王艷培(樂普(北京)醫(yī)療器械股份有限公司，北京 102200)

0 引言

冠心病是當(dāng)前一類嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病類型。當(dāng)前在我國本病的患病率、死亡率均在不斷升高，針對本病的治療方法及效果受到人們的關(guān)注和重視[1]。自1977年起，經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形手術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)在冠脈支架狹窄疾病治療中得到應(yīng)用。當(dāng)前已相繼對該技術(shù)進(jìn)行了3次技術(shù)革命，主要為裸金屬支架、藥物洗脫支架以及生物可吸收支架。裸金屬支架和藥物洗脫支架的主要區(qū)別是藥物洗脫支架是在裸支架的表面涂上特殊的藥物涂層支架[2]。植入到血管里后支架上藥物涂層能控制藥物緩慢釋放，進(jìn)而阻止瘢痕組織過度增生。與傳統(tǒng)金屬裸支架相比，藥物洗脫支架可以減少支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。目前，藥物洗脫支架主要以紫杉醇和雷帕霉素作為主要藥物成分。涂層技術(shù)類型有聚合物載體支架、單面刻槽技術(shù)、全降解涂層及無聚合物載體支架。在血管內(nèi)藥物洗脫支架藥物涂層研究過程中發(fā)現(xiàn)，為解決藥物洗脫支架藥物涂層控釋和涂層牢固度等性能時，需要使用多種有機(jī)溶劑對聚合物涂層和藥物進(jìn)行優(yōu)化。公司某款藥物洗脫支架在進(jìn)行噴涂過程中需應(yīng)用溶劑丙酮和乙酸乙酯分別對聚合物涂層和藥物涂層進(jìn)行噴涂工藝。為減少藥物涂層中殘留溶劑對人體損害，該藥物洗脫支架必須建立殘留溶劑分析方法，以對支架的丙酮和乙酸乙酯進(jìn)行檢測，確保藥物洗脫支架中殘留溶劑符合標(biāo)準(zhǔn)要求[3]。本文主要以通過實(shí)驗(yàn)建立藥物洗脫支架中殘留溶劑分析方法及對藥物洗脫支架中丙酮和乙酸乙酯殘留量進(jìn)行檢測分析。

儀器和設(shè)備：安捷倫7890A氣相色譜儀，配置氫火焰離子化檢測器(安捷倫科技有限公司)，Auto-HS頂空進(jìn)樣器(成都科林科技有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多公司)，渦旋混合振蕩器(IKA公司)，丙酮和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，購自Accustandard，純度99.5%，1 mL，Gilson5.0 mL移液槍，大龍1.0 mL移液槍，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.1 實(shí)驗(yàn)條件

HP-INNOWAX 色譜柱 (30 m×320 μm×0.5 μm)；柱溫 (采用程序升溫)：25 ℃ (2 min)—30 ℃/min—100 ℃(2 min)；進(jìn)樣口溫度：150 ℃；檢測器溫度：250 ℃；氮?dú)猓?8.2 mL/min；氫氣：40 mL/min；空氣流量為 400 mL/min；分流比：20∶1；柱流速：1.2 mL/min；頂空平衡溫度：80 ℃；平衡時間：30 min。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

取外部干燥的50 mL容量瓶，加入約20 mL去離子水，加瓶塞，精確稱重。分別精確稱取50 mg丙酮和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，每次稱量完畢都輕輕搖勻溶液，蓋好瓶塞進(jìn)行稱重。前后兩次稱重之差為溶液中含丙酮和乙酸乙酯的質(zhì)量。加水至容量瓶的刻度容量線處，蓋好瓶塞，搖勻即配制成丙酮和乙酸乙酯濃度分別為962 μg/mL和1 069 μg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3 樣品的制備

稱取噴涂后的藥物洗脫支架0.10 g，中間剪碎，轉(zhuǎn)移并置于頂空瓶中，用移液槍精密加入2 mL去離子水，用頂空瓶蓋壓緊密封，備用。

1.4 丙酮和乙酸乙酯殘留量的計(jì)算

藥物洗脫支架中丙酮和乙酸乙酯殘留量的計(jì)算方法按照外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計(jì)算。

2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

由于丙酮和乙酸乙酯均具有較低的沸點(diǎn)，色譜柱對兩種溶劑保留差異不大。通過調(diào)節(jié)降低進(jìn)樣口溫度和較低柱溫的程序升溫提高丙酮和乙酸乙酯的分離效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)按照1.1所述的實(shí)驗(yàn)條件丙酮和乙酸乙酯能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離。丙酮和乙酸乙酯之間的分離度大于1.5。

取去離子水2 mL于頂空瓶中，加蓋密封，進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)；取未噴涂藥物涂層的藥物洗脫支架按照1.3制備，加2 mL去離子水，加蓋密封，進(jìn)行陰性對照實(shí)驗(yàn)；取丙酮和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)混合溶液一份，2 mL于頂空瓶中，加蓋密封，進(jìn)行專屬性實(shí)驗(yàn)，按照1.1所述的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測試，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，空白實(shí)驗(yàn)和陰性對照實(shí)驗(yàn)在丙酮和乙酸乙酯色譜峰處均無干擾，丙酮和乙酸乙酯兩種組分分離良好。丙酮保留時間為3.54 min，乙酸乙酯的保留時間為4.46 min。色譜圖如圖1所示。

圖1 丙酮和乙酸乙酯專屬性色譜圖

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按照2.1中的方法丙酮和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)混合溶液濃度制備6份標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取2 mL于頂空瓶中，頂空瓶蓋壓緊密封。按照1.1所述的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，丙酮和乙酸乙酯拖尾因子均小于1，丙酮理論塔板數(shù)大于28 000，乙酸乙酯理論塔板數(shù)大于36 000，丙酮和乙酸乙酯分離度大于10。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 線性范圍

取丙酮和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別制備一系列不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中丙酮和乙酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度均依次為 50、100、200、500、1 000 μg/mL。

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液2 mL于頂空瓶中，加蓋密封。按1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別記錄丙酮和乙酸乙酯的峰面積，按照濃度-峰面積繪制工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，丙酮和乙酸乙酯線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表2所示。

表2 丙酮和乙酸乙酯線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 精密度試驗(yàn)

根據(jù)2.2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別記錄丙酮和乙酸乙酯色譜峰面積，分別計(jì)算丙酮和乙酸乙酯的精密度。丙酮和乙酸乙酯RSD分別為1.50%和1.66%(n=6)。丙酮和乙酸乙酯精密度檢測結(jié)果如表3所示。

表3 丙酮和乙酸乙酯精密度檢測結(jié)果

2.5 檢測限(LOD)與定量限(LOQ)實(shí)驗(yàn)

取2.3項(xiàng)中丙酮與乙酸乙酯濃度為50 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，不斷稀釋，直到丙酮和乙酸乙酯的檢測限(LOD)與定量限(LOQ)試驗(yàn)接受標(biāo)準(zhǔn)分別為：在丙酮和乙酸乙酯的LOD溶液的色譜圖中，主峰與噪音峰信號的強(qiáng)度比約為3 (且應(yīng)不得小于3)；在丙酮和乙酸乙酯的LOQ溶液的色譜圖中，主峰與噪音峰信號的強(qiáng)度比約為10 (且應(yīng)不得小于10)。丙酮與乙酸乙酯檢測限和定量限結(jié)果如表4所示。

表4 丙酮和乙酸乙酯檢測限(LOD)和定量限(LOQ)結(jié)果

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱取已知丙酮和乙酸乙酯殘留量的藥物洗脫支架0.10 g，共9份置于頂空瓶中，分別加入相當(dāng)于藥物洗脫支架上丙酮乙酸乙酯殘留量的80%、100%和120%各3份的丙酮和乙酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水補(bǔ)充至2 mL。按1.1的色譜條件進(jìn)行測定，按照1.4的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算。丙酮80%、100%和120%三個濃度平均回收率分別是：95.64%、96.95% 和 99.35%，RSD=1.97%；乙酸乙酯80%、100%和120%三個濃度平均回收率分別是：93.97%、97.80% 和98.37%，RSD=2.45%。

2.7 樣品測定

取完成噴涂后的藥物洗脫支架樣品，即刻密封于樣品瓶中。按1.3項(xiàng)樣品制備方法進(jìn)行制備3份樣品供試品，按照1.1項(xiàng)的色譜實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測定，按照1.4項(xiàng)的計(jì)算方法計(jì)算丙酮和乙酸乙酯殘留量，結(jié)果顯示丙酮平均殘留量為1 273.5 μg/g，乙酸乙酯平均殘留量為 2 358.1 μg/g。

3 總結(jié)

3.1 方法建立

本文建立了同時檢測藥物洗脫支架中丙酮和乙酸乙酯兩種低沸點(diǎn)、揮發(fā)性溶劑的方法。丙酮和乙酸乙酯均含有不飽和基團(tuán)，在低波長有紫外吸收，但由于分子量小，很難在液相色譜上保留，液相色譜難以檢測?！吨袊幍洹吠▌t溶劑殘留測定法對丙酮和乙酸乙酯有指導(dǎo)方法，應(yīng)該優(yōu)先選擇氣相色譜法。丙酮沸點(diǎn)56.5 ℃，乙酸乙酯沸點(diǎn)77.2 ℃，如果采取氣相直接進(jìn)樣的方法，沸點(diǎn)接近較難分離，且進(jìn)樣溶液的溶劑，難以選擇、易對兩種組分干擾，影響檢測結(jié)果。采取柱溫程序升溫、降低進(jìn)樣口溫度，可以有效增強(qiáng)兩種組分在色譜上的保留，增加分離效果。采取頂空進(jìn)樣法，去離子水作為浸提溶劑，浸提充分，且氫火焰離子化檢測器對水沒有響應(yīng)，有效避免了溶劑對組分的干擾，增加了殘留溶劑檢測的專屬性。

3.2 方法線性范圍

本文中建立丙酮和乙酸乙酯殘留量的檢測方法在很寬的范圍內(nèi)都具有良好的線性。丙酮線性范圍為48.1～962.3 μg/mL，乙酸乙酯線性范圍為53.5～1 069.2 μg/mL，可以保證檢測因?yàn)楣に嚥▌右鹑軇埩袅康淖兓?。?shí)際藥物洗脫支架在經(jīng)過噴涂、預(yù)裝、包裝、滅菌和解析等生產(chǎn)過程中，丙酮和乙酸乙酯檢測濃度很少達(dá)到500 μg/mL。后續(xù)應(yīng)對方法線性范圍進(jìn)行優(yōu)化，縮小殘留溶劑方法線性范圍，增加殘留溶劑檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性。

3.3 樣品檢測

本文中樣品檢測為藥物洗脫支架完成噴涂藥物涂層工藝后，即刻將樣品密封于樣品瓶中。檢測結(jié)果顯示丙酮?dú)埩袅繛?1 273.5 μg/g，乙酸乙酯為 2 358.1 μg/g。該產(chǎn)品成品技術(shù)要求規(guī)定的丙酮要求為500 μg/g，乙酸乙酯為5 000 μg/g。即藥物涂層即刻噴涂完成后丙酮?dú)埩袅坎环弦?，而乙酸乙酯符合要求。?shí)際該產(chǎn)品在藥物涂層噴涂工藝驗(yàn)證過程中，噴涂后的支架放置一定時間后進(jìn)行檢測，丙酮和乙酸乙酯殘留量合格后完成噴涂驗(yàn)證工藝工作。后續(xù)的研究中應(yīng)建立該產(chǎn)品丙酮和乙酸乙酯殘留量釋放曲線，根據(jù)驗(yàn)證釋放曲線，確定丙酮和乙酸乙酯殘留量合格的釋放天數(shù)，減少噴涂后的檢驗(yàn)工作，確定優(yōu)化該產(chǎn)品的噴涂工藝驗(yàn)證方案。

4 結(jié)語

目前藥物洗脫支架在冠心病PTCA手術(shù)治療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，臨床上有建立支架中殘留溶劑分析方法，對丙酮和乙酸乙酯含量進(jìn)行檢測的要求[4]。本文中建立并考察了生物支架中殘留溶劑分析方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物洗脫支架丙酮和乙酸乙酯殘留量測定方法的準(zhǔn)確性高、可靠性好且具有較好的重復(fù)性，其系統(tǒng)適應(yīng)性、專屬性、LOQ、LOD、線性、精密度和準(zhǔn)確度等實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定要求。故研究認(rèn)為，本方法可作為藥物洗脫支架的丙酮和乙酸乙酯殘留量的一項(xiàng)準(zhǔn)確、可靠的檢測方法。同時，研究中也發(fā)現(xiàn)一些不足之處，包括噴涂溶劑發(fā)生改變時需再驗(yàn)證，殘留溶劑的釋放曲線需要進(jìn)一步驗(yàn)證，以及方法線性范圍需要優(yōu)化。在后續(xù)研究中，仍需藥物洗脫支架中殘留溶劑的分析方法進(jìn)行進(jìn)一步的研究。