＊惠大永 袁紅芹 黨珍 梁帆 趙偉靜 李煒*

（1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院 陜西 712046 2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司 陜西 712000）

引言

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的疾病之一，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)作性感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、行為及自主神經(jīng)等出現(xiàn)不同程度的障礙，嚴(yán)重威脅人類的健康及患者的生活質(zhì)量。拉考沙胺（Lacosamide），是由德國(guó)Schwarz BioSciences公司（優(yōu)時(shí)比子公司）研發(fā)的一種新型N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體甘氨酸位點(diǎn)拮抗劑[1]，它可以選擇性促進(jìn)鈉通道緩慢失活并調(diào)節(jié)腦衰蛋白介導(dǎo)調(diào)控蛋白2（collapsinresponsemediatorprotein-2，CRMP-2）。這種作用機(jī)制是穩(wěn)定神經(jīng)元細(xì)胞膜的過(guò)度興奮，抑制神經(jīng)元過(guò)度放電，減少長(zhǎng)時(shí)程通道的有效性，而不影響生理功能，是新一類治療有關(guān)癲癇和神經(jīng)性疼痛的藥物，用于輔助治療4歲及以上癲癇患者部分性發(fā)作的聯(lián)合治療[2-4]。

拉考沙胺（Lacosamide，LCM）作為一種第三代新型AEDs，于2008年由美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)，用于成人和青少年局灶性癲癇伴或不伴繼發(fā)全面發(fā)作的輔助治療[5]。隨后，2014年和2016年相繼被FDA和EMA批準(zhǔn)用于局灶性癲癇的單藥治療2017年，歐盟和美國(guó)將上述適應(yīng)證推廣延伸到4歲以上兒童。2018年，我國(guó)首次批準(zhǔn)其作為輔助治療應(yīng)用于成人和青少年（年齡≥16歲）的局灶性癲癇患者[6]。

在仿制藥的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，原料藥的粒度是影響制劑生物利用度、穩(wěn)定性等性能的重要技術(shù)指標(biāo)，也會(huì)對(duì)制劑過(guò)程中物料流動(dòng)性、混合均勻性以及可壓性等一系列的生產(chǎn)性能產(chǎn)生影響，最終也會(huì)對(duì)制劑安全性、有效性和質(zhì)量穩(wěn)定性造成影響，是原料藥的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)之一[7]。常用的粒度測(cè)定方法有篩分法、顯微鏡法、光散射法和顯微圖像法等[8-9]。其中，光散射法是利用單色光束通過(guò)某種介質(zhì)后，光線發(fā)生散射現(xiàn)象的原理，散射光的能量分布與介質(zhì)中的粒子大小有關(guān)。通過(guò)檢測(cè)散射光的能量分布，依據(jù)米氏散射理論和弗朗霍夫近似理論，計(jì)算出粒子的粒度分布。采用激光粒度分析儀檢測(cè)粒徑方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、可測(cè)粒徑范圍寬，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于原料藥粒徑測(cè)定[10-16]。目前，未見(jiàn)光散射法測(cè)定拉考沙胺粒度的報(bào)告，本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)[17-22]，經(jīng)過(guò)以下一系列試驗(yàn)，建立激光散射法測(cè)定拉考沙胺原料粒徑，并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行研究及驗(yàn)證，用于藥品研發(fā)生產(chǎn)中原料粒徑控制的方法，具有一定的理論意義，在后續(xù)拉考沙胺仿制藥的研發(fā)中，起到借鑒作用，同時(shí)具有了現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

1.儀器與試藥

(1)儀器

Mastersizer（馬爾文）3000激光粒度分析儀；AERO S干法進(jìn)樣器（英國(guó)Malvern公司）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集和分析采用 Mastersizer（馬爾文）3000工作站。

(2)試藥

拉考沙胺原料藥（批號(hào)：8KV-102-2000001、8KV-102-2000002、8KV-102-2000003，北京海步醫(yī)藥科技股份有限公司，含量＞99.0）。

2.方法和結(jié)果

(1)檢測(cè)參數(shù)設(shè)置

分析模式：通用；測(cè)試方法：干法；文丘里管（類型）：高能文丘里管；分散介質(zhì)折光率：1.00；折射率：1.52；吸收率：0.01；平行檢測(cè)樣品（份）：6；樣品檢測(cè)持續(xù)時(shí)間：10s；背景時(shí)間：10s；分散壓力：3.0Bar；進(jìn)樣速度：50%；狹縫寬度：1.5mm；遮光度：1.0%～4.0%。

(2)樣品測(cè)定

將樣品混合均勻，取約0.5g供試品放入干法進(jìn)樣器樣品盤。按照2.1設(shè)置儀器參數(shù)，測(cè)定，見(jiàn)圖1。

圖1 拉考沙胺原料藥粒度分布圖Fig.1 Particle size distribution pattern of lacosamide active pharmaceutical ingredient

(3)評(píng)價(jià)指標(biāo)

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）：取拉考沙胺原料藥，平行測(cè)定6次，D50的RSD不超過(guò)3%，D10和D90的RSD不超過(guò)5%。

殘值：表征測(cè)量結(jié)果和理論值的擬合值，殘值小測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，加權(quán)殘差值不超過(guò)1%。

(4)光學(xué)參數(shù)考察

①分散介質(zhì)折光率

分散介質(zhì)為壓縮空氣，空氣的折光率為1.00。

②樣品吸收率考察

取拉考沙胺原料藥（批號(hào)：8KV-102-2000001），按照2.1項(xiàng)設(shè)定儀器初始參數(shù)，考察樣品吸收率分別為0、0.001、0.01、0.1和1時(shí)的粒度分布，計(jì)算D10、D50、D90及加權(quán)殘差的平均值，結(jié)果見(jiàn)表1。拉考沙胺樣品吸光率對(duì)測(cè)定結(jié)果的RSD值和加權(quán)殘差值均有影響，吸光率設(shè)為0.01時(shí)RSD和加權(quán)殘差均符合要求。

表1 不同吸光度的粒度檢測(cè)結(jié)果（n=6）Tab.1 Determination results of particle sizes with different absorbency

③樣品折射率考察

取拉考沙胺原料藥（批號(hào)：8KV-102-2000001），考察樣品折射率分別為1.32、1.42、1.52、1.62和1.72時(shí)的粒度分布，其余參數(shù)按照2.1項(xiàng)設(shè)定，計(jì)算D10、D50、D90及加權(quán)殘差的平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。折射率為1.52時(shí)，擬合的殘差最小，因此確定樣品的折射率為1.52。

表2 不同折光率的粒度檢測(cè)結(jié)果（n=6）Tab.2 Determination results of particle sizes with different refractive index

(5)分散壓力考察

取拉考沙胺原料藥（批號(hào)：8KV-102-2000001），考察分散壓力分別為1.0Bar、2.0Bar、3.0Bar、4.0Bar時(shí)粒徑分布，其余參數(shù)按照2.1項(xiàng)設(shè)定，計(jì)算D10、D50、D90及加權(quán)殘差的平均值，結(jié)果見(jiàn)表3。分散壓力在3.0Bar和4.0Bar，測(cè)定結(jié)果RSD和加權(quán)殘差均符合標(biāo)準(zhǔn)，考慮4.0Bar接近壓力上限，故選擇3.0Bar為分散壓力。

表3 不同分散壓力的粒徑檢測(cè)結(jié)果（n=6）Tab.3 Determination results of particle sizes with different air press

(6)樣品測(cè)量時(shí)間和背景測(cè)量時(shí)間

取拉考沙胺原料藥（批號(hào)：8KV-102-2000001），考察背景測(cè)量時(shí)間（同樣品測(cè)量時(shí)間）8s、10s和12s時(shí)粒徑粒徑分布，其余參數(shù)按照2.1項(xiàng)設(shè)定，計(jì)算D10、D50、D90及加權(quán)殘差的平均值，見(jiàn)表4。結(jié)果測(cè)量時(shí)間和背景時(shí)間為10s時(shí)，加權(quán)殘差最小，因此確定樣品的測(cè)量時(shí)間和背景時(shí)間為10s。

表4 不同測(cè)定時(shí)間的粒徑檢測(cè)結(jié)果（n=3）Tab.4 Determination results of particle sizes with different determination time

(7)進(jìn)樣速度考察

取拉考沙胺原料藥（批號(hào)：8KV-102-2000001），考察進(jìn)樣速度為40%、50%、60%時(shí)粒徑分布，其余參數(shù)按照2.1項(xiàng)設(shè)定，計(jì)算D10、D50、D90及加權(quán)殘差的平均值，見(jiàn)表5。結(jié)果以50%時(shí)RSD和平均加權(quán)殘差最小，因此確定進(jìn)樣速度為50%。

表5 不同進(jìn)樣速度的粒徑檢測(cè)結(jié)果（n=6）Tab.5 Determination results of particle sizes with different feed rate

(8)料斗間隙考察

取拉考沙胺原料藥（批號(hào)：8KV-102-2000001），考察料斗間隙分別1.0mm、1.2mm、1.5mm、1.7mm和2.0mm時(shí)粒徑測(cè)定粒徑分布，其余按2.1項(xiàng)設(shè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。料斗間隙為1.2mm、1.5mm時(shí)RSD和平均加權(quán)殘差均符合要求，以1.5mm時(shí)最優(yōu)。

表6 不同料斗間隙的粒徑檢測(cè)結(jié)果（n=6）Tab.6 Determination results of particle sizes with different hopper clearance

(9)不同遮光度考察

取拉考沙胺原料藥（批號(hào)：8KV-102-2000001），考察遮光度分別0.5%～1.0%、1.0%～2.0%、2.0%～4.0%、4.0%～6.0%時(shí)測(cè)定粒徑分布，其余按2.1項(xiàng)設(shè)定，見(jiàn)表6。結(jié)果表明，遮光度控制在1.0%～4.0%時(shí)均符合要求。

表7 不同遮光度的粒徑檢測(cè)結(jié)果（n=6）Tab.7 Determination results of particle sizes with different opacity

(10)精密度試驗(yàn)

取拉考沙胺原料藥樣品（批號(hào)：8KV-102-2000001），由分析人員1按照確定的儀器參數(shù)測(cè)定，平行測(cè)定6份，統(tǒng)計(jì)6份樣品的D10、D50、D90的平均值及RSD；由分析人員2按上述樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表8。分析人員1、分析人員2各6份樣品測(cè)定結(jié)果RSD表明，方法重現(xiàn)性良好，2名分析人員12份樣品測(cè)定結(jié)果RSD表明，方法中間精密度良好。

表8 精密度考察結(jié)果（n=6）Tab.8 Results of method precision test

(11)不同批次樣品粒度檢測(cè)

按2.1項(xiàng)儀器參數(shù)，測(cè)定3批拉考沙胺原料藥粒度分布，計(jì)算各批次樣品的D10、D50和D90的平均值及RSD，各批原料藥粒徑分布測(cè)定結(jié)果的RSD均符合要求，詳見(jiàn)表9。

表9 原料藥粒徑檢測(cè)結(jié)果Tab.9 Results of API particle size

3.討論

(1)干法與濕法選擇

Mastersize 3000型激光粒度分析儀可應(yīng)用濕法和干法測(cè)試原料藥的粒徑。固體制劑中，干法測(cè)定其粒度比濕法更具有代表性，且干法測(cè)定比濕法測(cè)定更簡(jiǎn)捷、快速，可以在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定更多的樣品，是粒徑測(cè)定的首選。但是，并不是每個(gè)樣品都適合用干法測(cè)定，非常細(xì)（粒徑非常?。┗蛘哂姓承缘臉悠房赡芨m合于濕法測(cè)量，因?yàn)榭赡苄枰砻婊钚詣┗蛘咂渌稚﹣?lái)實(shí)現(xiàn)樣品完全和可重現(xiàn)的分散。另外，由于干法的分散機(jī)制更具有破壞性，所以可能不適合極易破碎的樣品。盡管可以使用干法測(cè)定樣品量非常少的樣品，但通常使用濕法測(cè)定以獲得更好的結(jié)果重現(xiàn)性。本文對(duì)干法測(cè)定中容易出現(xiàn)的問(wèn)題，均進(jìn)行了考察，保證方法的適用性。

(2)文丘里管選擇

文氏里管利用了干法分散的機(jī)理，由剪切力引起的速度梯度和粒子—粒子之間的碰撞，對(duì)于大多數(shù)物料來(lái)說(shuō)，這兩種機(jī)制足以分散樣品。然而，一些高度團(tuán)聚和堅(jiān)固的樣品可能需要額外的更高的能量分散機(jī)制的粒子間壁碰撞，標(biāo)準(zhǔn)文氏管適用于絕大多數(shù)樣品，因此這將是開(kāi)發(fā)干法測(cè)定的起點(diǎn)。但是，如果對(duì)于堅(jiān)固的材料不能實(shí)現(xiàn)完全的分散，那么可能需要使用所有三種分散機(jī)理的Aero的高文氏管。顯微鏡下觀察，拉考沙胺原料為棒狀結(jié)晶，并有一定的聚團(tuán)性，樣品粉碎過(guò)篩后，采用標(biāo)準(zhǔn)文氏管測(cè)定，測(cè)定結(jié)果仍有少量異常大粒徑顆粒，后改用Aero S高能文丘里管，結(jié)果粒徑分布接近正態(tài)分布，方法重現(xiàn)性良好。

(3)干法測(cè)量的關(guān)鍵因素

研究過(guò)程中對(duì)影響干法測(cè)量的關(guān)鍵因素分散壓力、進(jìn)樣速度、樣品量和測(cè)定時(shí)間等，均進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，保證測(cè)量結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。合適的分散壓力可使樣品顆粒既保持原始狀態(tài)，不被破壞，又能處于良好的分散狀態(tài)，使測(cè)量時(shí)獲得可重現(xiàn)的結(jié)果；控制進(jìn)樣速度，可以使通過(guò)文丘里管進(jìn)入測(cè)量單元樣品，在大部分測(cè)量持續(xù)時(shí)間內(nèi)的遮光度保持合適的范圍；不合適測(cè)量時(shí)間，可能形成二次進(jìn)樣的結(jié)果，樣品在盤上振動(dòng)時(shí)，可能會(huì)分離，較大的、流動(dòng)性更好的顆粒可能會(huì)在更細(xì)的粘性較大的顆粒之前到達(dá)測(cè)量單元，剩余樣品可能成為另一個(gè)進(jìn)樣步驟。

(4)測(cè)試方法篩選

曾試驗(yàn)用微孔篩分法進(jìn)行測(cè)定，取本5g，置篩分儀微孔篩上（20μm）、下層微孔篩為50μm，振幅7、振速3000/min、時(shí)間15min。取不能通過(guò)大孔徑篩和能通過(guò)小孔徑篩的粉末，稱定質(zhì)量，計(jì)算其所占比例（%），與激光粒度法篩分圖中給出的范圍內(nèi)體積（%）進(jìn)行比較。由于拉考沙胺粒徑較小，測(cè)量誤差大，通常達(dá)到10%～20%。小顆粒由于團(tuán)聚作用，樣品粘篩，通過(guò)篩孔困難，而且有人為誤差，導(dǎo)致可信度下降。