胡澤香，佟雷，耿艷萌，楊琦，謝舒，侯甲福(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

0 引言

木犀草素(Luteolin)是一種黃酮類(lèi)化學(xué)物質(zhì)[1]，廣泛分布于自然界中，例如金銀花、菊花、白貓夏枯草等傳統(tǒng)中藥中[2]。具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[3]，在臨床多應(yīng)用在止咳、祛痰、消炎方面[4]。黃酮類(lèi)化合物因其化學(xué)結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的抗氧化活性[5]，起主要作用的就是酚羥基的取代基位置和數(shù)目，尤其是B環(huán)的鄰二酚羥基[6]。木犀草素應(yīng)具有抗氧化活性[7]。但由于木犀草素在熱水中微溶，在冷水中不溶，從根本上限制了木犀草素的應(yīng)用。納米乳是由水相、油相和乳化劑組成的一種溶液體系，可提高水難溶性藥物成分的溶解度，同時(shí)體系中具有高度分散的小液滴，在體內(nèi)分布快，藥效高，可以極大地提高藥物吸收速度來(lái)發(fā)揮藥效，來(lái)提高生物利用度，本實(shí)驗(yàn)將木犀草素制備成水包油型納米乳來(lái)克服水溶性差的特點(diǎn)，文章主要從木犀草素納米乳清除超氧陰離子自由基方面來(lái)研究其抗氧化活性，并以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

1 材料與儀器

1.1 材料

木犀草素(上海泰坦科技股份有限公司)；鹽酸溶液(哈爾濱試劑化工廠)；維生素C片(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司)；Tris-Base(飛凈科研試劑)；鄰苯三酚(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；乙酸乙酯(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；Tween-80(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)。

1.2 儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(江蘇省蘇州市新區(qū)華山路145號(hào))；高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

鄰苯三酚自氧化-分光光度法可以用來(lái)初步篩選食品行業(yè)的抗氧化劑，也可以對(duì)清除超氧陰離子自由基的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)[8]。鄰苯三酚的自氧化過(guò)程是鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在堿性條件下可以自氧化生成超氧陰離子自由基[9]。鄰苯三酚在pH值＜9的條件下其自氧化速率與生成的超氧陰離子自由基的濃度成正相關(guān)。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量木犀草素對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用來(lái)間接描述木犀草素的抗氧化活性[10]。

2.1.1 溶液配制

(1) Tris溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.211 4 g Tris固體，蒸餾水溶解后定容至100 mL，得濃度為0.1 moL/L Tris溶液。

(2) Tris-HCl溶液配制：將Tris溶液50 mL與0.1 moL/L HCl溶液22.9 mL混合，加蒸餾水將體積調(diào)至100 mL，得濃度為50 mmoL/L Tris-HCl溶液。

(3)鄰苯三酚溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取鄰苯三酚0.037 8 g, 10 mmol/L HCl溶解后定容至100 mL，得濃度為3 mmoL/L鄰苯三酚溶液。

(4) HCl溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mL的0.1 mol/L HCl溶液，蒸餾水溶解后定容至100 mL，得濃度為10 mmol/L HCl溶液。

(5)木犀草素納米乳配制：將乙酸乙酯、蒸餾水、tween-80、無(wú)水乙醇四種組分按照不同的比例加入燒杯中，加入4 mg木犀草素，攪拌混合之后共100 mL。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲，最終形成木犀草素納米乳。分別取 10、9、8、7、6、5 mL 木犀草素溶液置于試管，加入無(wú)水乙醇定容至10 mL，得到溶液的濃度分別為 0.040、0.036、0.032、0.028、0.024、0.020 mg/mL。

(6) VC溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取9.8 mg VC粉末，蒸餾水溶解后定容至100 mL。分別取10、9、8、7、6、5 mL VC溶液置于試管，加入蒸餾水定容至10 mL，得到溶液的濃度分別為 0.040、0.036、0.032、0.028、0.024、0.020 mg/mL。

2.1.2 操作步驟

(1)鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定。試管中加入Tris-HCl緩沖液4.5 mL，再加入4.2 mL蒸餾水，混和之后進(jìn)行水浴加熱[11]。設(shè)置溫度為25 ℃，20 min取出之后，馬上加入0.3 mL相同溫度下已經(jīng)預(yù)熱好的鄰苯三酚[12]，混合均勻之后開(kāi)始計(jì)時(shí)。波長(zhǎng)設(shè)為325 nm，吸光度值每隔30 s記錄一次，時(shí)間為4 min。以10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚溶液作為空白管[13]。橫坐標(biāo)是時(shí)間，縱坐標(biāo)是吸光度值，做出的曲線斜率為鄰苯三酚自氧化的反應(yīng)速率K0。

(2)木犀草素納米乳對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響。試管中加入Tris-HCl緩沖液4.5 mL，再加入4.2 mL木犀草素納米乳，混和之后進(jìn)行水浴加熱。設(shè)置溫度為25 ℃，20 min取出之后，馬上加入0.3 mL相同溫度下已經(jīng)預(yù)熱好的鄰苯三酚，混合均勻之后開(kāi)始計(jì)時(shí)。波長(zhǎng)設(shè)為325 nm，吸光度值每隔30 s記錄一次，時(shí)間為4 min。以10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚溶液[14]，以無(wú)水乙醇4.2 mL代替木犀草素納米乳作為空白管。橫坐標(biāo)是時(shí)間，縱坐標(biāo)是吸光度值，做出的曲線斜率記為K1。然后按照下列公式計(jì)算清除率。

式中：K0為加入蒸餾水后鄰苯三酚溶液的吸光值隨時(shí)間的變化率；K1為加入不同濃度木犀草素納米乳后鄰苯三酚溶液的吸光值隨時(shí)間的變化率。

(3) VC對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響。試管中加入Tris-HCl緩沖液4.5 mL，再加入4.2 mL VC溶液，混和之后進(jìn)行水浴加熱。設(shè)置溫度為25 ℃，20 min取出之后，馬上加入0.3 mL相同溫度下已經(jīng)預(yù)熱好的鄰苯三酚，混合均勻之后開(kāi)始計(jì)時(shí)。波長(zhǎng)設(shè)為325 nm，吸光度值每隔30 s記錄一次，時(shí)間為4 min。以10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚溶液，以蒸餾水4.2 mL代替VC溶液作為空白管。橫坐標(biāo)是時(shí)間，縱坐標(biāo)是吸光度值，做出的曲線斜率記為K2。然后按照下列公式計(jì)算抑制率：

式中：K0為加入蒸餾水后鄰苯三酚溶液的吸光值隨時(shí)間的變化率；K2為加入不同濃度VC溶液后鄰苯三酚溶液的吸光值隨時(shí)間的變化率。

3 結(jié)果與分析

3.1 清除超氧陰離子自由基的能力

以VC為對(duì)照，不同濃度的木犀草素納米乳對(duì)超氧陰離子自由基的清除率如圖1所示。由圖1可以看出木犀草素納米乳對(duì)超氧陰離子具有清除作用，其清除作用效果與木犀草素納米乳濃度在一定范圍內(nèi)呈正向關(guān)系，木犀草素納米乳清除超氧陰離子自由基的能力稍弱于VC。在0.02～0.04 mg/mL 的有效范圍內(nèi)，隨木犀草素納米乳濃度的不斷增加，清除率也隨之不斷增加?？梢钥闯瞿鞠菟丶{米乳濃度越大，其對(duì)超氧陰離子的清除力越高。

圖1 木犀草素對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

作為一種特殊的金屬酶，超氧化物歧化酶(SOD)可以與超氧陰離子自由基發(fā)生反應(yīng)，從而對(duì)其進(jìn)行清除[15]。經(jīng)典的鄰苯三酚法是Marklund等第一次研究出了鄰苯三酚法來(lái)測(cè)定SOD活性[16]。鄰苯三酚在堿性條件下可以迅速氧化產(chǎn)生超氧陰離子而生成中間產(chǎn)物，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值增加，二者之間呈線性關(guān)系。該法簡(jiǎn)單快速，重復(fù)性很好[17]。

3.2 木犀草素的抗氧化作用

當(dāng)氧氣與體內(nèi)某些物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí)，會(huì)生成對(duì)人類(lèi)有害的活性氧和自由基[18]?；钚匝鹾妥杂苫鶗?huì)破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)，引起DNA的突變，破壞生物大分子的的膜結(jié)構(gòu)和功能蛋白，由此加速機(jī)體的老化和損傷，甚至?xí)拱┌Y、惡性腫瘤的發(fā)生率增加[19]。木犀草素本身具有還原性，可作為氫供體給自由基提供氫原子[20]。主要作用于酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，對(duì)抗氧自由基、活性氧等發(fā)揮抗氧化作用[21]。此外，木犀草素還可以增強(qiáng)生物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活性[22]。Rooban等[23]發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)兩種酶，在被亞硒酸鹽誘導(dǎo)之后活性會(huì)降低，但是木犀草素可以緩解并可以增加其活性。Ashokkumar P等研究發(fā)現(xiàn)木犀草可以提高維生素A、維生素C和維生素E的含量，而這三種維生素是參與機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要物質(zhì)。木犀草素還能通過(guò)增強(qiáng)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性來(lái)起到抗氧化的作用[24]。木犀草素雖有抗氧化活性，但其不表現(xiàn)為促氧化，可以很好地清除自由基[25]。

4 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木犀草素納米乳可有效清除超氧陰離子自由基，自由基清除能力很強(qiáng)，略弱于VC溶液，說(shuō)明木犀草素納米乳具有很強(qiáng)的抗氧化活性[26]。木犀草素納米乳在抗氧化活性方面具有很好的開(kāi)發(fā)潛能，可以更好地應(yīng)用于食品加工和醫(yī)療領(lǐng)域。