龔偉偉，羅光明，秦倩，曾金祥，徐蔥蘢，劉明貴，張壽文#（.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004；.江西景德中藥股份有限公司，江西九江 33000）

傘形科植物茶芎Ligusticum sinenseOliv.cv.Chaxiong為一年生草本植物，以根莖入藥，主產(chǎn)于我國(guó)江西武寧、瑞昌、德安等地。據(jù)《江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》記載，茶芎味辛、性溫，歸肝、心經(jīng)，有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效，可用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、閉經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻腹痛、胸脅刺痛、頭痛、風(fēng)濕痹痛等[1]。現(xiàn)代研究表明，茶芎主要含有苯酞類、有機(jī)酸類、多糖類、氨基酸類和揮發(fā)油等成分。其中，苯酞類物質(zhì)包括洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯等，均有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，尤以藁本內(nèi)酯的作用最為顯著；有機(jī)酸類物質(zhì)包括綠原酸、阿魏酸等，綠原酸可調(diào)節(jié)機(jī)體物質(zhì)代謝、降低膽固醇，還具有抗氧化、抗菌作用，阿魏酸有抗血栓形成、促進(jìn)血管舒張、延緩動(dòng)脈粥樣硬化的作用[2-6]?？梢?jiàn)，上述成分可能是茶芎的活性成分。

目前，關(guān)于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制研究多集中于單一或少數(shù)成分的定量分析，難以全面、客觀地對(duì)藥材進(jìn)行評(píng)價(jià)，因此需要建立全面、有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。中藥指紋圖譜能快速反映其化學(xué)成分信息，定性判斷其真實(shí)性；多元統(tǒng)計(jì)分析[聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）]可對(duì)已有的化學(xué)成分信息進(jìn)行定量評(píng)價(jià)[7-10]?？梢?jiàn)，中藥指紋圖譜與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合，可全面、有效地對(duì)藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制?；诖?，本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法建立12批茶芎藥材的指紋圖譜并進(jìn)行相似度分析；同時(shí)，擬采用CA、PCA、OPLS-DA法對(duì)所得圖譜信息進(jìn)行分析，篩選影響藥材質(zhì)量的差異性成分并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，旨在為全面進(jìn)行茶芎質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本文所用主要儀器包括LC-20AT型HPLC儀（日本Shimadzu公司）、LT-DHC160型高速離心機(jī)[立德泰勀（上海）科學(xué)儀器有限公司]、KQ-200KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、MS205DU型電子分析天平[梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

E-藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)Z812557，純度≥98%）購(gòu)自上?？锟萍加邢薰?；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)327-97-9，純度≥98%）、阿魏酸松柏酯對(duì)照品（批號(hào)63644-62-2，純度≥98%）、洋川芎內(nèi)酯A對(duì)照品（批號(hào)Y08301903021，純度≥98%）、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)Y08501904030，純度≥98%）、Z-藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)PCS-201104，純度≥98%）均購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773-201915，純度≥99.4%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸為分析純，水為超純水。

12批茶芎藥材分別采自江西武寧、瑞昌、德安的3個(gè)中藥基地，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院付小梅教授鑒定均為茶芎L.sinenseOliv.cv.Chaxiong的成熟根莖。將所采藥材放至55℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)四號(hào)篩，密封保存，備用。12批茶芎藥材樣品的來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 12批茶芎藥材樣品的來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 茶芎藥材HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件以Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，10%B→15%B；10～13 min，15%B；13～23 min，15%B→20%B；23～26 min，20%B；26～36 min，20%B→30%B；36～39 min，30%B；39～47 min，30%B→40%B；47～53 min，40%B→55%B；53～60 min，55%B→65%B；60～75 min，65%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)平衡時(shí)間為20 min。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯對(duì)照品各適量，分別置于10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，即得各單一對(duì)照品貯備液。分別取上述各單一對(duì)照品貯備液適量，置于同一10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇定容，制成上述成分質(zhì)量濃度分別為56.3、42.5、40.5、53.9、33.7、23.1、96.1 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取茶芎樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以13 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取茶芎樣品（編號(hào)S1）粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以Z-藁本內(nèi)酯（峰形、分離度均較好且響應(yīng)較強(qiáng)，下同）為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取茶芎樣品（編號(hào)S1）粉末6份，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以Z-藁本內(nèi)酯為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取茶芎樣品（編號(hào)S1）粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以Z-藁本內(nèi)酯為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），說(shuō)明該供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 指紋圖譜的建立 取12批茶芎樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC圖并以“AIA”格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》。以S7樣品圖譜（所含色譜信息豐富且各共有峰的分離度均較好）為參照，經(jīng)多點(diǎn)校正、Mark峰匹配后，生成茶芎HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（R），詳見(jiàn)圖1。

圖1 12批茶芎樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜

2.1.8 共有峰的確定及指認(rèn) 采用Mark峰匹配，共得到17個(gè)共有峰。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]并比對(duì)混合對(duì)照品色譜圖（圖2），初步確定1號(hào)峰為綠原酸、2號(hào)峰為阿魏酸、7號(hào)峰為洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、9號(hào)峰為阿魏酸松柏酯、13號(hào)峰為E-藁本內(nèi)酯、14號(hào)峰為洋川芎內(nèi)酯A、17號(hào)峰為Z-藁本內(nèi)酯。

圖2 混合對(duì)照品溶液的HPLC圖

2.1.9 相似度評(píng)價(jià) 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以對(duì)照指紋圖譜為參照，對(duì)12批茶芎樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，S1～S12批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.997、1.000、0.999、0.997、0.998、0.998、1.000、0.998、0.989、0.989、0.991、0.990，均大于0.980，提示不同產(chǎn)地茶芎樣品的相似性較好，質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。其中，武寧茶芎（S1～S5）的相似度為0.997～1.000，瑞昌茶芎（S6～S8）的相似度為0.998～1.000，德安茶芎（S9～S12）的相似度為0.989～0.991。整體上，武寧茶芎（S1～S5）與瑞昌茶芎（S6～S8）的相似度接近，提示兩者化學(xué)成分相似；此外，武寧、瑞昌茶芎的相似度均稍高于德安茶芎（S9～S12），提示德安茶芎的化學(xué)成分可能與前兩者有所不同。

2.2 茶芎樣品的CA

本研究以12批茶芎樣品17個(gè)共有峰的絕對(duì)峰面積為變量，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用平方歐氏距離為測(cè)度，以組間連接法進(jìn)行CA，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)平方歐氏距離為20時(shí)，12批茶芎樣品可被分為3類，S1～S5（武寧茶芎）聚為一類，S6～S8（瑞昌茶芎）聚為一類，S9～S12（德安茶芎）聚為一類。由此可以看出，不同產(chǎn)地茶芎樣品具有較明顯的聚類趨勢(shì)。當(dāng)平方歐氏距離為24時(shí)，S1～S5（武寧茶芎）可與S6～S8（瑞昌茶芎）聚為一類，S9～S12（德安茶芎）聚為一類，與茶芎HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致。

圖3 12批茶芎樣品的CA樹(shù)狀圖

2.3 茶芎樣品的PCA

本研究以12批茶芎樣品17個(gè)共有峰的絕對(duì)峰面積為變量，采用SPSS 22.0軟件，在進(jìn)行KMO、Bartlett’s檢驗(yàn)和降維統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)上進(jìn)行PCA，其總方差解釋結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，本研究共提取了4個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為85.385%（＞85%），提示前4個(gè)主成分代表了85.385%的整體信息，可用于反映不同產(chǎn)地茶芎樣品的整體質(zhì)量。

表2 總方差解釋結(jié)果

由因子矩陣和權(quán)重系數(shù)分析可知，主成分1的信息主要來(lái)自2、8、10、12、13、16號(hào)峰，主成分2的信息主要來(lái)自11、14、15、17號(hào)峰，主成分3的信息主要來(lái)自3、4、6、7號(hào)峰，主成分4的信息主要來(lái)自1、5、9號(hào)峰。對(duì)各因子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)合上述因子矩陣及權(quán)重系數(shù)，得到反映茶芎樣品質(zhì)量的主成分得分（F1～F4）表達(dá)式：

隨后，對(duì)F1～F4進(jìn)行系數(shù)加權(quán)（加權(quán)系數(shù)為特征值與累計(jì)特征值之和的比值），得到綜合評(píng)分（Fz）的表達(dá)式：

綜合評(píng)分越高，表示該批樣品整體質(zhì)量越優(yōu)[13-14]。根據(jù)上述公式，對(duì)12批不同產(chǎn)地茶芎樣品的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，瑞昌茶芎（S6～S8）質(zhì)量較好，其次為武寧茶芎（S1～S5）和德安茶芎（S9～S12）。

表3 主成分綜合評(píng)分及排序

2.4 茶芎樣品的OPLS-DA

本研究以12批茶芎樣品17個(gè)共有峰的絕對(duì)峰面積為變量，使用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA。結(jié)果顯示，X軸方向的模型解釋率（R2X）為0.945，Y軸方向的模型解釋率（R2Y）為0.987（R2X、R2Y越接近1，表明模型的穩(wěn)定性越強(qiáng)[15-16]），模型的預(yù)測(cè)率（Q2）為0.966（Q2越接近1，表明模型的可預(yù)測(cè)性越強(qiáng)[15-16]）。隨機(jī)排列200次進(jìn)行置換檢驗(yàn)驗(yàn)證，判斷OPLS-DA模型有無(wú)過(guò)度擬合現(xiàn)象。結(jié)果顯示，所得模型的R2截距為0.274，Q2截距為-1.290，提示所建模型不存在過(guò)度擬合現(xiàn)象[15-16]，可用以有效區(qū)分不同產(chǎn)地的茶芎樣品。由OPLS-DA得分圖（圖4）可知，武寧茶芎（S1～S5）聚為一類，瑞昌茶芎（S6～S8）聚為一類，均分布在得分圖右側(cè)；德安茶芎（S9～S12）聚為一類，分布在得分圖左側(cè)，該結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)、CA結(jié)果基本一致，可相互佐證。

圖4 OPLS-DA得分圖

進(jìn)一步對(duì)OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）進(jìn)行分析，篩選影響樣品質(zhì)量的差異性成分。以VIP＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)[16]，共得到貢獻(xiàn)相對(duì)較大的4個(gè)差異性成分，依次為17號(hào)峰（Z-藁本內(nèi)酯，VIP為3.174）、14號(hào)峰（洋川芎內(nèi)酯A，VIP為1.195）、2號(hào)峰（阿魏酸，VIP為1.150）、13號(hào)峰（E-藁本內(nèi)酯，VIP為1.052）。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 共有峰的VIP圖

2.5 4種差異性成分的含量測(cè)定

采用HPLC法對(duì)“2.4”項(xiàng)下所得4種差異性成分（阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯）的含量進(jìn)行測(cè)定。

2.5.1 色譜條件 同“2.1.1”項(xiàng)。

2.5.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯4種對(duì)照品各適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備各單一對(duì)照品貯備液。取上述各單一對(duì)照品貯備液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成上述成分質(zhì)量濃度分別為1.84、1.96、1.68、2.98 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 同“2.1.3”項(xiàng)。

2.5.4 專屬性試驗(yàn) 取“2.5.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液和空白對(duì)照溶液（70%甲醇），按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖略）。結(jié)果顯示，阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯色譜峰的分離度均大于1.5，且各色譜峰無(wú)拖尾現(xiàn)象，提示方法專屬性良好。

2.5.5 線性范圍考察 取“2.5.2”項(xiàng)下阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液0.1、0.5、1、2、5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%甲醇定容，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表4。分別取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度分別為0.018、0.020、0.017、0.030 mg/mL，按“2.5.2”項(xiàng)下方法配制）適量，以70%甲醇倍比稀釋，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比3∶1、10∶1計(jì)算檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 4種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.6 精密度試驗(yàn) 取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.12%、0.54%、0.98%、0.42%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批茶芎樣品（編號(hào)S1）6份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯含量的RSD分別為0.93%、1.38%、1.45%、1.12%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5.3”項(xiàng)下同一供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.18%、0.17%、0.50%、0.25（n＝6），表明該供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（編號(hào)S4）6份，每份約0.25 g，置具塞錐形瓶中，加入與已知量相當(dāng)?shù)陌⑽核帷⒀蟠ㄜ簝?nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液（按“2.5.2”項(xiàng)下方法配制），按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為99.92%、98.01%、100.90%、99.73%，RSD分別為0.69%、0.26%、1.45%、0.17%（n＝6）。

2.5.10 含量測(cè)定 分別取12批茶芎樣品，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算含量。采用Graph-Pad Prism 9.3.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，12批茶芎藥材中，阿魏酸含量均在0.4 mg/g以上，3個(gè)產(chǎn)地茶芎中該成分含量?jī)蓛杀容^差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且以瑞昌茶芎最高（P＜0.05或P＜0.01），故可作為標(biāo)志性成分；洋川芎內(nèi)酯A含量均高于或接近于1.2 mg/g，3個(gè)產(chǎn)地茶芎中該成分含量?jī)蓛杀容^差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且以瑞昌茶芎最高（P＜0.05或P＜0.01），故也可作為標(biāo)志性成分；E-藁本內(nèi)酯含量均在0.1 mg/g以上，兩兩比較差異顯著且德安茶芎顯著高于其他產(chǎn)地茶芎（P＜0.01），故也可作為標(biāo)志性成分；瑞昌、武寧、德安茶芎中Z-藁本內(nèi)酯的含量分別高于8.0、7.0、4.0 mg/g，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），故也可作為標(biāo)志性成分。上述含量測(cè)定結(jié)果也佐證了OPLS-DA模型的預(yù)測(cè)結(jié)果，阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯均可作為影響質(zhì)量的差異性成分。

表5 12批茶芎樣品中4種成分的含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑及提取方式的選擇

在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，本課題組分別考察了不同提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇）對(duì)目標(biāo)成分含量的影響，經(jīng)單因素方差分析可知，70%甲醇對(duì)目標(biāo)成分的提取效果最好，且與其他溶劑提取效果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，本課題組分別考察了不同提取方式（回流提取法、超聲提取法）對(duì)目標(biāo)成分含量的影響，經(jīng)單因素方差分析可知，兩種提取方式對(duì)目標(biāo)成分含量的影響并不顯著（P＞0.05），故考慮到實(shí)驗(yàn)操作的便捷性，本研究選擇了超聲提取法。

3.2 流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在色譜條件考察過(guò)程中，由于樣品含有有機(jī)酸類成分，為防止色譜峰拖尾，故使用0.1%磷酸溶液作為水相，并先后考察了乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-0.1%磷酸溶液的洗脫效果。結(jié)果顯示，當(dāng)以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，所得色譜圖基線較為平穩(wěn)，各色譜峰峰形和分離度均較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相。通過(guò)二極管陣列紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器在190～800 nm內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吸收波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，各色譜峰峰形和分離度均較好，參照峰（Z-藁本內(nèi)酯）響應(yīng)較強(qiáng)，故最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

3.3 指紋圖譜及多元統(tǒng)計(jì)分析

12批茶芎藥材共有17個(gè)共有峰。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，12批茶芎藥材的相似度均高于0.980，說(shuō)明3個(gè)產(chǎn)地茶芎藥材的化學(xué)成分種類差異較小，藥材質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定；根據(jù)CA和OPLS-DA結(jié)果可知，S1～S5（武寧茶芎）聚為一類，S6～S8（瑞昌茶芎）聚為一類，S9～S12（德安茶芎）聚為一類，提示藥材受產(chǎn)地環(huán)境的影響較為明顯。根據(jù)PCA綜合評(píng)價(jià)分析可知，S6～S8（瑞昌茶芎）的綜合評(píng)分較高，其次為武寧茶芎（S1～S5）和德安茶芎（S9～S12）?？梢?jiàn)，CA、PCA、OPLS-DA可為不同產(chǎn)地茶芎藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

3.4 差異性成分的篩選及含量測(cè)定分析

中藥成分具有復(fù)雜性和多效性，采用單一指標(biāo)成分難以實(shí)現(xiàn)對(duì)其質(zhì)量的整體控制，故多種成分的同時(shí)測(cè)定是中藥質(zhì)量控制的重要研究方向。本研究運(yùn)用OPLS-DA篩選出4個(gè)差異性成分，即阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯。通過(guò)含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，3個(gè)產(chǎn)地茶芎樣品中4種成分兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再次說(shuō)明這4種成分可作為標(biāo)志性成分用以區(qū)分不同產(chǎn)地的茶芎藥材，并可為該藥材的全面評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供參考。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜、多元統(tǒng)計(jì)分析、含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可行，可用于茶芎藥材評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制。阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、Z-藁本內(nèi)酯、E-藁本內(nèi)酯可能是影響不同產(chǎn)地茶芎藥材質(zhì)量的差異性成分，且前3種成分含量均以瑞昌茶芎最高，E-藁本內(nèi)酯含量以德安茶芎最高。