yīng)用通用庫侖儀，首先預(yù)熱20min，再將電解液加入至電解杯中，啟動(dòng)攪拌機(jī)，將儀器調(diào)整至“電流上升”檔，將電解電流設(shè)定為10mA，將極化電位設(shè)定為150mV。取濃度為0.2%的維生素C溶液1.00ml，將其加入至電解池中[18]，啟動(dòng)機(jī)械設(shè)備，開始電解反應(yīng)，隨后，儀器即可對(duì)電解的庫侖數(shù)進(jìn)行自動(dòng)化記錄。

(2)交流示波極譜滴定法

K3[Fe(CN)6]具有氧化特性，選用鹽酸介質(zhì)，采用標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定維生素C，微鉑—鉑片電極上K3[Fe(CN)6]的示波切口出現(xiàn)指示終點(diǎn)。在具體的檢測(cè)過程中，首先稱取4.00ml試樣，其中維生素C含量在10mg以上，并加入至50ml燒杯中，再將20ml的0.5mol/L HC1溶液加入其中，插入電機(jī)，以恒定速度進(jìn)行電磁攪拌處理，采用K3[Fe(CN)6]標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行滴定處理，使得至示波圖形發(fā)生突變，并且正好出現(xiàn)切口的指示終點(diǎn)[19]。對(duì)于維生素C含量，可根據(jù)以下公式計(jì)算：m=CVM/2。式中，m指的是樣品中維生素C的質(zhì)量，單位為mg；C為K3[Fe(CN)6]標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，單位為mol/L；V為樣品測(cè)定過程中所消耗的K3[Fe(CN)6]標(biāo)準(zhǔn)液體積，單位為ml；M為維生素C的摩爾質(zhì)量，單位為g/mol。在交流示波極譜滴定法的實(shí)際應(yīng)用中，平均回收率為98.47%，而RSD則為0.58%。

(3)Ce4+/Ce3-緩沖溶液流動(dòng)注射檢測(cè)法

在該檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用中，可將Ce4+/Ce3-氧化還原體系作為緩沖溶液，在具體的檢測(cè)過程中，將樣品注射于以0.1mol/L K2SO4作支持電解質(zhì)的Ce4+/Ce3-緩沖溶液試劑流[20]，維生素C能夠與Ce4+發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而形成氧化還原電，通過對(duì)電勢(shì)的變化情況進(jìn)行分析，即可確定維生素C含量。在Ce4+/Ce3-緩沖溶液流動(dòng)注射檢測(cè)法的實(shí)際應(yīng)用中，回收率為97%～101%之間，而RSD為0.36%。

8.結(jié)語

綜上所述，本文主要對(duì)維生素C的多種儀器定量分析方式進(jìn)行了詳細(xì)探究。在各類維生素C儀器定量分析方法中，分光光度法的操作方式便捷，旋光法以及差示旋光法的穩(wěn)定性比較高，但是容易受到溫度條件的影響，高效液相色譜法的靈敏度比較高，但是對(duì)于測(cè)定條件的要求比較高。電化學(xué)法的操作方式便捷，但是樣品處理難度比較大，薄層掃描法的抗干擾能力強(qiáng)，熒光法的靈敏度比較高，但是需采用另外一種物質(zhì)組成發(fā)光體系。由此可見，不同維生素C儀器定量分析法均有一定的優(yōu)勢(shì)和不足，要求根據(jù)實(shí)際情況選擇適宜的測(cè)定技術(shù)，同時(shí)強(qiáng)化測(cè)定技術(shù)研究創(chuàng)新。