周舒揚(yáng)，趙曉宇，葉陽，張丕奇，戴肖東，王玉江

(黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010)

0 引 言

植物病害給農(nóng)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，施用化學(xué)藥劑是人類防治植物病害的主要策略。但是，長期大量施用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致農(nóng)藥殘留污染環(huán)境、危害人類健康、破壞生態(tài)平衡、植物產(chǎn)生抗藥性等問題日益突出，也降低了產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值。因此，人們逐漸將防治的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向生物防治[1]。

微生物源生物農(nóng)藥控制病害，因其高效、低毒、低殘留、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。發(fā)酵是生物制劑研發(fā)過程中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，是一個(gè)在適宜環(huán)境下借助于微生物特定代謝途徑將特定培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化為人們所需品的過程[2]。微生物發(fā)酵的能力除了由菌株的遺傳功能特性，還取決于適宜的培養(yǎng)基和發(fā)酵的環(huán)境條件。優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件可以充分發(fā)揮菌株的潛能，提高生產(chǎn)效率和質(zhì)量，降低成本[3]。

生防菌B29菌株為黑龍江省科學(xué)院微生物研究所分離保存，菌株保藏號(hào)CGMCC 0752，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)，其對(duì)多尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌及腐霉菌等多種植物病原真菌均有抑制作用，是高效廣譜的生防菌株[4]。芽孢桿菌易從土壤和植株中分離得到，產(chǎn)生耐熱和抗逆性的芽孢，具有顯著的生物防治潛力，且芽孢桿菌易于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖和繁殖。因?yàn)檠挎邨U菌屬的菌株具有易于培養(yǎng)和儲(chǔ)存的諸多優(yōu)點(diǎn)，比其他微生物菌種更適用于生物防治領(lǐng)域研究[5]。另外，芽孢桿菌在生長和發(fā)酵培養(yǎng)中后期會(huì)產(chǎn)生的具有抗菌生物活性的脂肽類物質(zhì)，如伊枯草菌素(iturins)、芬薺素(fengycin)和表面活性素(surfactin)等[6-8]。目前能產(chǎn)生脂肽類抗生素的菌產(chǎn)抗生素的能力普遍較低，因?yàn)橹念惪股氐漠a(chǎn)生受溫度、pH和攪拌速度影響較大[9]，通過優(yōu)化發(fā)酵條件可有效促進(jìn)脂肽類抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生和累積，因此研究著重在培養(yǎng)基固定的前提條件下優(yōu)化發(fā)酵條件，尋求最佳的發(fā)酵工藝參數(shù)，提高抗菌性脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量，為進(jìn)一步擴(kuò)大產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)，也為植物病害生物防治謀新徑。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

生防菌B29菌株為黑龍江省科學(xué)院微生物研究所自黃瓜根圍土壤中分離并保存，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母粉1%，胰蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，pH調(diào)整至7.0，固體培養(yǎng)基添加1%瓊脂粉，于1×105Pa滅菌20 min，備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏0.8%，NaCl 0.5%，MgSO40.02%，K2HPO40.02%，CaCO30.02%，pH調(diào)整至7.0，于1×105Pa滅菌20 min，備用。

1.3 主要設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)：日立CR21GⅢ；臺(tái)式pH儀：METTLER TOLEDO 320；全自動(dòng)發(fā)酵罐：韓國Hanil SP20L fermenter。

1.4 菌株活化及種子制備

將-80 ℃保存于甘油的B29菌種于室溫融化，轉(zhuǎn)接于LB平板上37 ℃活化培養(yǎng)24 h。再挑取單菌落于5 ml LB液體培養(yǎng)基中30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)24 h。取20 μl菌液接種于含有50 ml LB液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)24 h作為發(fā)酵罐種子。

1.5 全自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵生防菌B29菌株

滅菌：制備10 L發(fā)酵培養(yǎng)基，采用發(fā)酵罐自動(dòng)程序進(jìn)行滅菌，罐內(nèi)壓力819.2 Pa，121 ℃下滅菌15 min。

初始參數(shù)設(shè)定：發(fā)酵溫度30 ℃，攪拌350 r·min-1，消沫靈敏度5。

自動(dòng)控制設(shè)定：通過對(duì)全自動(dòng)發(fā)酵罐溶氧和pH等參數(shù)設(shè)置，使溶氧控制與攪拌速度、通氣量、NaOH溶液滴入聯(lián)動(dòng)，將溶氧控制在不低于30%，pH值不低于6.0且不高于8.0條件下。

1.6 脂肽類抗菌物質(zhì)提取

脂肽類抗生素的提取采用酸沉淀法[10]。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液6 000 r·min-1離心10 min，去除沉淀菌體細(xì)胞，在上清液中加入6 mol·L-1HCl使pH達(dá)到2.0，置于4 ℃離心機(jī)過夜后，再次將其7 000 r·min-1離心20 min，收集底部沉淀。將沉淀物于60 ℃的烘箱中烘干18 h，稱重即得到脂肽類抗生素粗提物的干重。

1.7 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在不改變培養(yǎng)基組分的條件下，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)方法[11]對(duì)本實(shí)驗(yàn)篩選的3種因素的重要性進(jìn)行評(píng)估，篩選影響生防菌B29菌株產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)的量因素水平，確定最佳發(fā)酵工藝。采用Design-Expert 8.0軟件的Plackett-Burman試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，方案見表1所示。

表1 利用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選培養(yǎng)基的重要組分Table 1 Design of screening substrate for critical components using Plackett-Burman

1.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用得到的最適發(fā)酵條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，來驗(yàn)證設(shè)計(jì)的模型是否可靠，從而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化脂肽類物質(zhì)產(chǎn)生條件

2.1.1 回歸方程的建立與合理性分析。根據(jù)軟件Design-Expert 8.0生成，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行試驗(yàn)，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Group experiment results

式中：A是攪拌速度；B是pH；C是溫度。

對(duì)方差進(jìn)行分析，F(xiàn)值能夠用來檢查各變量對(duì)響應(yīng)值影響的重要程度，F(xiàn)值越大，相應(yīng)變量的重要性越大。只有回歸模型的P<0.05，說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)踐意義。如表3所示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)對(duì)脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋簲嚢杷俣?A)>溫度(C)>pH值(B)，其中攪拌速度(A)和溫度(C)對(duì)脂肽的產(chǎn)量影響較大，在交互項(xiàng)AB對(duì)脂肽類物質(zhì)的產(chǎn)量有極其重要的影響。該模型的多元相關(guān)性系數(shù)R2為0.981 1，表明該模型具有較高的顯著性，而調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2(adj)=0.956 8，可以解釋實(shí)驗(yàn)95.68%的響應(yīng)值突變，與預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2(pred)=0.952 4相近，表明該模型與實(shí)驗(yàn)室得到的數(shù)據(jù)吻合度較高，具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)性，因此，可以用該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠矸治龊皖A(yù)測產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵條件。

表3 分組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of grouping experimental data

2.1.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析。根據(jù)擬合回歸方程，利用Design Expert軟件分析得到響應(yīng)面分析圖和等高圖(圖1，圖2)。從圖1可以看出，攪拌速度與溫度的相互作用對(duì)脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的影響是呈斜拱形曲面狀，攪拌速度的縱向跨度很大，其可能是影響脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的一個(gè)敏感變量，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)攪拌速度應(yīng)滿足在260～340 r·min-1范圍內(nèi)。

圖1 攪拌速度與溫度交互作用Fig.1 Agitation speed and temperature interaction

由圖2可知，pH-溫度交互作用曲面中，曲面隨溫度變化波動(dòng)幅度更大，表明溫度較pH影響顯著，對(duì)脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量受到的影響較為明顯，產(chǎn)量前期隨著pH值和溫度的上升而增加，后期隨pH值和溫度的上升而降低。在這兩個(gè)變量的影響下的發(fā)酵條件為：pH為6.5～7、溫度32～33 ℃范圍內(nèi)最為合適。

圖2 pH值與溫度交互作用Fig.2 pH and temperature interaction

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)2.1響應(yīng)面對(duì)脂肽類抗生素產(chǎn)生情況獲得最佳發(fā)酵工藝為：攪拌速度348 r·min-1、pH 6.9、溫度33 ℃，脂肽類抗生素理論產(chǎn)量可達(dá)0.763 mg·ml-1。

經(jīng)過3次平行試驗(yàn)，在該條件下進(jìn)行3次重復(fù)平行試驗(yàn)測得脂肽類物質(zhì)含量分別為0.761 mg·ml-1、0.759 mg·ml-1和0.763 mg·ml-1，基本與預(yù)測值接近，具備一定的良好擬合性，證實(shí)了模型的有效。

3 討論和結(jié)論

B29菌株在田間大區(qū)示范中表現(xiàn)出對(duì)黃瓜枯萎病的良好防治效果，且具有一定的增產(chǎn)作用[12]。生防枯草芽孢桿菌的作用機(jī)制包括營養(yǎng)成分和位點(diǎn)競爭、分泌抗菌化合物、溶菌作用、誘導(dǎo)抗菌性和促進(jìn)生長[13-14]?？莶菅挎邨U菌B29菌株通過產(chǎn)生抗菌性脂肽類物質(zhì)[15]，在黃瓜根莖部定殖、誘導(dǎo)宿主植物防御酶活性及促生長等多重作用而對(duì)黃瓜根部病害起到防治作用。

由于芽孢桿菌在自然生長和發(fā)酵培養(yǎng)后期可產(chǎn)生的具有抗菌活性的脂肽類抗生素，如伊枯草菌素、芬薺素和表面活性素等[16]。表面活性素具有較強(qiáng)的發(fā)泡性，而伊枯草菌素和芬薺素具有強(qiáng)烈的抗菌活性，也可根據(jù)所需不同的產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。目前有關(guān)枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件優(yōu)化都是以產(chǎn)糖量、產(chǎn)酸量或產(chǎn)孢量為響應(yīng)值，本研究是以脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量為最終目標(biāo)來進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，以攪拌速度、pH和溫度為影響因素進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，得到最適發(fā)酵條件為：攪拌速度348 r·min-1、pH 6.9、溫度33 ℃。

微生物發(fā)酵是實(shí)現(xiàn)生物防治產(chǎn)品工業(yè)化的重要工藝之一，其中包括優(yōu)化發(fā)酵條件和液體培養(yǎng)基。利用Plackett-Burman(PB)可以從一系列影響因素中快速有效的優(yōu)化發(fā)酵條件，因此廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選[17]。本研究在前期研究工作基礎(chǔ)上，選用已經(jīng)篩選獲得的培養(yǎng)基組分為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面法著重篩選影響抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的重要發(fā)酵參數(shù)，對(duì)發(fā)酵枯草芽孢桿B29產(chǎn)脂肽類物質(zhì)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高了該菌株產(chǎn)脂肽類物質(zhì)的能力。在實(shí)驗(yàn)中，攪拌速度是溶解氧的重要指標(biāo)，溫度和pH值則是發(fā)酵中最重要的發(fā)酵控制因素。在三個(gè)重要的調(diào)控因素條件下，三者具有非常密切的交互作用，傳統(tǒng)正交實(shí)驗(yàn)不能有效獲得代謝產(chǎn)物最佳發(fā)酵工藝，在響應(yīng)面技術(shù)應(yīng)用條件下，利用數(shù)學(xué)回歸模型建立，可計(jì)算最合理的發(fā)酵技術(shù)參數(shù)，為進(jìn)一步擴(kuò)大產(chǎn)品中試及工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐，為后續(xù)利用其防治多種植物病害奠定了基礎(chǔ)，也為植物病害生物防治謀新徑。