伍雪梅，楊 新，原亞杰，尹艷玲，賴 鵬，宋軍科，史懷平，趙光輝,3*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100； 3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

隱孢子蟲(spp.)是一類重要的人獸共患寄生原蟲，主要寄生于人和多種動(dòng)物的消化道，引起以腹瀉為主要癥狀的隱孢子蟲病，嚴(yán)重威脅著人和動(dòng)物的健康。目前，已報(bào)道了47個(gè)隱孢子蟲有效種和100多個(gè)基因型，宿主范圍包括人和260余種動(dòng)物。隱孢子蟲主要通過(guò)直接接觸、食源性和水源性途徑傳播，使得其在人、動(dòng)物以及自然環(huán)境中廣泛存在。隱孢子蟲感染對(duì)宿主造成的危害與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，免疫功能正常的宿主感染隱孢子蟲?？梢鸺毙宰韵扌愿篂a，而免疫功能缺陷的宿主(如艾滋病患者和器官移植患者)或免疫功能低下的幼齡兒童和新生動(dòng)物感染隱孢子蟲會(huì)出現(xiàn)持續(xù)性水樣腹瀉，引起宿主嚴(yán)重脫水甚至危及生命。針對(duì)隱孢子蟲病的治療，目前,僅硝唑尼特獲得了美國(guó)食品和藥物安全局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)的批準(zhǔn)，但該藥物對(duì)于免疫力低下和幼年易感宿主療效甚微。鑒于隱孢子蟲病的發(fā)生和發(fā)展與宿主的免疫狀況密切相關(guān)，弄清宿主抗隱孢子蟲感染的免疫防御機(jī)制可為發(fā)掘新的防控隱孢子蟲病藥物靶標(biāo)和疫苗候選分子提供理論指導(dǎo)。

固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答在宿主早期防御和后期清除隱孢子蟲的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在急性感染初期，固有免疫系統(tǒng)中的腸道上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞)、細(xì)胞因子(如γ-干擾素和白細(xì)胞介素-18)、趨化因子(如CXCL8和CXCL10)及補(bǔ)體(如MBL和C3b)參與了宿主早期防御和抵抗隱孢子蟲的入侵過(guò)程。被激活的固有免疫組分還會(huì)觸發(fā)并調(diào)節(jié)宿主獲得性免疫應(yīng)答。獲得性免疫應(yīng)答是宿主防御和清除隱孢子蟲的關(guān)鍵，特別是以CD4T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中，Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞亞群及其產(chǎn)生的IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β等細(xì)胞因子在隱孢子蟲感染的早期防御、后期清除、炎癥反應(yīng)和腸道損傷后修復(fù)中發(fā)揮作用，共同參與宿主的抗隱孢子蟲感染。但是截至目前，隱孢子蟲感染過(guò)程中CD4T細(xì)胞的調(diào)控、分化和應(yīng)答機(jī)制尚未完全闡明。作為固有免疫應(yīng)答的重要組成部分，補(bǔ)體分子可以通過(guò)3條激活途徑(經(jīng)典途徑、替代途徑及凝集素途徑)在感染局部發(fā)揮溶解病原、調(diào)理吞噬、介導(dǎo)炎癥、免疫黏附及細(xì)胞毒等作用。此外，局部激活的補(bǔ)體成分(如C3b、補(bǔ)體受體CD21/35和C5aR)還可以參與調(diào)節(jié)炎癥和獲得性免疫應(yīng)答，特別是以CD4T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，在一定程度上充當(dāng)了固有免疫和獲得性免疫的樞紐。補(bǔ)體系統(tǒng)激活后，補(bǔ)體C5發(fā)生有限的蛋白水解，釋放過(guò)敏毒素C5a。C5a可通過(guò)與抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)或/和CD4T細(xì)胞上對(duì)應(yīng)的G-蛋白偶聯(lián)受體C5aR結(jié)合，影響抗原的攝取以及共刺激分子、細(xì)胞因子、趨化因子等的表達(dá)，直接或間接地參與T細(xì)胞的激活、增殖、分化和效應(yīng)過(guò)程。例如，在牛分枝桿菌()感染小鼠模型中，被感染小鼠分泌的C5a可與樹突狀細(xì)胞C5aR結(jié)合，通過(guò)影響IL-12 p70的分泌來(lái)參與Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過(guò)對(duì)過(guò)敏性哮喘的研究發(fā)現(xiàn)，C5aR缺陷小鼠會(huì)出現(xiàn)BMDC過(guò)敏原的攝取受損，以及Th2和Th17細(xì)胞分化相關(guān)分子(如CD11b、IL-17A)的表達(dá)減少，表明C5aR可通過(guò)抑制CD4T細(xì)胞向Th2和Th17細(xì)胞分化來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。此外，研究發(fā)現(xiàn)C5a在病毒(如流感病毒和登革熱病毒)、細(xì)菌(如李斯特菌)及寄生蟲(如瘧原蟲和克氏錐蟲)感染中發(fā)揮了一定的T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用。

隱孢子蟲感染會(huì)激活宿主補(bǔ)體系統(tǒng)，進(jìn)而引起C5a/C5aR的上調(diào)表達(dá)，并且宿主主要依靠以CD4T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答來(lái)抵御隱孢子蟲感染，而補(bǔ)體C5a/C5aR信號(hào)可以直接或間接調(diào)控CD4T細(xì)胞免疫反應(yīng)，但目前對(duì)于C5a/C5aR信號(hào)在隱孢子蟲感染過(guò)程中對(duì)CD4T細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)控作用還不清楚。本研究以人獸共患為研究對(duì)象，在建立BALB/c乳鼠和C5aR抑制BALB/c乳鼠感染模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)感染前后乳鼠回腸組織中C5aR的表達(dá)變化，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)隱孢子蟲70基因和CD4T細(xì)胞亞群Th1、Th2、Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞主效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β的轉(zhuǎn)錄變化，通過(guò)病理組織切片觀察乳鼠回腸黏膜的損傷情況，進(jìn)而明確C5a/C5aR信號(hào)對(duì)隱孢子蟲致病性的影響，以及C5a/C5aR信號(hào)對(duì)隱孢子蟲感染中宿主CD4T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 蟲株

IIdA19G1亞型蟲株為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)張龍現(xiàn)教授惠贈(zèng)，經(jīng)亞型鑒定后由本實(shí)驗(yàn)室保存，并在犢牛體內(nèi)進(jìn)行傳代。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)入100只性成熟(7周齡左右)的BALB/c小鼠，飼養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼喂SPF級(jí)的小鼠飼料，自由飲用無(wú)菌水，待其自由交配產(chǎn)出新生小鼠后，取5 d新生乳鼠進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。

1.3 主要試劑

甲醛溶液(光華科技，中國(guó))，二甲苯、氯仿和異丙醇(致遠(yuǎn)化學(xué)，中國(guó))，甲醇(華天生物，中國(guó))，伊紅、蘇木素、吐溫20和DAB顯色試劑盒(索萊寶科技，中國(guó))，TRIzol裂解液和DEPC(康為試劑，中國(guó))， PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)，SP-0023 HistostainTM-Plus Kits (博奧森生物，中國(guó))，C5aR兔多克隆抗體(三鷹生物，中國(guó))，PMX 205(MedChemExpress，美國(guó))。

1.4 微小隱孢子蟲感染BALB/c乳鼠模型的建立

1.4.1 動(dòng)物感染試驗(yàn) 將乳鼠禁食12 h，感染組乳鼠經(jīng)口接種1×10個(gè)卵囊，對(duì)照組乳鼠經(jīng)口灌服相同體積的PBS，并將感染組和對(duì)照組乳鼠分區(qū)飼養(yǎng)，防止交叉感染。

1.4.2 組織樣品的采集和處理 感染后(post infection，pi)6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、15 d、20 d、25 d和30 d分別隨機(jī)選取感染組和對(duì)照組乳鼠各3只，在無(wú)菌條件下使用脫頸椎法處死乳鼠，分離回腸段。用PBS清洗兩次后放進(jìn)無(wú)菌研缽，倒入少量液氮速凍后用研磨棒研碎組織，轉(zhuǎn)移至1.5 mL滅菌無(wú)RNA酶離心管中，加入800 μL TRIzol，劇烈震蕩混勻后保存于-80 ℃用于提取總RNA。此外，收集感染高峰(7 dpi) 的回腸組織，用預(yù)冷的PBS洗去殘留血跡后，置于4%多聚甲醛溶液中固定后用于組織病理學(xué)觀察；同時(shí)收集7 dpi大腸內(nèi)容物置于1.5 mL離心管中，保存于4 ℃用于后續(xù)的改良抗酸染色。

1.4.3 組織樣品總RNA的提取和cDNA的合成 取出保存于TRIzol裂解液中的乳鼠回腸樣品，置于冰盒中自然融化10 min；加入160 μL氯仿，渦旋震蕩15 s，室溫靜置3 min；4 ℃，13 200 r·min離心15 min，吸取上清；加入等體積的異丙醇，混勻后，室溫靜置30 min；4 ℃，13 200 r·min離心15 min，棄上清；加入1 mL無(wú)水乙醇，4 ℃，13 200 r·min離心7 min； 棄上清，重復(fù)操作兩次；室溫開蓋晾干沉淀，加入適量DEPC水溶解，靜置5 min；吸取適量RNA樣品，并使用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè)，剩余樣品保存于-80 ℃?zhèn)溆?。參照PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說(shuō)明書步驟合成樣品cDNA，合成的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 熒光定量PCR檢測(cè)隱孢子蟲70的轉(zhuǎn)錄情況 本試驗(yàn)采用Garcés等建立的基于隱孢子蟲熱休克蛋白70(70ku heat shock proteins，HSP70)基因的熒光定量PCR方法對(duì)乳鼠回腸組織中的微小隱孢子蟲感染情況進(jìn)行定量分析，以鼠特異性甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL 2× UltraSYBR Mixture、1 μL Primer mix、5 μL cDNA模板和4 μL RNase-free ddHO。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，40個(gè) 循環(huán)。隱孢子蟲70 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量用2-ΔΔ表示。

表1 Real-time PCR擴(kuò)增引物

1.4.5 組織病理學(xué)觀察 將回腸樣品置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后依次進(jìn)行組織修塊、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋和切片。將制作好的石蠟切片經(jīng)蘇木素和伊紅染色后封片，待切片干燥后，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。每張切片選取5根最長(zhǎng)的完整腸絨毛，分別測(cè)量絨毛長(zhǎng)度、絨毛直徑、隱窩深度和腸黏膜厚度。

1.4.6 隱孢子蟲改良抗酸染色 將保存于1.5 mL 無(wú)菌離心管中的大腸內(nèi)容物用研磨棒碾碎；加入1 mL PBS，3 000 r·min離心10 min，棄上清，重復(fù)操作兩次；留殘液約200 μL，加PBS至1.5 mL，充分渦旋，靜置至離心管中大顆粒物沉降至管底；在沉淀上方略微渾濁處吸取20 μL液體,涂抹成“2 cm×2 cm” 的涂片；待涂片室溫風(fēng)干后，滴加甲醇固定5 min， 隨后滴加石炭酸復(fù)紅染色液染色10 min， 水洗去浮色；滴加1%鹽酸酒精脫色液，脫色至淡粉色，水洗；滴加10倍稀釋的2%的孔雀綠染液，染色30 s，水洗；涂片經(jīng)室溫風(fēng)干后置于400倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 乳鼠回腸組織中C5aR的表達(dá)水平分析

1.5.1 C5aR的mRNA表達(dá)水平分析 在感染后1、2、3、4、5、6、7、9、10、15和30 d分別采集感染組和對(duì)照組乳鼠回腸組織樣本各3份，回腸組織的采集和處理，組織樣品總RNA提取，cDNA合成和熒光定量的反應(yīng)體系及數(shù)據(jù)處理詳見(jiàn)“1.4.2～1.4.4”。引物序列見(jiàn)表1，引物由生工生物公司合成。

1.5.2 C5aR的蛋白表達(dá)水平分析 采集5 dpi乳鼠回腸組織制作石蠟切片，以C5aR兔多克隆抗體(抗體稀釋度1∶200)作為一抗，參照SP-0023 HistostainTM-Plus Kits免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，使用Image-Pro Plus對(duì)C5aR陽(yáng)性細(xì)胞在乳鼠回腸組織的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估，計(jì)算其平均光密度值(平均光密度值=累計(jì)光密度值/細(xì)胞分布的區(qū)域面積)。

1.6 微小隱孢子蟲感染C5aR抑制乳鼠模型的建立

對(duì)于C5aR抑制組的5日齡BALB/c乳鼠，在接種卵囊前6 h，根據(jù)體重經(jīng)口灌喂3 mg·kg的C5aR抑制劑(即PMX 205)，隨后經(jīng)口接種1×10個(gè)卵囊，并每隔3 d再依體重補(bǔ)灌PMX 205以建立感染C5aR抑制乳鼠模型。感染后1、2、3、4、5、6、7、9、10、15和30 d，從C5aR抑制組(C5aRa)中隨機(jī)抽取3只乳鼠，無(wú)菌分離回腸組織。組織樣品的采集和處理、組織樣品總RNA提取和cDNA合成方法詳見(jiàn)“1.4.2～1.4.3”。參照“1.4.4”詳述的操作步驟檢測(cè)C5aR抑制組各時(shí)間點(diǎn)乳鼠回腸組織中隱孢子蟲70的轉(zhuǎn)錄情況。同時(shí)采集C5aR抑制組5 dpi的回腸組織，參照“1.4.5”操作進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.7 熒光定量PCR測(cè)定CD4+ T細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量

選取對(duì)照組、感染組、C5aR抑制組1、2、3、4、5、6、7 dpi回腸組織cDNA樣品，以鼠特異性作為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR檢測(cè)Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞主效應(yīng)細(xì)胞因子基因-γ、-4、-17和-β的轉(zhuǎn)錄情況。引物序列和退火溫度見(jiàn)表1，引物均由生工生物公司合成。反應(yīng)體系和操作均參照“1.4.4”所述。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件，采用Student’s檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。當(dāng)>0.05時(shí)，差異不顯著；當(dāng)0.01<<0.05時(shí)，差異顯著；當(dāng)<0.01時(shí)，差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 C. parvum感染BALB/c乳鼠模型的建立

利用基于隱孢子蟲70基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行感染情況的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在6 hpi即可檢測(cè)到70基因的轉(zhuǎn)錄，持續(xù)到25 dpi，感染高峰出現(xiàn)在7 dpi(圖1A)。采集7 dpi的感染組乳鼠大腸內(nèi)容物進(jìn)行改良抗酸染色，發(fā)現(xiàn)大量玫瑰紅色或暗紅色卵囊(圖1B)。通過(guò)對(duì)7 dpi的感染組和對(duì)照組乳鼠回腸組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，感染組的乳鼠回腸組織中出現(xiàn)隱孢子蟲寄生和中性粒細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C)，并伴隨著回腸絨毛脫落、萎縮和斷裂，回腸末端黏膜結(jié)構(gòu)完整性被破壞、上皮細(xì)胞損傷和細(xì)胞間隙變寬(圖1D)。

A. C. parvum感染乳鼠回腸組織中微小隱孢子蟲HSP70相對(duì)轉(zhuǎn)錄量分析；B. C. parvum感染乳鼠(7 dpi)大腸內(nèi)容物抗酸染色結(jié)果(400×)，箭頭所指為微小隱孢子蟲卵囊；C. C. parvum感染乳鼠(7 dpi)回腸組織HE染色結(jié)果(400×)，a，c. 對(duì)照組乳鼠，b，d. 感染組乳鼠，感染組回腸紋狀緣有微小隱孢子蟲(箭頭處)，固有層有淋巴細(xì)胞(星形)和中性粒細(xì)胞(三角形)浸潤(rùn)；D. C. parvum感染乳鼠(7 dpi)回腸組織病理變化的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。*.P<0.05，**.P<0.01A. Analysis of relative transcription levels of C. parvum HSP70 in ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum; B. Acid-fast staining results for contents in large intestines of suckling mice (7 dpi) infected with C. parvum (400×), with the arrow indicating C. parvum oocyst; C. HE staining results of ileum tissues of suckling mice (7 dpi) infected with C. parvum (400×), a, c. Suckling mice in control group, b, d. Suckling mice in infected group, C.parvum (arrow) in the striated border of ileum in infected group, and lymphocyte (star) and neutrophils (triangle) infiltration in lamina propria; D. Statistical analysis of pathological lesions in ileum tissues of suckling mice (7 dpi) infected with C. parvum; *. P<0.05，**. P<0.01圖1 微小隱孢子蟲感染BALB/c乳鼠模型的建立Fig.1 Establishment of a BALB/c suckling mouse model infected with C. parvum

2.2 C. parvum感染乳鼠回腸組織中C5aR的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，感染引起乳鼠回腸組織中C5aR轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化，感染組C5aR的 mRNA水平在4、5、7、15和30 dpi均顯著高于對(duì)照組(<0.05)，并在5 dpi達(dá)到峰值(圖2)。同時(shí)，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)5 dpi乳鼠回腸組織C5aR的蛋白水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)C5aR主要分布于腸上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面(圖3A)，并且感染組C5aR的蛋白水平也顯著高于對(duì)照組(<0.01)(圖3B)。

*.P<0.05; **P<0.01圖2 C. parvum感染乳鼠回腸組織中C5aR的 mRNA轉(zhuǎn)錄分析Fig.2 Analysis of the mRNA expression of C5aR in the ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum

A. 乳鼠回腸組織C5aR的免疫組化染色結(jié)果(5 dpi)，a和e. 陰性對(duì)照組(對(duì)照組)，b和f. 試驗(yàn)組(對(duì)照組)，c和g. 陰性對(duì)照組(感染組)，d和h. 試驗(yàn)組(感染組)；B. 乳鼠回腸組織在400倍鏡下5個(gè)隨機(jī)視野中C5aR平均陽(yáng)性強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(5 dpi),*.P<0.05，**.P<0.01A. Immunohistochemical staining results for C5aR in ileum tissues of sucking mice (5 dpi), a and e. Negative control group (control group), b and f. Experimental group (control group), c and g. Negative control group (infected group), d and h: Experimental group (infected group); B. Statistical analysis of C5aR average positive expression intensity in ileum tissues of suckling mice in five random fields under 400 times microscope (5 dpi), *. P<0.05, **. P<0.01圖3 C. parvum感染乳鼠回腸組織中C5aR的表達(dá)分析Fig.3 Analysis of C5aR expression in ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum

2.3 C5a/C5aR信號(hào)對(duì)C. parvum感染乳鼠回腸組織中CD4+ T細(xì)胞亞群細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用

2.3.1 C5a/C5aR信號(hào)對(duì)Th1細(xì)胞主效應(yīng)因子-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 熒光定量PCR結(jié)果顯示，感染組乳鼠回腸組織Th1細(xì)胞主效應(yīng)分子-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平在多數(shù)時(shí)間點(diǎn)(2、4、5、6和7 dpi)顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)，并在6 dpi達(dá)到高峰(圖3A)。與感染組乳鼠相比，C5aR抑制組乳鼠回腸組織中-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平在2、4、6 dpi出現(xiàn)顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)(圖4A)。

A. C. parvum感染乳鼠回腸組織中IFN-γ轉(zhuǎn)錄量的變化情況；B. C. parvum感染乳鼠回腸組織中IL-4轉(zhuǎn)錄量的變化情況；C. C. parvum感染乳鼠回腸組織中IL-17轉(zhuǎn)錄量的變化情況；D. C. parvum感染乳鼠回腸組織中TGF-β轉(zhuǎn)錄量的變化情況。柱上的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)A. Changes in the transcription of IFN-γ in the ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum; B. Changes in the transcription of IL-4 expression in the ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum; C. Changes in the transcription of IL-17 expression in the ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum; D. Changes in the transcription of TGF-β expression in the ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum. Different lowercase letters above the bars indicated significant differences (P<0.05)圖4 C5a/C5aR信號(hào)對(duì)C. parvum感染乳鼠CD4+ T細(xì)胞亞群相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用Fig.4 Regulatory effect of C5a/C5aR signaling on cytokines related to CD4+ T cell subsets in suckling mice infected with C. parvum

2.3.2 C5a/C5aR信號(hào)對(duì)Th2細(xì)胞主效應(yīng)因子-4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 熒光定量PCR結(jié)果表明，感染組乳鼠回腸組織中Th2細(xì)胞主效應(yīng)因子-4的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，在2、3 dpi顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄，但在4、7 dpi又顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)(圖4B)；C5aR抑制組乳鼠回腸組織中-4轉(zhuǎn)錄量相較于感染組在2、4和6 dpi顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)。

2.3.3 C5a/C5aR信號(hào)對(duì)Th17細(xì)胞主效應(yīng)因子-17 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 乳鼠回腸組織中Th17細(xì)胞主效應(yīng)因子-17的熒光定量PCR結(jié)果顯示，感染組-17 mRNA轉(zhuǎn)錄量?jī)H在3 dpi顯著高于對(duì)照組(<0.05)，而在5、6 dpi顯著低于對(duì)照組轉(zhuǎn)錄水平(<0.05)(圖4C)；而C5aR抑制組乳鼠回腸組織中-17 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平在2、3、4和5 dpi顯著高于感染組(<0.05)(圖4C)。

2.3.4 C5a/C5aR信號(hào)對(duì)Treg細(xì)胞主效應(yīng)因子-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 利用熒光定量PCR測(cè)定感染乳鼠回腸組織中Treg細(xì)胞主效應(yīng)因子-β mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，-β在多數(shù)時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、5、6和7 dpi)顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)(圖4D)，而有趣的是，C5aR抑制組乳鼠回腸組織中-β在4、6和7 dpi也顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)， 僅在1、3 dpi相較于感染組轉(zhuǎn)錄量顯著上調(diào)(<0.05)(圖4D)。

2.4 C5a/C5aR信號(hào)對(duì)C. parvum在乳鼠回腸組織中增殖的影響

利用基于隱孢子蟲70基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)C5aR抑制組乳鼠回腸組織中的微小隱孢子蟲感染情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與單純感染組相比，C5aR抑制組乳鼠回腸組織中隱孢子蟲70的 mRNA轉(zhuǎn)錄量?jī)H在2、3、4和5 dpi顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄，且在3 dpi達(dá)到高峰值，而在其余多數(shù)時(shí)間點(diǎn)(1、6、7、9、10、15和30 dpi)均顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(圖5)。此外，通過(guò)采集對(duì)照組、感染組和C5aR抑制組的乳鼠回腸組織(5 dpi)進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)感染組和C5aR抑制組乳鼠回腸絨毛刷狀緣有隱孢子蟲寄生(圖6A)；同感染組相比，C5aR抑制組回腸絨毛長(zhǎng)度顯著縮短、萎縮(<0.01)，絨毛變細(xì)(<0.05)且黏膜厚度明顯變薄(<0.05)，但絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度比值差異不顯著(>0.05)(圖6B)。

*.P<0.05; **.P<0.01圖5 C. parvum感染C5aR抑制乳鼠回腸組織中HSP70轉(zhuǎn)錄分析Fig.5 Analysis of HSP70 expression level in ileum tissues of suckling mice treated with C5aR inhibitor during C. parvum infection

A. C. parvum感染乳鼠(5 dpi)回腸組織HE染色結(jié)果(400×)；B. C. parvum感染乳鼠(5 dpi)回腸組織病理變化的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。*.P<0.05，**.P<0.01，ns.P>0.05；箭頭指示的為微小隱孢子蟲卵囊A HE staining results of ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum at 5 dpi (400×); B. Statistical analysis of changes in ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum at 5 dpi. *. P<0.05, **. P<0.01, ns. P>0.05; the arrow indicates C. parvum oocyst圖6 C5a/C5aR信號(hào)對(duì)C. parvum在乳鼠回腸組織中增殖的影響Fig.6 Effect of C5a / C5aR signal on the proliferation of C. parvum in the ileum tissues of infected suckling mice

3 討 論

隱孢子蟲病是由隱孢子蟲感染引起的一種人獸共患原蟲病，嚴(yán)重威脅著人類的健康和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。然而，目前尚缺少有效防控隱孢子蟲病的藥物和疫苗，主要是由于對(duì)隱孢子蟲致病機(jī)制和宿主免疫防御機(jī)制的認(rèn)識(shí)有限。為了更有效地闡明蟲體與宿主的互作機(jī)制，人們構(gòu)建了多種感染動(dòng)物模型，包括多品系的小鼠、犢牛、仔豬和羔羊等，其中最常用的動(dòng)物模型是新生犢牛模型和小鼠模型。近年來(lái)，已有多種感染小鼠模型(如地塞米松免疫抑制的SCID小鼠、BALB/c小鼠和KM小鼠模型以及T和B細(xì)胞免疫缺陷的SCID小鼠)被成功構(gòu)建并廣泛應(yīng)用于隱孢子蟲病的免疫學(xué)研究和抗微小隱孢子蟲的藥物篩選。本研究針對(duì)幼年動(dòng)物對(duì)的高度易感性，構(gòu)建了一種感染BALB/c乳鼠模型，模型研究結(jié)果表明,在6 hpi即可在BALB/c乳鼠的回腸組織中檢測(cè)到隱孢子蟲70基因的表達(dá)，一直持續(xù)到25 dpi，感染高峰出現(xiàn)在7 dpi，感染可以引起乳鼠的腸道病理?yè)p傷和炎癥反應(yīng)。與其他隱孢子蟲感染模型相比，本研究建立的BALB/c乳鼠模型在感染過(guò)程中不需要使用地塞米松進(jìn)行免疫抑制，可以模擬幼年動(dòng)物的自然感染過(guò)程，通過(guò)對(duì)感染結(jié)果的定性定量監(jiān)測(cè)，可以更加真實(shí)地反映出感染對(duì)幼年動(dòng)物的影響，為深入研究蟲體與宿主的互作機(jī)制提供了候選模型。

研究表明，固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答在宿主抵御和清除隱孢子蟲的感染中發(fā)揮重要作用，尤其是以CD4T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答。感染可以通過(guò)經(jīng)典途徑和凝集素途徑來(lái)激活宿主的補(bǔ)體系統(tǒng)。當(dāng)補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后，一方面，補(bǔ)體可以作為固有免疫系統(tǒng)的重要成分來(lái)發(fā)揮免疫效應(yīng)；另一方面，補(bǔ)體激活后通過(guò)有限的蛋白水解釋放過(guò)敏毒素C5a，C5a通過(guò)結(jié)合固有免疫細(xì)胞或/和獲得性免疫細(xì)胞上的特異性受體C5aR來(lái)調(diào)節(jié)宿主的炎癥反應(yīng)和獲得性免疫應(yīng)答，進(jìn)而參與抗感染免疫反應(yīng)。通過(guò)對(duì)感染BALB/c乳鼠模型的進(jìn)一步研究，作者發(fā)現(xiàn)感染可以引起B(yǎng)ALB/c乳鼠回腸組織中C5aR表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)改變，并且在大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，這與之前報(bào)道的感染可以引起小鼠脾和小腸淋巴組織中C5aR表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化相符，提示C5a/C5aR信號(hào)可能參與了宿主與隱孢子蟲的相互作用過(guò)程。

過(guò)敏毒素C5a可與C5aR結(jié)合啟動(dòng)C5a/C5aR信號(hào)，進(jìn)而誘導(dǎo)CD4T細(xì)胞亞群的分化和效應(yīng)，對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),隱孢子蟲感染引起宿主CD4T細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β等細(xì)胞因子，共同參與宿主抗隱孢子蟲感染過(guò)程。本研究以感染的BALB/c乳鼠為研究對(duì)象，分析了感染對(duì)CD4T細(xì)胞亞群分化的影響，發(fā)現(xiàn)感染主要引起乳鼠回腸組織中Th1細(xì)胞主效應(yīng)因子-γ的顯著上調(diào)表達(dá)，表明隱孢子蟲感染乳鼠主要誘導(dǎo)了Th1型免疫效應(yīng)，而之前的研究表明-γ敲除的C57BL/6小鼠表現(xiàn)出對(duì)更易感，這提示感染可以誘導(dǎo)Th1細(xì)胞亞群分化，進(jìn)而在宿主抗隱孢子蟲感染中發(fā)揮作用。在使用PMX 205抑制C5aR后，感染乳鼠回腸組織中Th1細(xì)胞主效應(yīng)因子-γ和隱孢子蟲70均先顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄(1～5 dpi)后顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(6～7 dpi)，提示C5a/C5aR信號(hào)在感染乳鼠過(guò)程中可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞主效應(yīng)因子IFN-γ的產(chǎn)生來(lái)影響在乳鼠回腸中的增殖，這種調(diào)節(jié)作用與C5a/C5aR信號(hào)通路在腦瘧疾和弓形蟲感染小鼠模型中引起的Th1細(xì)胞主效應(yīng)因子IFN-γ的上調(diào)作用一致。感染可以刺激宿主Th2細(xì)胞亞群分泌IL-4，IL-4在后期清除隱孢子蟲中有重要作用，但在本研究中感染乳鼠及C5aR抑制乳鼠回腸組織-4 mRNA水平均呈動(dòng)態(tài)變化，無(wú)明顯變化趨勢(shì)，表明C5a/C5R信號(hào)在微小隱孢子蟲感染乳鼠中對(duì)Th2細(xì)胞主效應(yīng)因子IL-4的調(diào)節(jié)作用并不明顯。此外，研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞效應(yīng)因子-17和Treg細(xì)胞效應(yīng)因子-β在感染中除具有炎癥調(diào)節(jié)和抗感染作用外，還可減輕對(duì)宿主腸上皮細(xì)胞的損傷。通過(guò)口服C5aR抑制劑的方式對(duì)BALB/c乳鼠的C5aR進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)抑制C5aR可引起感染乳鼠早期(1～5 dpi)回腸組織中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞主效應(yīng)細(xì)胞因子-17和-β在多數(shù)時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)表達(dá)，同時(shí)，抑制C5aR還可顯著改善感染引起的乳鼠回腸組織的絨毛直徑和黏膜厚度變化，提示C5a/C5aR信號(hào)可能通過(guò)上調(diào)IL-17和TGF-β的產(chǎn)生以改善隱孢子蟲感染引起的腸道損傷，降低隱孢子蟲感染引起的腸道屏障破壞。綜上，C5a/C5aR信號(hào)可能通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)CD4T細(xì)胞亞群主效應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)參與宿主與隱孢子蟲相互作用的過(guò)程，但對(duì)其具體的調(diào)控機(jī)制以及C5a/C5aR信號(hào)在隱孢子蟲與宿主互作中發(fā)揮的作用還需要進(jìn)一步的深入探討。

4 結(jié) 論

在建立了一種感染BALB/c乳鼠模型的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)感染可以引起B(yǎng)ALB/c乳鼠回腸組織中C5aR的上調(diào)表達(dá)，并且主要誘發(fā)宿主Th1型免疫效應(yīng)。進(jìn)一步的研究表明，C5a/C5aR信號(hào)可能通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)CD4T細(xì)胞亞群主效應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)參與宿主與隱孢子蟲相互作用的過(guò)程。