汪毅恒，聶婷婷，方明玉，陳少澤，房 輝，曹曉琴

（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖北 武漢 430056）

雞蛋富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，其必需氨基酸的組成及比例與人體對氨基酸的需求接近，在人類的基礎(chǔ)營養(yǎng)中發(fā)揮著舉足輕重的作用[1]。其中的脂肪酸有一定的抗氧化作用[2]，在嬰幼兒的大腦發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和疾病預(yù)防中都有重要的作用[3]。

目前，脂肪酸的檢測技術(shù)有氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、高效液相色譜法、近紅外光譜法等[4-6]。但脂肪酸的沸點較高，在高溫環(huán)境下不易揮發(fā)，在高溫的柱環(huán)境下不易分離，對脂肪酸的測定有干擾[7]，因此需要開發(fā)適用于分析雞蛋中脂肪酸的GC 方法，并對前處理進(jìn)行優(yōu)化。本文采用氣相色譜法測定雞蛋中蛋黃油的脂肪酸組分，并對其前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，方法簡便迅速，分離條件溫和，可用于蛋黃油中脂肪酸的定性及定量測定。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑

37 種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品。乙酸乙酯、正己烷、氫氧化鈉、氫氧化鉀、無水甲醇、95%乙醇、乙酸（均為分析純）。超純水（自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E 型電子天平，中文液晶超聲波清洗器，SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，WH-3型微型旋渦混合儀，DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，CT-1A 型氮氫空氣發(fā)生器，氮吹濃縮裝置MTN-2800W（220V/50Hz），DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，島津GC-2014C 型氣相色譜儀。

2 實驗方法

2.1 蛋黃油樣品的制備

采用乙醇萃取法制備蛋黃油樣品[8]。稱取約60g 蛋黃液，加入95%乙醇600mL，放入50℃的恒溫加熱磁力攪拌器中加熱、攪拌（轉(zhuǎn)速30r·min-1）。40min 后，將乙醇萃取液倒入布氏漏斗中減壓抽濾，濾渣用95%乙醇洗滌數(shù)次。待漏斗過濾口沒有液體滴出后，將抽濾瓶中的溶液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中55℃旋轉(zhuǎn)蒸干，放入烘箱中50℃烘干至恒重，得到蛋黃油樣品。

2.2 氣相色譜條件

色譜柱：WAX（30m×0.25mm×0.25μm）。程序升溫條件：初始溫度100℃，保持3min，以3℃·min-1升至240℃，保持7min。載氣（N2）流速10.6mL·min-1；進(jìn)樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃，不分流；進(jìn)樣量1μL。

2.3 甲酯化方法

取2.1 的蛋黃油樣品約0.1g，用10mL 正己烷溶液溶解后，加入5mL 的KOH-甲醇（0.5mol·L-1）溶液，80℃下超聲5min 進(jìn)行甲酯化。向甲酯化后的樣品中加入1mL 飽和NaCl 溶液和1mL 蒸餾水，再次漩渦震蕩使其充分混合后，加入1mL 正己烷溶液。取上清液，用氮吹儀吹干，待正己烷揮發(fā)后定容至25mL，過0.45μm 有機(jī)濾膜。

3 結(jié)果與討論

3.1 氣相色譜法的建立

對氣相色譜的升溫程序進(jìn)行優(yōu)化。先采用升溫程序①：柱初始溫度為160℃，以5℃·min-1升至180℃，保持5min；再以5℃·min-1升至220℃，保持1min，結(jié)果見圖1。再采用升溫程序②：柱初始溫度100℃，保持3min，以3℃·min-1升至240℃，保持7min，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，由升溫程序②得到的峰型較完整，分離度較高，因此確定采用升溫程序②。

圖1 升溫程序①的譜圖Fig.1 Chromatogram of Temperature procedure ①

圖2 升溫程序②的譜圖Fig.2 Chromatogram of Temperature procedure ②

3.2 前處理方法的優(yōu)化

3.2.1 甲酯化方法的選擇

按照2.3 的方法，分別以KOH-甲醇（0.5mol·L-1）、NaOH-甲醇（0.5mol·L-1）作為甲酯化試劑進(jìn)行處理。對比KOH-甲醇法與NaOH-甲醇法的色譜圖，結(jié)果見圖3。測定了其中的3 個物質(zhì)1、2、3 的峰面積，結(jié)果見表1。從表1 可知，采用KOH-甲醇法處理后，樣品所含的物質(zhì)1、2、3 的濃度均較NaOH-甲醇法更高，表明KOH-甲醇法的處理效果更佳。

圖3 KOH-甲醇法與NaOH-甲醇法的色譜圖比較Fig.3 Results of chromatogram comparison of KOH-methanol method and NaOH-methanol method

表1 不同甲酯化的峰面積比較結(jié)果Table 1 Comparison of the area of different methyl esterification peaks

3.2.2 甲酯化儀器的選擇

按照2.3 的方法，分別采用超聲、冷凝回流、漩渦震蕩進(jìn)行甲酯化前處理，對比了各樣品的色譜圖，結(jié)果見圖4。比較其中3 個物質(zhì)（1、2、3）的峰面積，結(jié)果見表2。由此確定最佳的甲酯化處理方法為超聲處理。

表2 超聲、冷凝回流、漩渦震蕩各峰面積的比較結(jié)果Table 2 Comparison of peak areas of ultrasonic,condensate reflux and vortex oscillation

圖4 超聲、冷凝回流、漩渦震蕩色譜圖的比較結(jié)果Fig.4 Comparison of ultrasonic,condensate reflux,and vortex shock chromatogram results

3.2.3 甲酯化影響因素的確定

分別研究了KOH-甲醇用量、超聲時間、超聲溫度對甲酯化程度的影響。在前期實驗的基礎(chǔ)上，選取棕櫚酸的峰面積作為評價指標(biāo)，對甲酯化的影響因素進(jìn)行正交實驗，設(shè)置了3 個因素，分別為KOH-甲醇用量、超聲時間和超聲時間，每個因素分別選取3 個水平，結(jié)果見表3。

由表3 可知，KOH-甲醇用量、超聲時間、超聲溫度對甲酯化程度均有影響。隨著KOH-甲醇溶液的用量增加，樣品的峰面積逐漸增大，10mL 時達(dá)到相對穩(wěn)定。隨著超聲時間增加，樣品的峰面積逐漸增大，10min 時達(dá)到相對穩(wěn)定。超聲溫度對脂肪酸的甲酯化有顯著影響，但對不同物質(zhì)的影響不同。正交實驗結(jié)果表明，超聲時間對甲酯化的影響最大，R=71974；超聲溫度對甲酯化的影響最小，R=39555.6667。序號7 的結(jié)果最好，棕櫚酸的峰面積為219849。最終確定脂肪酸的甲酯化條件為：KOH-甲醇用量為5mL，超聲溫度為80℃，超聲時間為5min。

表3 甲酯化影響因素的正交實驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of influencing factors of methyl esterification

3.3 線性范圍、檢測限與定量限

蛋黃中多種脂肪酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）結(jié)果見表4。從表4 可知，濃度在2.5～300μg·mL-1范圍內(nèi)，9 種脂肪酸的線性關(guān)系良好，各組分檢出限在1.1～4.5μg·mL-1之間，定量限在2.0～7.9μg·mL-1之間。

表4 9 種脂肪酸的線性回歸方程Table 4 Linear regression equation of 9 fatty acids

3.4 準(zhǔn)確度和精密度

空白樣品按3 個濃度水平，添加37 種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品，每個水平平行測定6 次，考察方法的回收率與精密度。以亞油酸為參照，記錄峰面積，計算回收率和變異系數(shù)，結(jié)果見表5。由表5 可知，亞油酸在蛋黃中的平均回收率在79.8%～81.9%之間，變異系數(shù)≤11.2%，滿足準(zhǔn)確度和精密度的監(jiān)控要求。

表5 不同樣品中亞油酸的回收率和變異系數(shù)Table 5 Recovery and variation coefficient of linoleic acid in different samples

4 結(jié)論

本實驗采用GC 法檢測蛋黃油中的脂肪酸。對柱升溫程序及樣品的前處理條件進(jìn)行了優(yōu)化，前處理可較好地分離脂肪酸混合物，且分離度較高，峰形對稱。本方法的專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度及精密度高，各組分在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各項指標(biāo)滿足要求，可作為蛋黃油中脂肪酸測定的有效方法。