宛鑫，李得堂，張麗娟，易美容，祝赫，何嘉侖，陳潔，唐洪梅，丘振文（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣州 510405；.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，廣州 510405；.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，廣州 510405）

中藥復方制劑的開發(fā)大多源于長期臨床實踐中積累的驗方和經典名方，具有較強的臨床優(yōu)勢及中醫(yī)特色，其開發(fā)過程也遵循“臨床-實驗-回歸臨床”的規(guī)律[1-2]。健脾益肺鼻炎方為本課題組臨床專家應用了10多年的臨床驗方，主要用于肺氣虛寒型變應性鼻炎疾病的治療。該方由黃芪、白術、防風、干姜、桂枝等8味中藥組成，是在玉屏風散、桂枝湯、黃芪桂枝五物湯、辛夷散等經典名方基礎上，經多年臨床實踐，不斷加減化裁而成，具有健脾益肺、散寒通竅、益衛(wèi)固表的功效。臨床研究表明，健脾益肺鼻炎方治療肺氣虛寒型變應性鼻炎具有可靠的臨床療效，長期服用可顯著改善患者流涕、鼻塞、鼻癢和打噴嚏等癥狀，減輕鼻部炎癥反應，降低患者復發(fā)率[3]。藥理實驗表明，方中君藥黃芪的有效成分黃芪多糖可通過抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3、核轉錄因子κB和胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）等炎癥因子的表達，顯著改善卵清蛋白誘導的變應性鼻炎模型大鼠的黏膜炎癥反應[4-5]。為深入研究健脾益肺鼻炎方發(fā)揮療效的物質基礎，本研究以復方水煎液為模式標準，參照標準湯劑制備原則和《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》制備原則[6]，擬建立其標準湯劑的特征圖譜，篩選影響其質量的主要指標成分，并對其進行含量測定，旨在為該方標準湯劑的質量控制和進一步開發(fā)提供物質基準。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260型HPLC儀（美國Agilent公司）、MS-105DN型十萬分之一分析天平（瑞士Metter Toledo公司）、TG16-WS型臺式高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）、KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

升麻素苷對照品（批號RFS-S00411804028）、升麻素對照品（批號S-007-180427）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（批號J-002-180731）、亥茅酚苷對照品（批號H-027-180426）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號M-020-190219）、毛蕊異黃酮對照品（批號M-021-180926）、芒柄花素對照品（批號C-018-181216）、木蘭脂素對照品（批號RFS-M03111808031）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均大于97%；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為蒸餾水。

黃芪、白術等8種中藥飲片均購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，由該院藥學部李得堂副主任中藥師鑒定均為真品。10批健脾益肺鼻炎方中8種中藥飲片的來源信息見表1。

表1 10批健脾益肺鼻炎方中8種中藥飲片來源信息

2 方法與結果

2.1 HPLC特征圖譜的建立

2.1.1 標準湯劑的制備 取健脾益肺鼻炎方全方飲片（黃芪、麩炒白術、防風、桂枝、干姜、桔梗、辛夷、白芷各適量），以10倍量水（mL/g）浸泡30 min，先武火煮沸后文火煎煮60 min，濾過；藥渣加入8倍量水（mL/g），先武火煮沸后文火煎煮40 min，過濾；合并2次濾液，小火濃縮至300 mL，即得標準湯劑，冷凍備用[6]。

2.1.2 供試品溶液的制備 吸取“2.1.1”項下標準湯劑適量，以4 000 r/min離心20 min，精密量取上清液2 mL，加甲醇定容至10 mL，搖勻，以4 000 r/min離心10 min，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 取升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素和木蘭脂素對照品各適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成上述各對照品質量濃度分別為21.3、15.6、16.0、19.5、20.3、15.5、13.9、17.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 色譜條件色譜柱為YMC Hydrosphere C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，15%A；10～28 min，15%A→23%A；28～36 min，23%A→31%A；36～41 min，31%A→32%A；41～46 min，32%A→40%A；46～52 min，40%A→47%A；52～62 min，47%A→60%A；62～70 min，60%A→75%A）；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為230 nm；進樣量為10 μL。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S1），按“2.1.4”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以6號峰為參照峰（該峰分離度較好），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD均小于4.00%（n＝6），相對保留時間的RSD均小于1.00%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.4”項下色譜條件進樣測定，以6號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD均小于4.00%（n＝6），相對保留時間的RSD均小于1.00%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 取“2.1.1”項下標準湯劑（編號S1），按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1.4”項下色譜條件進樣測定，以6號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD均小于4.00%（n＝6），相對保留時間的RSD均小于1.00%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.8 特征圖譜的建立及共有峰的指認 分別精密吸取10批次健脾益肺鼻炎方標準湯劑，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下色譜條件進樣測定。將所得的10批標準湯劑的HPLC色譜圖以“AIA”格式文件導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版）》進行分析，以S7樣品的HPLC色譜圖為參照圖譜（該批樣品色譜峰分離度較好），6號峰為參照峰，采用中位數(shù)法生成10批樣品的疊加特征圖譜和對照特征圖譜（R）。結果，10批健脾益肺鼻炎方標準湯劑共標定出24個共有特征峰（圖1）。經與“2.1.3”項下混合對照品的色譜圖比對，共指認了8個特征峰，分別是升麻素苷（2號峰）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（4號峰）、升麻素（5號峰）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（6號峰）、亥茅酚苷（12號峰）、毛蕊異黃酮（15號峰）、芒柄花素（19號峰）和木蘭脂素（21號峰）。結果見圖2。

圖1 10批健脾益肺鼻炎方標準湯劑的HPLC疊加特征圖譜與對照特征圖譜（R）

圖2 混合對照品溶液和健脾益肺鼻炎方標準湯劑供試品溶液的HPLC圖

2.1.9 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版）》對10批健脾益肺鼻炎方標準湯劑進行相似度評價。結果顯示，10批樣品的相似度分別為0.993、0.968、0.991、0.981、0.994、0.995、0.991、0.989、0.993、0.997，相似度均大于0.960，表明10批次樣品相似度較高，化學組分大致相同，質量相對穩(wěn)定。

2.2 化學計量法分析

2.2.1 聚類分析 將10批健脾益肺鼻炎方標準湯劑的24個共有特征峰峰面積量化處理，用SPSS 26.0軟件分析，采用瓦爾德聯(lián)接方法，數(shù)據(jù)以平方歐氏距離為測距，進行聚類分析（cluster analysis，CA）。結果見圖3。結果顯示，當平方歐氏距離為10時，10批樣品聚為3類，S1、S2和S10聚為一類，S3～S7聚為一類，S8、S9聚為一類。

圖3 10批樣品CA樹狀圖

2.2.2 主成分分析 以24個共有特征峰峰面積為初始數(shù)據(jù)，用SPSS 26.0進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。以特征值＞1為提取標準，共確定出4個主成分，累計方差貢獻率為87.509%，表明這4個主成分對健脾益肺鼻炎方標準湯劑質量評價具有良好的代表性。結果見表2（表中僅展示前4個主成分的相關數(shù)據(jù)）。以24個共有特征峰峰面積為變量，導入SIMCA 14.1軟件進行PCA，結果見圖4。結果顯示，10批次樣品可聚為3類，與CA結果一致。

表2 PCA的特征值和方差貢獻率

圖4 10批樣品的PCA圖

2.2.3 正交偏最小二乘法-判別分析 采用SIMCA 14.1軟件對10批健脾益肺鼻炎方標準湯劑的24個共有特征峰峰面積進行正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。結果顯示，其模型解釋率參數(shù)R2X、R2Y和預測能力參數(shù)Q2分別為0.962、0.996、0.649，均大于0.5，說明該模型具有較好的擬合能力及預測能力[7]。以變量重要性投影（variable important in projection，VIP）值＞1.5作為篩選標準確定影響樣品的差異變量（變量VIP值越高，對組間差異的影響越大），結果見圖5。由圖5可見，共有3個共有特征峰的VIP值＞1.5，依次為升麻素苷（2號峰）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（4號峰）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（6號峰），表明這3個成分可能是影響健脾益肺鼻炎方標準湯劑質量差異的主要化學成分。

圖5 24個共有特征峰OPLS-DA的VIP值圖

2.3 含量測定

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.1.3”項下混合對照品溶液0.5、1、2、4、8、10 μL，按“2.1.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分峰面積為縱坐標（Y）、進樣量為橫坐標（X）進行線性回歸。結果，各成分在各自線性范圍內線性關系良好，詳見表3。

表3 各成分線性回歸方程和線性范圍

2.3.2 精密度試驗 精密量取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S1），按“2.1.4”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積RSD分別為0.17%、0.38%、0.36%、0.13%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密量取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為0.21%、1.34%、1.00%、0.18%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復性試驗 精密量取“2.1.1”項下健脾益肺鼻炎方標準湯劑（編號S1），按“2.1.2”項下條件平行制備6份供試品溶液，再按“2.1.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用外標法計算樣品含量。結果顯示，升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的RSD分別為0.17%、0.38%、0.36%、0.13%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品各適量，分別加甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度為163、107、103、120 μg/mL的對照品溶液。精密量取健脾益肺鼻炎方標準湯劑（編號S5）1 mL，共6份，按質量比1∶1精密加入各對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，4種成分的平均加樣回收率分別為105.98%、98.06%、96.38%、104.17%，RSD分別為1.75%、3.87%、4.03%、1.27%，表明方法準確度良好，結果見表4。

表4 4種成分加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.3.6 樣品含量測定 精密量取10批次健脾益肺鼻炎方標準湯劑，按“2.1.2”項下方法制備10批供試品溶液，再按“2.1.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。每個樣品平行測定3次，取平均值。結果見表5。

表5 4種成分的含量測定結果（n＝3，μg/mL）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本研究在建立特征圖譜時，分別考察了Agilent ZORBAX Eclipes Plus C18、YMC Hydrosphere C18、Kromasil C183種色譜柱，結果發(fā)現(xiàn)YMC Hydrosphere C18分離效果最好，出峰多且峰形較佳。又分別考察了甲醇-水、乙腈-水為流動相時的分離效果，結果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水為流動相時色譜峰分離效果較優(yōu)。為改善峰形及基線，分別考察了不同體積分數(shù)的磷酸溶液（0.02%、0.05%、0.1%），結果表明，0.05%磷酸溶液可較好地改善峰形和分離度，且色譜峰基線平穩(wěn)。因此，選擇乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動相。又分別對不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）進行了考察，結果表明，在1.0 mL/min的流速下，色譜峰之間的分離度更優(yōu)。本研究還考察了200～400 nm波長范圍內的色譜峰效果，結果發(fā)現(xiàn)在230 nm下，各峰之間分離度較好，吸收峰多且基線平穩(wěn)，故選擇230 nm作為檢測波長。

3.2 健脾益肺鼻炎方標準湯劑特征圖譜的建立及定量指標的選擇

中藥復方標準湯劑為中醫(yī)臨床用藥的主要形式，其作為一種標準物質和標準體系，可保障臨床藥效和質量的一致性[8-9]。本研究收集了臨床在用的10批處方飲片，以復方標準水煎液為模式標準，建立了化學特征圖譜和對照標準色譜圖，共確定了24個共有特征峰，相似度均大于0.960。通過與對照品比對，共指認出8個色譜峰?；瘜W計量法CA、PCA和OPLS-DA評價結果顯示，10批樣品可分為3類，S1、S2和S10聚為一類，S3～S7聚為一類，S8、S9聚為一類；VIP值＞1.5的色譜峰主要有3個，依次為升麻素苷（2號峰）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（4號峰）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（6號峰），推測以上3個成分可能是影響樣品質量差異的主要化學成分。

上述分析中，升麻素雖不是影響健脾益肺鼻炎方標準湯劑質量的重要差異成分，但多種研究表明，升麻素具有較強的抗炎作用[10-11]，可通過調節(jié)上皮細胞間的緊密連接，降低相關炎癥因子TSLP和白介素33的表達，顯著抑制異硫氰酸熒光素誘導的小鼠過敏性皮炎[12]。因此，筆者建議可將升麻素也作為健脾益肺鼻炎方標準湯劑質量控制的指標成分，即將升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素4種成分共同作為HPLC的含量測定指標。含量測定結果顯示，4種成分的含量分別為 12.12～18.87、3.86～6.40、3.10～4.27、11.17～15.79 μg/mL，各批次成分含量測定具有一定的差異，可能與藥材采收時間、采收地點、產地加工方式等多種因素有關，再次表明對該方標準湯劑建立全面規(guī)范的質量控制體系具有必要性。

綜上所述，本研究建立的HPLC特征圖譜方法穩(wěn)定可行，可用于健脾益肺鼻炎方的質量控制；升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷可作為該方標準湯劑質量控制的指標成分。